Lezioni domenicali Aprile 2015 - Centro Sportivo Villa Flaminia

Analisi quantitativa dell’interazione
proteina-proteina
Legame recettore-ligando
Il legame per il ligando deve essere:
•reversibile
•ad alta affinità
•saturabile
•deve portare ad una risposta fisiologica specifica
•la concentrazione di ligando alla quale il legame è saturabile deve
essere compatibile con la concentrazione fisiologica del ligando
•analoghi del ligando in grado di legare il recettore devono indurre in
vivo gli stessi effetti fisiologici
k on
Recettore-Ligando→risposta
Recettore + Ligando
k off
k on
Recettore-Ligando→risposta
Recettore + Ligando
k off
kon e koff sono le costanti cinetiche di associazione e di
dissociazione.
La velocità di associazione è data da
Von = kon × [Ligando] × [Recettore]
La velocità di dissociazione del complesso è data da
Voff = koff × [RecettoreLigando]
Von = Voff
All’equilibrio avremo:
[L] × [R] × kon = [RL] × koff
riarrangiando
[L]
× [R]
=
koff
[RL]
kon
[L] = Kd
[R]
[RL]
=
Kd
[R] [L]
Kd
=
[RL]
ponendo
=
1
[R] = [RL]
Kd è la concentrazione di ligando alla quale
metà dei siti di legame è occupata
Essendo [R] = [Rtot] - [RL]
[R] [L]
Kd =
[RL]
[R] [L] ([Rtot] - [RL]) [L]
[RL] =
=
Kd
Kd
[RL] Kd = [Rtot] [L] - [RL] [L]
[RL] Kd + [RL] [L] = [Rtot] [L]
[RL] (Kd + [L]) = [Rtot] [L]
[RL] =
[Rtot] [L]
Kd+ [L]
Questa equazione consente di determinare la Kd misurando [RL]
a diverse concentrazioni di ligando [L] quando [L] >> [Rtot],
ovvero quando [L] ≅ [Ltot]
[LR]μM
[L]μM
[LR]μM
semilogaritmico
[L]μM
Un’altra trasformazione che viene usata frequentemente è l’equazione di Schatchard
[ LR] [ Rt ] [ LR]


[ L]
Kd
Kd
che consente una
stima grafica della Kd
Analisi di Scatchard
Partendo dall’equazione:
[Rtot] [L]
[RL] =
Kd + [L]
[RL] ([L] + Kd ) = [L] [R tot]
[RL] [L] + [RL] K d = [L] [R tot]
dividendo tutto per [L] Kd avremo:
[RL] [L]
[L] Kd
+
[Rtot] [L]
[RL]Kd
[L] Kd
=
[L] Kd
quindi:
[RL]
[L]
[Rtot]
=
Kd
-
[RL]
Kd
Se indichiamo con B la concentrazione di ligando legato [RL];
con n [Rtot] cioè il numero dei siti recettoriali
con F la quantità di ligando libero [L]
avremo:
B
_ B + n
=
F
Kd
Kd
Riportando in grafico il rapporto tra la quantità di ligando
legato e ligando libero (B/F) rispetto alla quantità di ligando
legato (B) avremo:
B
F
_ B +
=
Kd
n
Kd
1.00
B/F
0.75
0.50
n
0.25
0.00
0.000
0.025
0.050
0.100
0.125
B
Si ottiene una retta con
pendenza = -
0.075
1
Kd
L’intercetta sull’asse delle ascisse (B/F = 0) permette di
ricavare n che rappresenta la densità recettoriale.
0.150
Effetti della concentrazione di L e di R
•Per ottenere risultati attendibili è importante misurare
[RL] quando [L] è vicina alla Kd
•I valori sono accurati quando [Rtot] << [Ltot] e << Kd,
quindi [Ltot] è quasi uguale a [L]
•Il saggio di legame dovrebbe essere sufficientemente
sensibile da permettere di usare concentrazioni di L e/o
R tra 0.1 e 10 Kd.
Effetti della concentrazione di L e di R
Se invece il saggio di legame viene eseguito in condizioni
in cui [R] = [L] è necessario sostituire nell’equazione
[L] = [Ltot] – [RL]
[RL] = [Rtot] [L]
Kd + [L]
quindi
[RL] = [Rtot] ([Ltot] – [RL])
Kd + ([Ltot] – [RL])
riarrangiando
Kd [RL] + [Ltot] [RL] – [RL]2 = [Rtot] [Ltot] – [Rtot] [RL]
Effetti della concentrazione di L e di R
[RL]2 – (Kd + [Rtot] + [Ltot]) [RL] + [Rtot] [Ltot] = 0
Questa è un’equazione di secondo grado
ax2 + bx + c = 0
che si risolve con la formula
x = - b ± √ (b2 – 4ac)
2a
[RL] = (Kd + [Rtot] + [Ltot]) - √(Kd + [Rtot] + [Ltot])2 – 4[Rtot] [Ltot]
2
TECNICHE PER LO STUDIO DEL LEGAME
RECETTORE-LIGANDO
La capacità di analizzare quantitativamente un equilibrio
di legame dipende dalla possibilità di distinguere tra
recettore libero e legato (o ligando libero e legato) e
quindi poter misurare almeno uno tra L, R e RL
Metodi senza separazione fisica del ligando legato
da quello libero
L’attacco del ligando al recettore deve cambiare una proprietà
misurabile di L e/o di R
•Spettroscopia di assorbimento (alterazione coefficiente di
estinzione, spostamento picchi di assorbimento)
•Spettroscopia di fluorescenza (alterazione dell’intensità o della
lunghezza d’onda di emissione)
 fluorescenza intrinseca (triptofano)
 marcatura con sonde fluorescenti (fluorofori)
A volte però, queste tecniche non possono essere applicate e quindi
non è possibile una misurazione diretta del legame. In questi casi,
vengono usate tecniche in cui, dopo il raggiungimento dell’equilibrio,
si può misurare separatamente almeno uno tra L, R ed LR.
In genere si usano ligandi marcati radioattivamente ad
alta attività specifica
• 125I 2200 Ci/mmole
• 3H 2-20 Ci/mmole
• 14C 0.05-0.5 Ci/mmole
Metodi di separazione del ligando libero dal
ligando legato al recettore
Centrifugazione
Dialisi all’equilibrio
Gel-filtrazione
Ultrafiltrazione
Adsorbimento
Precipitazione
Immunoprecipitazione
Cromatografia di affinità
Dialisi all’equilibrio
RL + L
L
Studi di binding
Analisi di saturazione: Studio del grado di
saturazione del recettore all’equilibrio a diverse
concentrazioni di ligando
Analisi cinetica: Studio della cinetica di
associazione e di dissociazione del ligando e del
recettore come funzione della concentrazione
• Cinetica di associazione
• Cinetica di dissociazione
Approccio sperimentale all’analisi di saturazione
Si determina il Binding Totale e il Binding Non-Specifico a
differenti concentrazioni di ligando radiomarcato.
Binding Totale
Si ottiene aggiungendo quantità crescenti di radioligando ad
una determinata concentrazione di recettore
Binding Non-Specifico
Si ottiene aggiungendo ligando non marcato ad una
concentrazione alla quale tutto il ligando radioattivo viene
spiazzato dai siti specifici di legame
Bound
(pmol/mg protein)
0.15
Binding totale
Binding non specifico
Binding specifico
0.10
0.05
0.00
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
[* L], (nM)
Visualizzando solo la
curva del binding
specifico possiamo
individuare la Kd e la
Rtot
Bound
(pmol/mg protein)
0.100
0.075
Rtot
0.050
0.025
0.000
0.00
Kd
0.25
0.50
[ L], (nM)
0.75
1.00
Se è presente un solo tipo di recettore il grafico di Scatchard
sarà lineare.
Se sono presenti invece due tipi di recettore in uguale
concentrazione ma con differenze in Kd per il ligando
avremo:
Scatchard plot
Le curve dei singoli recettori sono riportate in rosso e
azzurro, in nero la curva somma del binding totale.
Analisi di competizione
Il binding di competizione viene effettuato per determinare la
capacità di un ligando L2 di competere con un ligando L1 per
un dato recettore.
Viene utilizzata una concentrazione fissa di ligando marcato
L1 e di recettore.
Il sistema viene portato all’equilibrio e viene misurata la
concentrazione di complesso L1R in presenza di
concentrazioni differenti di ligando L2 non marcato.
% spiazzamento
8-OH-DPAT
Composto 1
IC50 = 3.02 nM
IC50 = 20.6 nM
0
50
100
10 -11
10 -10
10 -9
10 -8
10 -7
10 -6
10 -5
Log dose
Il valore di IC50 indica la concentrazione di ligando L2 in
grado di spiazzare il 50% di radioligando L1 dal recettore
all’equilibrio
Analisi cinetica
Cinetica di associazione
L’esperimento cinetico di associazione viene effettuato per
determinare la costante di velocità di associazione kon.
La quantità di complesso RL aumenta nel tempo fino ad un
valore massimo che è pari alla quantità di binding specifico
(Ymax) all’equilibrio per quella concentrazione di ligando.
7500
cpm
Ymax
5000
2500
0
0
10
20
30
tempo (ore)
Costante di velocità di associazione kon (min-1 M-1).
Binding specifico
Cinetica di dissociazione
Binding non specifico
tempo
Si porta il sistema recettore-radioligando all’equilibrio e poi si
aggiunge il ligando freddo ad una concentrazione elevata,
misurando la concentrazione di complesso a diversi intervalli
di tempo.
Costante di velocità di dissociazione koff (min-1).

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