ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Γκαντέρης Γεώργιος Βιοπαθολόγος Αναπληρωτής Διευθυντής ΓΝΑ «Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ» GRAM ΘΕΤΙΚΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙA Gram θετικά βακτηρίδια σπορογόνα (Clostridium sp) Gram θετικοί αναερόβιοι κόκκοι Peptostreptococcus sp P. anaerobius Parvimonas sp P. micra Finegoldia sp F. magna Peptoniphillus sp Pn. asaccharolyticus, Pn. indolicus, Pn. harei, Pn. lacrimalis, Pn. ivorii Anaerococcus sp An. prevotii, An. Tetradius, An. hydrogenalis, An. octavius An. lactolyticus, An. vaginalis Peptocoocus sp P. niger Atopobium sp A. parvula Coprococcus sp, Rominococcus sp Sarcina sp ,Gallicola sp Gallicilo bamesae Gram θετικά βακτηρίδια μη σπορογόνα (Actimomyces sp, Propionibacterium sp, Lactobacillus sp, Bifidobacterium sp, Eubacterium sp ) ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Α. Κλινικές πληροφορίες Β. Μακροσκοπική εξέταση Γ. Άμεση μικροσκοπική εξέταση Δ. Ταυτοποίηση (προκαταρκτική & τελική) ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ (συνέχεια) Α. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ 1. Θέση λοίμωξης 2. Προηγούμενη λήψη αντιβιοτικών 3. Παραγωγή αερίου 4. Δυσοσμία ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ B. Μακροσκοπική εξέταση Μαύρα πυώδη ή αιματηρά εξιδρώματα Πιθανόν φθορισμός Κοκκία θείου ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ (συνέχεια) Γ. ΑΜΕΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Νωπό: Μικροσκόπηση σε σκοτεινό πεδίο για παρατήρηση των σπόρων και της κινητικότητας Χρώση Gram: Θέτει την αρχική υποψία της παρουσίας αναεροβίων βακτηρίων Προσφέρει σημαντική βοήθεια στην αρχική εμπειρική θεραπεία Χλωρίδα εντέρου Lactobacillus sp Θρεπτικά υλικά για αναερόβια Brucella blood agar εμπλουτισμένο με αιμίνη και βιταμίνη Κ1 Phenyl ethyl alcohol blood agar (PEA) kanamycin-vancomycin laked blood agar (KVLB) Bacteroides bile-esculin agar (BBE) Thioglycolate broth εμπλουτισμένο με βιταμίνη K1 και αιμίνη Δ. Προκαταρκτική ταυτοποίηση αναεροβίων Mορφολογία των αποικιών Xρώση Gram Aπλές δοκιμασίες Πλήρης ταυτοποίηση Βιοχημικές δοκιμασίες Συστήματα ταυτοποίησης (Rapid ID 32A, BBL Crystal ANR, RapID ANA II ) Δισκία ενζυματικών αντιδράσεων Υγρή-αέρια χρωματογραφία Εξέταση των καλλιεργημάτων 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Συνήθως πολυμικροβιακή ανάπτυξη με άλλα αναερόβια και αερόβια Ενδείξεις αναεροβίων: Δυσοσμία Περισσότεροι τύποι αποικιών στο αιματούχο αναερόβιο από το σοκολατόχρωμο Ανάπτυξη στο υλικό ΒΒΕ ή στο KVLB Κεραμιδί φθορισμός (μετά έκθεση σε UV φως 366 nm) ή μαύρες αποικίες στο KVLB ή στο αιματούχο αναερόβιο Από κάθε διαφορετικό μορφότυπο αποικίας εκτελείται χρώση Gram, έλεγχος αεροβιώσεως σε σοκολατόχρωμο άγαρ (24-48 h CO2 5-10%) και απομόνωση σε αιματούχο ανερόβιο με δισκίο metronodazole Ανάπτυξη μόνο στο αιματούχο αναερόβιο σημαίνει αναερόβιο βακτήριο Μερικά αναερόβια αναπτύσσονται σε περιβάλλον CO2 5-10% ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΓΡΗΓΟΡΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ Clostridium sp (από καθαρό καλλιέργημα) Χρώση Gram Μορφολογία αποικιών Έλεγχος αεροβίωσης Δίσκοι ειδικής περιεκτικότητας (Vancomycin 5 μg, Kanamycin 1000 μg, Colistin 10 μg) Λιπάση –Λεκιθινάση Παραγωγή ινδόλης Αναγωγή νιτρικών δισκία Καταλάση Φθορισμός Παραγωγή ουρεάσης Δοκιμασία παραγωγής σπόρων (alcohol shock) Ανάστροφη CAMP Nagler test Χαρακτηριστικά αποικιών κλωστηριδίων Μεγάλες αποικίες με διπλή ζώνη αιμόλυσης (C. perfringens, C.novyi ) Μεγάλες ριζοειδείς ( Clostridium sp ) Ερπύζουσες αποικίες (C. septicum, C. tetani, C. sordellii, C. sporogenes) Οσμή (στάβλου αλόγων C. difficile) Χρώμα αποικιών C. novyi C. difficile C. septicum ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΣΠΟΡΟΓΟΝΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ C. difficile κιτρινοπράσινος C. innocuum κιτρινοπράσινος C. ramosum κόκκινος Μικροσκοπική εικόνα C. perfringens: Gram (+) βακτηρίδια μεγάλα με τετραγωνισμένα άκρα, χωρίς σπόρους C. septicum: Μακρύ, λεπτό, πολύμορφο νηματοειδές με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους C. novyi : Mεσαίου μεγέθους με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους C. difficile: Μακρύ, λεπτό, με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους C. perfringens C. difficile C. difficile C. sporogenes C. novyi C. tetani C. septicum Λεκιθινάση + C. perfringens Λιπάση + C. sporogenes ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΛΕΚΙΘΙΝΑΣΗΣ –ΛΙΠΑΣΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΟ C. perfringens 1 C. Sordellii 1 C. bifermentans 1 C. barati 1 C. limosum C. novyi A C. sporogenes 1 Nagler θετικά ΛΕΚΙΘΙΝΑΣΗ ΛΙΠΑΣΗ + + + + - + + - + + C. perfringens Ανάστροφη δοκιμασία CAMP Nagler test Αντιτοξίνη C. perfrringens ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ Ινδόλη Νιτρικά Φθορισμός Λεκιθινάση Λιπάση Ουρεάση Τετράγωνα άκρα Διπλή βαιμόλυση C. perfringens - -+ - + - - + + C. bifermentans + - - + - - - - C. sordellii + - - + - + - - C. septicum - -+ - - - - - - C. sporogenes - - - - + - - - Προκαταρκτική ταυτοποίηση κλωστηριδίων Λεκιθινάση + - - C. bifermenntas C. novyi Λιπάση + C. sporogenes - Λιπάση + Closridium sp C. sordelli C. barati C. limosum C. perfringens Ινδόλη C. bifermenntas C. barati C. sordelli Ουρεάση C. bifermenntas C. limosum C. perfringens + C. sordelli + Ζελατίνη C. limosum C. perfringens - + C. barati ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΕΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ Ένζυμα Θετικό αποτέλεσμα Βακτήρια Glutamic acid decarboxylase amine (μπλε χρώμα) C. sordelii (+) C. bifermentans (-) L-proline β-naphythylamine aminopeptedas + cinnamaldehyde e ( ροζ-πορφυρό χρώμα) C. difficile C. innocuum (+) (-) α-Glucosidase μπλε φθορισμός (με UV 360 nm) 4-methylumbelliferone (+) C. septicum C. sporogenes (-) Αλκαλική φωσφατάση 4- nitrophenol Κίτρινο χρώμα An. hydrogenalis (+) An. accacharolyticus (-) RapID ANA II Panel (remel) Σακχαρολυτικά – πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεθινά ση Λιπά ση Ινδόλη Αερόβια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκουλί νη C. bifermentans + - + - - - + ΩΥ + C. Sordelii + - + - +- - + ΩΥ - C. perfringens + - - - - +- - Οχι - C. novyi + + - - - - + ΩΥ - C. sporogenes - + - - - - + ΩΥ + C. cadaveris - - + - - - + ΩΥ - C Septicum - - - - - Π + ΩΥ + C. difficile - - - - - - + ΩΤ + C. putrificum - - - - - - + Τ -+ Σακχαρολυτικά – μη πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεκιθι νάση Λιπ άση Ινδό λη Αερό βια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκου λίνη + - + - - - + Τελικός ΟΧΙ + C. tertium - - - + - - + AN + C. butyricum - - - - - - - ΩΤ + C. innocum - - - - - - ΩΤ + C. ramosum - - - - - - + Σ, ΩΤ Σπάνιος + C Clostridioform - - - - - +_ + ΩΥ, ΟΧΙ + C. barati Μη σακχαρολυτικά – μη πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λιπάση Ινδόλη Αερόβια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκουλίνη - - Π - - - + Σ,Τ - C. hastiform - - - - - _+ + Υ - C. Subterminale -+ - - - - - + ΩΥ, ΟΧΙ -+ C. histoyticum - - - +- - - + ΩΥ - C. limosum + - - - - - + Υ - Λεκιθινά ση C. tetani ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΚΟΚΚΩΝ Δίσκοι SPS E A Peptostreptococcus anaerobius + Ινδόλη Ουρεάση - + Pn. asaccharolyticus An. hydrogenalis Micromonas micros <0,6 μm An. prevotii Finegoldia magna > 0,6 μm An. terradius + + α-γαλακτοσιδάση - Αλκαλική φωσφατάση -- ή ζύμωση γλυκόζης Pn.αsaccharolyticus An. prevotii An. tetradius An. hydrogenalis P. anaerobius Gram θετικά βακτηρίδια μη σπορογόνα A. israeli A. israeli A. odondolyticus Propionibacterium acnes ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΜΗ ΣΠΟΡΟΓΟΝΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΔΙΩΝ Βακτήρια Νιτρικά Actinomyces sp Καταλάση Ινδόλη Εσκουλίνη Ουρεάση Χρώμα αποικιών + -+ - +- +- Ανάπτυξη A. israelii +- - - + - - Α, Μ A. odontolyticus + - -- +- - +- Α, Μ A. naeslundii +- - - +- + - Α, Δ A. viscosus +- + - +- + - Α, Μ A. meyeri -+ - - -+ - - Α Propionibacterium sp +- +- -+ +- Α, Μ P. acnes +- +- +- - Α, Μ - + - - P. anidum - + - + Bifidobacterium sp - -+ - +- Α, Μ B. dentium - - - + Α Lactobacillus sp -+ - - +- Α, Μ Eubacterium sp +- - -+ +- Α + -+ - - P. granulosum Α E. lentum Α: αναερόβια Δ: δυνητικά αναερόβια Μ: μικροαερόφιλα Isenberg 2005 Προκαταρκτική ταυτοποίηση Gram (+) Μη σπορογόνων βακτηριδίων Διφθεροειδή, πολύμορφα ή διακλαδιζό μενα Καταλάση(+) Propionibacterium sp Actinomyces viscosus Iινδόλη (+) Α. Viscosus: P. acnes Ουρία(+) Νιτρικά (+) Καταλάση(-) Νιτρικά (-) P. propionicum Iινδόλη (-) Propioniba cteriun sp Διφθεροειδή με διακλαδιζόμενα άκρα Bifidobabacterium Νιτρικά(+) A Israelii, A.odontolyticus Α. naeslundii, A. meyeri διφθεροειδή, Πολύμορφα Ή ομαλά Eubacterium sp E. limosum Κοντά ή μακρυά λεπτά βακτηρίδια Συχνά σε αλυσίδες Lactobacillus E. lentum Ερώτηση 1η Gram θετικό, σπορογόνο αναερόβιο βακτηρίδιο, (απομονώθηκε από κ/α αποστήματος σε χρήστη ενδοφλεβίων ναρκωτικών ουσιών) με: διπλή ζώνη β- αιμόλυσης λεκιθινάση( +) λιπάση (+) είναι: 1. C. perfringens 2. C. sporogenes 3. C. novyi 4. Όλα τα ανωτέρω Ερώτηση 2η Gram (+) αναερόβιος κόκκος, ευαίσθητος στη Metronidazole με ζώνη αναστολής στο SPS >= 12 mm είναι: 1. Micromonas micros 2. Pertosrteptococcus anaerobius 3. Finegoldia magna 4. Όλα τα ανωτέρω