Ανοσοϊστοχημεία –Ανοσοφθορισμός Ηλέκτρα Στυλιανοπούλου, Μοριακή Βιολόγος-‐Γενετίστρια Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας Ανάπτυξης και Μοριακής Νευροβιολογίας, Τμήμα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής, Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης Τα τελευταία 30 χρόνια παρατηρείται ραγδαία εξέλιξη τόσο στον αριθμό όσο και στις δυνατότητες των διαθέσιμων μεθόδων των Βιοεπιστημών. Η ανοσοϊστοχημεία (immunohistochemistry) αποτελεί μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται στην έρευνα και στη διάγνωση. Συνδυάζει τη βιοχημεία με την ανοσολογία και την ιστολογία. Χαρακτηρίζεται από μεγάλου βαθμού ακρίβεια και ειδικότητα και επιτρέπει την ανίχνευση ποικιλίας αντιγόνων στους ιστούς. Η μέθοδος βασίζεται στην χρήση ειδικών αντισωμάτων με τα οποία, μέσω της απόλυτα ειδικής αλληλεπίδρασης αντιγόνου-‐ αντισώματος, καθίσταται δυνατός ο εντοπισμός του αντιγόνου τόσο σε κυτταρικό όσο και σε υποκυτταρικό επίπεδο. Ουσιαστικά με τον όρο ανοσοϊστοχημεία εννοούμε μια σειρά από τεχνικές που βασίζονται στην ικανότητα των αντισωμάτων να συνδέονται ειδικά με το αντιγόνο. Η αρχική μέθοδος ανοσοϊστοχημείας επινοήθηκε από τον Α. Coons (Εικόνα 1) και τους συνεργάτες του (Coons & Kaplan 1950, Coons et al 1955), οι οποίοι κατάφεραν να σημάνουν αντισώματα με μια φθορίζουσα χρωστική γεγονός που επέτρεπε την ανίχνευση του αντιγόνου σε τομές ιστών. Η μέθοδος του Coons και των συνεργατών του, αποτέλεσε μια δημοφιλή τεχνική αρχικά στην έρευνα, αργότερα στη διαγνωστική, και για αρκετά χρόνια υπήρξε η μοναδική μέθοδος ταυτοποίησης αντιγόνων στους ιστούς. Την ανάπτυξη της μεθόδου ακολούθησε ραγδαία εξέλιξη στις τεχνικές της παραγωγής, της απομόνωσης, του χαρακτηρισμού της ειδικότητας, ενώ οι δυνατότητες σήμανσης του αντισώματος διευρύνθηκαν με την ανακάλυψη νέων φθοριζόντων μορίων της σήμανσης των αντισωμάτων αλλά και των μεθόδων ανίχνευσης του συμπλέγματος αντιγόνου-‐αντισώματος. Ωστόσο η μικρή διάρκεια διατήρησης του φθορισμού στα δείγματα οδήγησε στην ανάπτυξη παραλλαγών στις οποίες η Εικόνα 1. Albert Coons ανίχνευση δεν βασίζονταν στη χρήση φθοριζόντων μορίων. Έτσι αναπτύχθηκαν οι τεχνικές σύνδεσης, ομάδων, ενζύμων ή ενζυμικών συστημάτων πάνω στα αντισώματα. Στην ομάδα ενζύμων που χρησιμοποιήθηκαν για αυτό το σκοπό περιλαμβάνονται η υπεροξειδάση (Nakane and Pierce 1966), η αλκαλική φωσφατάση (Mason & Sammons 1978), η οξειδάση της γλυκόζης (Suffin et al 1979), και η β-‐D-‐γαλακτοσιδάση (Bondi et al 1982). Η μέθοδος της ανοσοοϊστοχημείας χρησιμοποιείται ευρέως τόσο στη διάγνωση μη φυσιολογικών κυττάρων όπως αυτά που εντοπίζονται σε καρκινικούς όγκους όσο και στη βασική έρευνα για τον χαρακτηρισμό του χωροχρονικού προτύπου έκφρασης μιας πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης ενός οργανισμού όπως επίσης και στην ανάλυση της κατανομής ή/και του εντοπισμού διαφορετικών πρωτεΐνών σε διαφορετικές περιοχές ενός ιστού. Η ανοσοϊστοχημεία συγκεντρώνει πολλά πλεονεκτήματα. Είναι ταχεία, έχει πολύ ικανοποιητική ευαισθησία, ειδικότητα, επαναληψιμότητα και δυνατότητα συσχέτισης του εντοπισμού με μορφολογικές παραμέτρους. Υπάρχουν πολλά πρωτόκολλα ανοσοϊστοχημείας συμβατά με όλα σχεδόν τα μονιμοποιητικά υλικά που χρησιμοποιούνται σήμερα. Επιπλέον η μέθοδος χρησιμοποιείται επιτυχώς και σε δείγματα που έχουν υποστεί αυτόλυση ή ακόμα και νέκρωση ενώ τέλος, σε περίπτωση που αυτό απαιτείται μπορεί να εφαρμοσθεί και σε δείγμα που έχει προηγουμένως υποστεί χρώση ρουτίνας. Τέλος η αυτοματοποίηση της διαδικασίας έχει συμβάλει ιδιαίτερα στη διάδοση της μεθόδου ιδιαίτερα σε ό,τι αφορά τις κλινικές εφαρμογές (Fleyd, 1997). Καθώς σήμερα είναι διαθέσιμες πολλές εναλλακτικές τεχνικές για την ανοσοϊστοχημική ανίχνευση των αντιγόνων η επιλογή της κατάλληλης κάθε φορά μεθόδου θα πρέπει να βασίζεται τόσο στο είδος του υπό μελέτη δείγματος, όσο και στο βαθμό της ευαισθησίας που απαιτείται. Επομένως, η επιλογή του αντισώματος, του τρόπου προετοιμασίας του δείγματος και των μαρτύρων που θα χρησιμοποιηθούν είναι οι βασικές αποφάσεις που πρέπει να ληφθούν πριν την εφαρμογή της μεθόδου. Α. Επιλογή αντισώματος Τα αντισώματα ή ανοσοσφαιρίνες είναι πρωτεϊνικά μόρια που έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν και να συνδέονται ειδικά με συγκεκριμένα αντιγόνα. Τα αντισώµατα που χρησιμοποιούνται σε ανοσοϊστοχημικές μεθόδους ανήκουν κυρίως στην οικογένεια των ανοσοσφαιρινών IgG και σπανίως στην οικογένεια των IgM, παράσκευάζονται με ανοσοποίηση ζώων με καθαρό αντιγόνο (ολόκληρη πρωτεΐνη, πεπτίδιο, επικράτεια κλπ.) και διακρίνονται σε δύο βασικές κατηγορίες: τα μονοκλωνικά και τα πολυκλωνικά. Τα πολυκλωνικά αντισώματα παράγονται σε πολλούς οργανισμούς (κουνέλι, ποντικός, αίγα, όνος). Ονομάζονται πολυκλωνικά καθώς στον παραγόμενο αντιορό περιέχονται ΙgG που είναι προϊόντα πολλών διαφορετικών κλώνων Β-‐λεμφοκυττάρων και 2 κατά συνέπεια αναγνωρίζουν διαφορετικούς επιτόπους του αντιγόνου. Η διαδικασία καθαρισμού των πολυκλωνικών αντισωμάτων από τον ορό του αίματος πραγματοποιείται είτε με χρωματογραφία συγγένειας με το αντιγόνο (αφαιρεί το μεγαλύτερο μέρος του μη ειδικού κλάσματος των ανοσοσφαιρινών) είτε με απομόνωση των ανοσοσφαιρινών (αφαιρεί το μεγαλύτερο μέρος των πρωτεϊνών του ορού αλλά δεν εξασφαλίζει την εξάλειψη μη ειδικού κλάσματος των ανοσοσφαιρινών, Delves et al.,2011). Τα μονοκλωνικά αντισώματα παράγονται συνήθως σε ποντικό. Η ανοσοποίηση ακολουθείται από απομόνωση διακριτών κλώνων Β-‐λεµφοκυττάρων, καθένας εκ των οποίων παράγει ένα μόνο αντίσωμα με την ίδια µοριακή δοµή, ειδικότητα και συγγένεια το οποίο αναγνωρίζει έναν συγκεκριμένο επίτοπο. Το βασικό πλεονέκτημα των μονοκλωνικών αντισωμάτων είναι η μεγάλη τους ειδίκευση καθώς όταν χρησιμοποιούνται η πιθανότητα σταυρωτής αντίδρασης του αντισώματος με αντιγόνα που φέρουν επιτόπους παρόμοιους με αυτούς του υπό μελέτη αντιγόνου είναι πολύ μικρή. Αντίθετα, τα πολυκλωνικά αντισώματα εμφανίζουν σε σύγκριση με τα μονοκλωνικά αντισώματα υψηλότερη συγγένεια και ευρύτερη δραστικότητα όμως η πιθανότητα σταυρωτής αντίδρασης με αντιγόνα που φέρουν επιτόπους παρόμοιους με αυτούς είναι αυξημένη και, επομένως, η πιθανότητα ψευδών θετικών αποτελεσμάτων είναι μεγαλύτερη. Ωστόσο, τα πολυκλωνικά αντισώματα έχουν το πλεονέκτημα ότι αναγνωρίζουν πιο συχνά το υπό μελέτη αντιγόνο, αφού αλληλεπιδρούν με πολλούς επιτόπους πάνω σε αυτό (Delves et al., 2011). Πριν από τη χρήση ενός αντισώματος, προσδιορίζεται η βέλτιστη αραίωση στην οποία μπορεί αυτό να χρησιμοποιηθεί. Ο προσδιορισμός της κατάλληλης αραίωσης ενός αντισώματος πραγματοποιείται με δοκιμές του αντιορού -‐ σε διάφορες αραιώσεις-‐ σε ιστούς γνωστούς για την περιεκτικότητά τους στο υπό μελέτη αντιγόνο, εφαρμόζοντας την ίδια τεχνική που θα ακολουθηθεί στο πειραματικό πρωτόκολλο. Η μέγιστη αραίωση του αντισώματος η οποία δίνει ισχυρή ειδική χρώση παράλληλα με τη μικρότερη δυνατή μη ειδική αλληλεπίδραση ονομάζεται τίτλος (Delves et al., 2011). Β. Επιλογή μεθόδου ανοσοϊστοχημείας Η επιλογή μεθόδου ανοσοϊστοχημείας εξαρτάται από πολλούς παράγοντες: από τον ιστό που μελετάται, από την προετοιμασία που δείγματος, από τα επίπεδα έκφρασης του υπό μελέτη αντιγόνου, από το είδος και τα χαρακτηριστικά του συγκεκριμένου αντισώματος και τα διαθέσιμα συστήματα ανίχνευσης αλλά και από τον διαθέσιμο εξοπλισμό και την οικονομική δυνατότητα του εκάστοτε εργαστηρίου. Διακρίνουμε δύο μεγάλες οικογένειες μεθόδων: τις άμεσες και τις έμμεσες. Άμεσες μέθοδοι Στις άμεσες μεθόδους η ανίχνευση του συμπλέγματος αντιγόνου αντισώματος καθίσταται δυνατή λόγω της σύνδεσης πάνω στο μόριο του αντισώματος το οποίο 3 αναγνωρίζει το υπό μελέτη αντιγόνο ενός μορίου αναφοράς όπως μια φθορίζουσα χρωστική, ενός ενζύμου, κολλοειδούς χρυσού, βιοτίνης κλπ (Εικόνα 2). Το βασικό πλεονέκτημα αυτης της μεθόδου είναι η ταχύτητα, αφού αποτελεί διαδικασία που ολοκληρώνεται σε ένα βήμα. Ωστόσο, σε σχέση με τις έμμεσες μεθόδους μειονεκτεί σημαντικά όσον αφορά την ευαισθησία της. Σηµασµένο αντίσωµα έναντι του υπό µελέτη αντιγόνου Εικόνα 2: Σχηµατική απεικόνιση της άµεσης µεθόδου ανίχνευσης. Έμμεσες μέθοδοι Οι έμμεσες μέθοδοι είναι μέθοδοι δύο ή περισσοτέρων βημάτων: το πρώτο βήμα περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση του αντισώματος με το αντιγόνο που αναγνωρίζει, ενώ το δεύτερο βήμα επώαση του συμπλέγματος αντιγόνου-‐πρώτου αντισώματος με δεύτερο αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει το σταθερό τμήμα των IgG του ζωϊκού είδους στο οποίο έχει δημιουργηθεί το πρώτο αντίσωμα (βλ. Εικόνα 3). Το δεύτερο αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με μια φθορίζουσα ομάδα ή κάποιο ένζυμο (π.χ. υπεροξειδάση) ή άλλο μόριο (π.χ. βιοτίνη) που καθιστά δυνατή την ανίχνευση του συμπλέγματος. Σε πολλές περιπτώσεις, ειδικά όταν τα επίπεδα του υπό μελέτη αντιγόνου είναι χαμηλά χρησιμοποιούνται έμμεσες μέθοδοι ενίσχυσης περισσοτέρων βημάτων (βλ. παρακάτω). Σηµασµένο δεύτερο αντίσωµα έναντι της σταθερής περιοχής των IgG του είδους στο οποίο έχει παρασκευαστεί το πρώτο αντίσωµα Πρώτο αντίσωµα έναντι του υπό µελέτη αντιγόνου Εικόνα 3: Σχηµατική απεικόνιση έµµεσης µεθόδου ανίχνευσης. 4 1 2 Οι έμμεσες μέθοδοι δεν απαιτούν σήμανση του αντισώματος που αναγνωρίζει το υπό μελέτη αντιγόνο – αυτό αποτελεί πολυ σημαντικό πλεονέκτημα καθώς οι μέθοδοι σήμανσης προϋποθέτουν απομόνωση των αντισωμάτων σε μεγάλη καθαρότητα ενώ δεν είναι πάντοτε ιδιαίτερα αποτελεσματικές. Ακόμα, οι έμμεσες μέθοδοι συνήθως χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερη ευαισθησία: στον ανοσοφθορισμό δύο βημάτων σε κάθε σύμπλεγμα αντιγόνου-‐πρώτου αντισώματος δεσμεύονται δύο μόρια δεύτερου αντισώματος (ενίσχυση 2Χ), ενώ αν χρησιμοποιηθεί ένζυμο η ευαισθησία καθίσταται ακόμα μεγαλύτερη καθώς καθένα από τα μόρια του ενζύμου καταλύει πολλαπλούς γύρους μετατροπής του υποστρώματός του. Έτσι, είναι εφικτή τόσο η ανίχνευση αντιγόνων που απαντούν σε μικρές συγκεντρώσεις, ενώ επιπλέον εξοικονομείται πρώτο αντίσωμα καθώς για όσο και η αύξηση της αραίωσης στην οποία χρησιμοποιείται το πρώτο αντίσωμα (Larson, 1988; Dabbs, 2008). Tα ένζυμα που συνδέονται στο δεύτερο αντίσωμα είναι, συνήθως, η υπεροξειδάση του χρένου (horseradish peroxidase-‐HRP) και η αλκαλική φωσφατάση (alkaline phosphatase-‐AP) (Nakane et al, 1966; Mason et al.,1978). H HRP αλληλεπιδρά με το υπεροξείδιο του υδρογόνου και το σύμπλοκο που προκύπτει έχει τη δυνατότητα να οξειδώνει διάφορα συνθετικά υποστρώματα (π.χ. 3,3’-‐ διαμινοβενζιδίνη-‐DAB) με αποτέλεσμα τη δημιουργία έγχρωμων προϊόντων. Επιπλέον, για την HRP υπάρχουν και υποστρώματα τα οποία δίνουν προϊόντα φθορίζοντα ή χημειοφωταυγή. Υπάρχουν αρκετά φθηνά υποστρώματα τα οποία δίνουν μετά από την υδρόλυσή τους έγχρωμα αδιάλυτα προϊόντα. Aντίστοιχα και για την ΑΡ υπάρχουν αρκετά υποστρώματα τα οποία όταν υδρολύονται δίνουν είτε έγχρωμα (5-‐bromo-‐4-‐chloro-‐3-‐indolyl phosphate – ΒCIP, nitroblue tetrazolium salt-‐ NBT) είτε φθορίζοντα προϊόντα. Η έμμεση μέθοδος αβιδίνης – βιοτίνης και στρεπταβιδίνης– Σύµπλεγµα Αβιδίνης – βιοτίνης ΒιοτίνηςΗ αβιδίνη είναι μια Ενζύµου Βιοτινυλιωµένο γλυκοπρωτεΐνη μεγάλου Δεύτερο αντίσωµα μοριακού βάρους που απαντά στο αυγό της όρνιθας και φέρει Πρώτο τέσσερις θέσεις δέσμευσης Αντίσωµα υψηλής συγγένειας για μια μικρή Αντιγόνο ιστού πρωτεΐνη του ήπατος τη βιοτίνη. Η βιοτίνη συνδέεται Εικόνα 4: Σχηµατική απεικόνιση της µεθόδου αβιδίνης-βιοτίνης. ομοιοπολικά με διάφορα μακρομόρια, όπως αντισώματα και ένζυμα. Οι μέθοδοι αβιδίνης-‐βιοτίνης χαρακτηρίζονται 5 από υψηλή ευαισθησία λόγω του μεγάλου αριθμού μορίων βιοτίνης που μπορούν να συνδεθούν στο αρχικό μόριο ενισχύοντας σημαντικά την ευαισθησία της μεθόδου. Μία από τις πιο κοινές ανοσοϊστοχημικές μεθόδους είναι η μέθοδος του συμπλέγματος αβιδίνης-‐βιοτίνης (Avidin Biotin Complex; Hsu et al.,1981). Σε αυτή την περίπτωση, το δεύτερο αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με βιοτίνη και λειτουργεί ως γέφυρα μεταξύ του πρώτου αντισώματος και ενός συμπλέγματος αβιδίνης-‐βιοτίνης, πάνω στο οποίο έχει προσδεθεί ένα μόριο που επιτρέπει την ανίχνευση, π.χ. HRP. (Εικόνα 4). Καθώς σε ορισμένα δείγματα με τη μέθοδο ABC παρατηρούνται αυξημένα επίπεδα μη ειδικής αλληλεπίδρασης, σε πολλές περιπτώσεις η αβιδίνη αντικαθίσταται από τη στρεπταβιδίνη, μια πρωτεΐνη του Steptomyces avidinii η οποία, όπως και η αβιδίνη φέρει τέσσερις θέσεις δέσμευσης για τη βιοτίνη. Μέθοδος ενίσχυσης σήματος με τυραμίδιο. Τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιείται αρκετά μέθοδος ενίσχυσης μέ τυραμίδιο. Με αυτή τη μέθοδο γίνεται εφικτή η ενίσχυση του σήματος περίπου 100 φορές. Το τυραμίδιο, μια φαινολική ένωση αλληλεπιδρά, παρουσία Η2Ο2 με την HRP και συνδέεται ομοιοπολικά με τα κατάλοιπα τυροσίνης των πρωτεϊνών που εντοπίζονται στο συγκεκριμένο σημείο (Εικόνα 5). Έτσι με ένα μόριο HRP συνδέονται πολλά μόρια τυραμιδίου τα οποία είναι συνδεδεμένα με κάποια ομάδα ή μόριο που ανιχνεύεται εύκολα. Ωστόσο, τόσο το γεγονός ότι ταυτόχρονα με το σήμα, ενισχύεται και η μη ειδική σήμανση, όσο και το ότι είναι μια μέθοδος ιδιαίτερα ακριβή, την καθιστά λιγότερο εύχρηστη από τις υπόλοιπες (Adams 1992). Α Β Γ Εικόνα 5: (Α) Απεικόνιση του τρόπου πρόσδεσης του τυραµιδίου στην HRP. Ενίσχυση σήµατος µε τη χρήση του τυραµιδίου (Β), χωρίς τυραµίδιο (Γ). Γ. Προετοιμασία δειγμάτων Σημαντικό βήμα για την επιτυχία των πειραμάτων ανοσοϊστοχημείας αποτελεί η προετοιμασία των δειγμάτων, καθώς απαιτείται διατήρηση της μορφολογίας και της 6 αρχιτεκτονικής του ιστού αλλά και της προσβασιμότητας του αντισώματος στο αντιγόνο. Οι βασικές παράμετροι που πρέπει να ληφθούν υπ’όψιν κατά την προετοιμασία των δειγμάτων είναι i) η μονιμοποίηση, ii) το είδος των τομών και iii) ο περιορισμός των μη ειδικών αλληλεπιδράσεων. i) Μονιμοποίηση Η κατάλληλη και επαρκής μονιμοποίηση των ιστών είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της δομής του ιστού και της μορφολογίας των κυττάρων. Ωστόσο, η παρατεταμένη και ακατάλληλη μονιμοποίηση μπορεί να ελαττώσει την δυνατότητα αναγνώρισης από το αντίσωμα «αποκρύπτοντας» επιτόπους που αναγνωρίζονται από το πρώτο αντίσωμα. Δεν υπάρχει κάποιο καθολικό μονιμοποιητικό το οποίο να είναι κατάλληλο για όλα τα αντισώματα, γι΄αυτό και απαιτούνται προκαταρκτικά πειράματα προκειμένου να καθοριστεί το καταλληλο μονιμοποιητικό. Ωστόσο, τα πιό διαδεδομένα μονιμοποιητικά είναι αυτά που έχουν ως βάση τις αλδεΰδες (4% φορμαλδεΰδη, 10% Neutral Buffered Formalin, 2% φορμαλδεΰδη με πικρικό οξύ και PBS, και γλουταραλδεΰδη). Άλλα μονιμοποιητικά είναι αυτά που έχουν ως βάση τον ψευδάργυρο, η ακετόνη, η μεθανόλη και πολλά άλλα (Eltoum et al., 2001; O’Leary et al. 2009). ii) Τομές Η απόφαση για τον τρόπο με τον οποίο θα γίνουν οι τομές από έναν ιστό, εξαρτάται τόσο από το είδος του ιστού, την προέλευση αλλά και το πρωτόκολλο που θα ακολουθηθεί. Υπάρχουν τρεις διαφορετικοί τρόποι πραγματοποίησης τομών, καθένας από τους οποίους απαιτεί διαφορετική επεξεργασία του ιστού. α) Τομές παραφίνης Χρησιμοποιούνται ευρύτατα ιδιαίτερα σε κλινικά δείγματα. Η μικροτόμος (Εικόνα 6), επιτρέπει τη δημιουργία πολύ λεπτών τομών, πάχους 3 μm-‐10 μm. Τα δείγματα που πρόκειται να κοπούν στο μικροτόμο θα πρέπει να έχουν προηγουμένως μονιμοποιηθεί και να έχουν υποστεί επιπλέον επεξεργασία, η οποία περιλαμβάνει θέρμανση και επώαση με ξυλένιο και αλκοόλη, αντιδραστήρια τα οποία συνήθως οδηγούν στην «απόκρυψη» των επιτόπων. Καθώς όμως η συγκεκριμένη μέθοδος χρησιμοποιείται ευρύτατα στα κλινικά δείγματα, τα τελευταία 20 χρόνια έχουν αναπτυχθεί τεχνικές ανάκτησης των επιτόπων οι οποίες έχουν επιτρέψει και τη μελέτη αρχειακών δειγμάτων (Shi et al, 1991; Shi et al. 2012). Εικόνα 6: Μικροτόµος 7 1 2 β) Τομές σε κρυοτόμο Το μηχάνημα που χρησιμοποιείται ονομάζεται κρυοστάτης ή κρυοτόμος (Εικόνα 7), αποτελείται από έναν μικροτόμο που διατηρείται σε χαμηλή θερμοκρασία (περίπου -‐20οC) μέσω κατάλληλου συστήματος ψύξης και επιτρέπει τη δημιουργία τομών πάχους 7-‐20 microns. Τα δείγματα που πρόκειται να κοπούν θα πρέπει να είναι μονιμοποιημένα ή απλώς κατεψυγμένα. Σε σχέση με τη μικροτόμο, οι τομές σε κρυοτόμο είναι πιο δύσκολο να πραγματοποιηθούν, ενώ η μορφολογία τους είναι χαμηλότερης ποιότητας συγκριτικά με τις τομές παραφίνης, ωστόσο προσφέρουν καλύτερη διατήρηση των αντισωμάτων. Εικόνα 7: (Α): Άποψη κρυοστάτη (Β) : Ο θάλαµος εργασίας του κρυοστάτη. γ) Τομές σε μικροτόμο παλλόμενης λεπίδας Ο μικροτόμος παλλόμενης λεπίδας (Εικόνα 8) χρησιμοποιείται για τη δημιουργία τομών από μονιμοποιημένους αλλά και από ζωντανούς ιστούς. Η διάταξη περιλαμβάνει μια λεπίδα που πάλλεται με μεγάλη συχνότητα καθώς κινείται με μεγάλη ταχύτητα. Το πάχος των τομών ρυθμίζεται από 50μm -‐ 2000 μm. Οι τομές σε μικροτόμο παλλόμενης λεπίδας πλεονεκτούν σε σχέση με τα άλλα δύο είδη τομών μιας και ιστός δεν υποβάλλεται σε επεξεργασία με οργανικούς διαλύτες ή υψηλή θερμότητα, η οποία μπορεί να καταστρέψει την αντιγονικότητά του. Ομοίως και η μορφολογία των τομών υπερτερεί σε σχέση με τις τομές παραφίνης και αυτές σε κρυοτόμο γιατί δεν παιρνούν από διαδικασία παγώματος και ξεπαγώματος. Ωστόσο, η διαδικασία πραγματοποίησης των τομών είναι αρκετά αργή ενώ δεν προτιμάται για διαγνωστικές μεθόδους. Εικόνα 9: Μικροτόµος παλλόµενης λεπίδας 8 iii) Περιορισμός μη ειδικών αλληλεπιδράσεων ή μη ειδικής χρώσης Ο περιορισμός των μη ειδικών αλληλεπιδράσεων αποτελεί σημαντική παράμετρο για την επιτυχία της μεθόδου ειδικά στην περίπτωση που το πρώτο αντίσωμα είναι πολυκλωνικό. Τα πολυκλωνικά αντισώματα, λόγω της παρουσίας κατά την ανοσοποίηση των ζώων πλην του υπό μελέτη αντιγόνου και άλλων μορίων. Η κυριότερη αιτία της μη ειδικής χρώσης είναι η πρόσδεση του ορού μέσω υδροφοβικών και ηλεκτροστατικών δυνάμεων σε διάφορες περιοχές του δείγματος. Για το λόγο αυτό της επώασης με το πρώτο αντίσωμα προηγείται επώαση των δειγμάτων με διάλυμα που περιέχει ορό χωρίς ειδικό αντίσωμα. Πρόβλημα επίσης είναι σε μερικές περιπτώσεις η ενδογενής ενεργότητα υπεροξειδάσης ή αλκαλικής φωσφατάσης. Η λύση στο συγκεκριμένο πρόβλημα είναι, η επώαση των δειγμάτων με υπεροξείδιο του υδρογόνου, αν χρησιμοποιείται η HRP ή με τον αναστολέα της ΑΡ levamisole. Ακόμα, πολλοί ιστοί, όπως ο πνεύμονας και το ήπαρ περιέχουν ενδογενώς βιοτίνη. Όταν χρησιμοποιείται το σύστημα βιοτίνης-‐αβιδίνης προηγείται της επώασης με το αντίσωμα, επώαση των δειγμάτων με μη συζευγμένη αβιδίνη. Δ) Μάρτυρες Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων κάθε πειράματος ανοσοϊστοχημείας γίνεται με τη βοήθεια δειγμάτων που χρησιμοποιούνται ως μάρτυρες (θετικοί και αρνητικοί). Οι θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας του πρωτοκόλλου που εφαρμόζεται. Ως θετικός μάρτυρας μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε κάποιος ιστός ο οποίος είναι θετικός για το αντίσωμα που μελετάται είτε κάποιο άλλο αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει μια περιοχή του υπό μελέτη ιστού. Από την άλλη πλευρά, οι αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της ειδικότητας του πρώτου αντισώματος. Ως αρνητικός μάρτυρας μπορεί να χρησιμοποιηθεί η IgG από το ίδιο είδος ζώου, το οποίο έχει ανοσοποιηθεί με κάποιο μη βιολογικό μόριο. Σε αυτή την περίπτωση δεν θα πρέπει να παρατηρηθεί χρώση. Ίδια αρνητικά αποτελέσματα θα πρέπει να παρατηρηθούν εάν οι τομές επωαστούν με ορό από μη ανοσοποιημένο ζώο (θα πρέπει να είναι το ίδιο είδος στο οποίο έχει παραχθεί το αντίσωμα που μελετάται) (Larsson, 1988; Dabbs 2008). 9 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Coons AH, Creech HJ, Jones RN (1941) Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med 47:200–202. 2. Coons AH. (1960) Immunofluoresence Public Health Rep. 75:937-‐43 3. Coons AH & Kaplan MH. (1950) Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 91(1):1-‐13. 4. Coons AH, Leduc EH & Connoly JM. (1955) Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. J Exp Med. 1955 Jul 1;102(1):49-‐60. 5. Nakane PK, Pierce GB. (1966) Enzyme-‐labeled antibodies; preparation and localization of antigens. J Histochem Cytochem 14:929–931. 6. Avrameas S, Uriel J. (1966) Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262:2543-‐5 7. Mason DY, Sammons R. (1978) Alkaline phosphatase and peroxidase for double immunoenzymatic labelling of cellular constituents. J Clin Pathol. May;31(5):454–460. 8. Suffin, S. C., Muck, K. B., Young, J. C., et al. (1979) Improvement of glucose oxidase immunoenzyme technique: Use of a tetrazolium whose formazan is stable without heavy metal chelation. Am. J. Clin. Pathol. 71,492-‐496. 9. A. Bondi, G. Chieregatti, V. Eusebi, E. Fulcheri and G. Bussolati (1982). The use of β-‐galactosidase as a tracer in immunocytochemistry. Histochemistry 76:153-‐158. 10. Delves PJ, Martin SJ, Burton DR & Roitt IM. (2011) Roitt's Essential Immunology Ed. Wiley. 11. Adams JC. (1992) Biotin amplification of biotine and horseradish peroxidase signals in histochemical. J Histochem Cytochem. 40:1457-‐1463. 12. Dabbs DJ. (2008) Immunohistochemical protocols: back to the future. Am J Clin Pathol. 129:355-‐356. 13. Eltoum I, Fredenburgh J, Myers RB, Grizzle WE. (2001) Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol. 24:173-‐190. 14. O’Leary TJ, Fowler CB, Evers DL, Mason JT. (2009) Protein fixation and antigen retrieval: chemical studies. Biotech Histochem. 84:217-‐221. 15. Hsu S-‐M, Raine L, Fanger H. (1981). Use of avidin-‐biotin-‐peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J. Histochem Cytochem. 29:577-‐580. 16. Shi R., Shi Y., and Taylor CR. (2011) Antigen Retrieval Immunohistochemistry: Review and Future Prospects in Research and Diagnosis over Two Decades. Journal of histochemistry & Cytochemistry 59(1) 13– 32. 17. Shi S-‐R, Key ME, Kalra KL. (1991) Antigen retrieval in formalin fixed, paraffin-‐embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem. 39:741-‐748. 18. Floyd AD. Automated Immunostaining: The Technology and its Application. NHS Workshop, 1997. 19. Larsson L-‐I. In: Larsson L-‐I. Immunocytochemistry: Theory and practice .Boca Raton: CRC Press 1988:147-‐ 170. 10 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Στην εργαστηριακή αυτή άσκηση θα πραγματοποιήσουμε ανοσοϊστοχημεία σε στεφανιαίες τομές κρυοτόμου από έμβρυο ποντικού Ε13.5. Η μέθοδος που θα εφαρμόσουμε είναι η έμμεση μέθοδος συμπλέγματος αβιδίνης-‐βιοτίνης (ABC). Πριν ξεκινήσει ένα πείραμα ανοσοϊστοχημείας σε τομές κρυοτόμου θα πρέπει να ετοιμαστούν οι κατάλληλες τομές. Έχει προηγηθεί απομάκρυνση εμβρύων από τη μήτρα νεκρού θηλυκού ποντικού (στέλεχος C57-‐ Black6), εμβάπτιση σε 1Χ PBS και μονιμοποίηση των εμβρύων σε παραφορμαλδεΰδη 4% w/v για 16 h. Τα έμβρυα μεταφέρθηκαν ακολούθως σε διάλυμα σακχαρόζης 30% w/v (σε 1Χ PBS), η οποία λειτουργεί ως κρυοπροστατευτικό, έως ότου βυθιστούν. Έπεται έγκλειση του εμβρύου σε OCT σε ξηρό πάγο με τον επιθυμητό προσανατολισμό, τοποθέτησή του στον κρυοτόμο και πραγματοποίηση τομών κατάλληλου πάχους. ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ 1. Φορέστε γάντια, ανοίξτε το μικροσκόπιο και παρατηρείστε τις τομές των εμβρύων. Με ένα μολύβι σημειώστε στο αριστερό άκρο της αντικειμενοφόρου τον αριθμό της ομάδας σας μέσα σε κύκλο. Mε τη βοήθεια ειδικού στυλο κάντε ένα κύκλο γύρω από το δείγμα. 2. Με τη βοήθεια της λαβίδας τοποθετήστε την αντικειμενοφόρο στο κατάλληλα διαμορφωμένο τρυβλίο Petri. 3. Χρησιμοποιώντας την Ρ200, καλύψτε τις τομές με 80ul 4% PFA. Eπώαση για 20’ σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Στο τέλος της επώασης απομακρύνατε το μονιμοποιητικό και προσθέστε 80ul PBS-‐0.1% Triton X (PBSTR). (Εκπλυση). Επώαση 5’ σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Επαναλάβατε το βήμα 4. 6. Επαναλάβατε το βήμα 4. 7. Στο τέλος της επώασης απομακρύνατε το PBSTR και προσθέστε 80ul 1h RT σε PBSTR+ 5% oρό εμβρύου βοδιού (Foetal Bovine Serum –FBS). Eπώαση 1h σε θερμοκρασία δωματίου. 8. Στο τέλος της επώασης απομακρύνατε το PBSTR-‐FΒS και προσθέστε 80ul σε PBSTR+ 5% oρό εμβρύου βοδιού (Foetal Bovine Serum –FBS) + το αντίσωμα σε αραίωση 1: 10.0000. 9. Επώαση 16 h στους 4οC. 11 10. Στο τέλος της επώασης απομακρύνατε το διάλυμα και προσθέστε 80ul PBSTR. Επώαση 5’ σε θερμοκρασία δωματίου. 11. Επαναλάβατε το βήμα 10. 12. Επαναλάβατε το βήμα 10. 13. Στο τέλος της επώασης προσθέστε το βιοτινυλιωμένο δεύτερο αντίσωμα. Αραίωση 1:200 σε PBSTR + 1.5% oρό κατσίκας (Normal Goat Serum-‐NGS). 14. Επαναλάβατε το βήμα 10. 15. Επαναλάβατε το βήμα 10. 16. Επαναλάβατε το βήμα 10. 17. Επώαση του συμπλόκου αβιδίνης/βιοτίνης (για 2.5 ml PBSTR, 1 σταγόνα αντιδραστηρίου A και μια σταγόνα αντιδραστηρίου B) για 30 min RT. 18. Επώαση με PBSTR + 0.3%FBS +0.5% H2O2 για 35min σε σκοτάδι, RT. 19. Επαναλάβατε το βήμα 10. 20. Επαναλάβατε το βήμα 10. 21. Επαναλάβατε το βήμα 10. 22. Στο τέλος των εκπλύσεων του δεύτερου αντισώματος προσθέστε 80 ul από το σύμπλοκο αβιδίνης/βιοτίνης του βήματος 17 και επωάστε για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου. 23. Xρώση: Σε ένα σωληνάριο τύπου eppendorf προσθέστε 1 ml Η20 και διαλύστε • Μια ταμπλέτα DAB • μια ταμπλέτα Ουρίας -‐ Η2Ο2. 24. Καλύψτε τις τομές με διάλυμα χρώσης και επωάστε στο σκοτάδι για 6-‐7 min. 25. Παρατηρήστε στο μικροσκόπιο και αν χρειάζεται συνεχίστε την επώαση (έως 30 min). 12