Il Binding Farmaco (F) + recettore (R) k1 k2 FR effetto Applicazioni del binding • Affinità farmaco per recettore • Concentrazione recettori in tessuti • Proprietà cinetiche di legame dei farmaci • Screening (industria) • Clinica- correlazione con efficacia Fattori importanti nella messa a punto di un esperimento di binding • SCELTA DEL LIGANDO • SATURABILITA’ • TESSUTO • INCUBAZIONE • SEPARAZIONE Scelta del ligando • Alta affinità • Purezza • Alta attività specifica 3H > 125I > 14C > 35S SATURABILITA’ • Limitato numero recettori. Binding non specifico • Specificità farmaci (reuptake) • Stereospecificità TESSUTO  Linearità  Tessuti rilevanti  Distribuzione INCUBAZIONE  Soluzioni tampone (Na, K)  pH (7-8)  Tempo (binding a equilibrio)  Temperatura (4-37 °C) SEPARAZIONE  Dialisi (mM)  Centrifugazione (10-100 nM)  Filtrazione (inferiore a 10 nM) Binding specifico R+L+I RL+RI LT = RL + L R+L+I RL + RI LT = RL + L 1) Saturazione LT crescente, RL det. a equilibrio 2) Competizione LT costante, RL det. con l’aumentare di I 3) Cinetica LT costante, RL det. come funzione del tempo SATURAZIONE R+L+I RL+RI SCATCHARD PLOT RT 1 L 10 B/F Bmax KD = concentrazione farmaco che lega 50% recettori COMPETIZIONE [3H]HDA (% Control) (-)propranololo no or plus Gpp 100 (-)isoproterenol no addition 90 80 70 (-)isoproterenol plus Gpp(NH)p 50M 60 50 40 30 20 10 9 8 7 6 5 4 [Adrenergic Agent] M-Log10 Effect of 5’ guanylimidodiphophate [Gpp(NH)P] on competition of the agonist (-)isoproterenoland the antagonist (-)propranolol for (-)[3H]dihyidroalprenolol ([3H]HDA) binding sites in erytrocyte membranes. Studi di cinetica (associazione e dissociazione) B B K-1 K+1 T R+L K+1 K-1 K-1 R L = K+1 RL T RL K-1 KD= K+1