23/04/14 21. Regolazione dell espressione genica contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale Le cellule si differenziano attraverso l espressione differenziale dei geni. tre postulati: 1) Ogni nucleo cellulare contiene l intero genoma istituitosi nell uovo fecondato 2) Nelle cellule differenziate i geni non utilizzati non vengono distrutti né mutati, e mantengono la potenzialità di essere espressi. 3) In ogni cellula viene espressa soltanto una piccola percentuale del genoma, e una parte dell RNA sintetizzato in ogni cellula è specifica di quel tipo cellulare. 1 23/04/14 Come fa la cellula a stabilire quali geni deve esprimere? Differenziamento serve affinchè le cellule producano RNA e proteine diverse, cioè geni diversi: In un organismo pluricellulare diversi tipi di cellula contengono lo stesso DNA In tutti gli organismi viventi le informazioni contenute nel genoma non si esprimono contemporaneamente, e sono finemente regolate. • Geni ad espressione costitutiva (housekeeping) • Geni ad espressione condizionale (inducibili, reprimibili) • Geni specializzati (tessuto specifici, che a loro volta possono essere costitutivi o condizionali) 2 23/04/14 Le cellule differenziate hanno tutte le informazioni per formare un organismo completo Cellula epidermica NON ha perso sequenze importanti di DNA Singola cellula genera intera pianta adulta La produzione di tipi celulari specializzati in genere non dipende da riarrangiamenti del DNA L espressione genica può essere controllata a livello di molti passaggi distinti 3 23/04/14 Quali sono i meccanismi che determinano l accensione o lo spegnimento dell espressione di un gene? procarioti: – espressione genica selettiva permette alle cellule di risparmiare energia – La regolazione avviene per lo più a livello trascrizionale eucarioti: – espressione genica selettiva permette alle cellule di svolgere ruoli specializzati – La regolazione avviene a vari livelli Il controllo della trascrizione è basato sul riconoscimento di corte sequenze di DNA da parte di diverse classi di proteine proteine che legano il DNA devono avere alta af&inità per permettere una regolazione ef7iciente 4 23/04/14 i PROMOTORI dei geni contengono sito d inizio dove comincia la trascrizione i geni hanno anche delle SEQUENZE di REGOLAZIONE del DNA che devono essere riconosciute da proteine che legano il DNA: i REGOLATORI della TRASCRIZIONE proteine si interfacciano con il DNA perché assumono una configurazione tridimensionale che si adatta al solco e formano strette interazioni con gruppo specifico di nucleotidi: Si legano al solco principale della doppia elica di DNA Si formano molti legami che danno luogo ad una interazione molto specifica e forte 5 23/04/14 una struttura molto diffusa per DNA-‐binding Helix-‐turn-‐helix Anche nei procarioti Esempi di helix-‐turn-‐helix Sequenza riconosciuta da lambda Cro 6 23/04/14 DNA binding-‐motif Omeodominio sequenza conservata di 60 amminoacidi presente in alcuni attivatori Zinc finger motif piccolo gruppo di amminoacidi conservati legano un atomo di zinco, formando un dominio indipendente nella proteina leucine zipper motif Le proteine a “serratura di leucine” devono il loro nome alla ripetizione di 4 o 5 residui di leucina posti a distanza fissa uno dall’altro Strategie di controllo dell espressione genica nei batteri • Genoma estremamente compatto • Le RNA polimerasi possono riconoscere il promotore in assenza di altre proteine • Organizzazione dei geni in operoni • Regioni di controllo molto piccole (in genere <200 bp) 7 23/04/14 Regolazione genica nei procarioti • Geni costitutivi: sono costantemente attivi (es. geni che codificano per gli enzimi della glicolisi) • Geni regolati: la loro espressione è regolata in modo tale che che la quantità del corrispondente prodotto (proteina o RNA) è controllata in relazione al fabbisogno cellulare (es. sintesi adattativa di enzimi) Scopo: Rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali Risparmiare energia; niente mRNA o proteine che non servano subito molti geni batterici sono organizzati in cluster : gruppi di geni codificanti per proteine con funzioni correlate, (es. enzimi di una stessa via metabolica, proteine deputate al trasporto intracellulare ecc), che si trovano sotto il dominio di un unico promotore. OPERONE Unità di trascrizione che include: • Geni strutturali: codificano per le proteine di interesse • Operatore: Sito sul DNA riconosciuto dalla proteina repressore • Promotore: Sito sul DNA cui si lega l RNA polimerasi per iniziare la trascrizione dei geni situati a valle 8 23/04/14 La capacità dell RNA polimerasi di iniziare la trascrizione dipende dall assenza di impedimenti a livello dell’operatore; possono essere presenti dei repressori che impediscono l inizio della trascrizione: regolazione negativa Ex: 1. Escherichia Coli per sintesi TRIPTOFANO servono cinque enzimi, codificati da cinque geni appartenenti allo stesso operone (trp) 2. per trasformare l ALLOLATTOSIO in glucosio da utilizzare come fonte di energia sono necessari tre enzimi codificati da tre geni appartenenti allo stesso operone (lac) 9 23/04/14 Controllo negativo: l operon del triptofano VIA ANABOLICA, normalmente attiva (espressa), che viene inattivata o REPRESSA dalla presenza della molecola (il triptofano) che si forma per effetto delle attività enzimatiche. Repressore del Triptofano Si lega al DNA solo se associato a molecole di TRP Controllo negativo: l operon del triptofano 10 23/04/14 Controllo negativo: l operon del triptofano Regolazione della sintesi del triptofano: operone reprimibile 11 23/04/14 L operone Lac codifica per le proteine necessarie per importare e digerire il lattosio Si tratta di una VIA CATABOLICA, normalmente inattiva (non espressa), che viene attivata (INDOTTA) dalla presenza della molecola da degradare (il lattosio) Regolazione dell operone lac 12 23/04/14 L espressione genica può essere controllata anche tramite attivatori proteici EX. L operone Lac di E.Coli è controllato sia dal repressore Lac sia dall’attivatore CAP Devono associarsi con una seconda molecola per riuscire a legare il DNA: Ex. CAP lega cAMP prima di legare il DNA L operone Lac è controllato da due segnali La cellula deve metabolizzare il lattosio b-‐galattosidasi 13 23/04/14 Operone lattosio (lac) Geni inducibili Operone triptofano (trp) Geni reprimibili Il controllo dell’espressione genica negli eucarioti è molto più sofisticato che nei procarioti 14 23/04/14 Differenze della regolazione genica fra procarioti ed eucarioti • Dimensione e complessità del genoma • Compartimentazione del genoma • Organizzazione strutturale del genoma • Stabilità dell mRNA • Modificazione post-‐traduzionale delle proteine • Turnover delle proteine Livelli multipli di regolazione dell espressione genica degli eucarioti 15 23/04/14 Il controllo della trascrizione avviene a più livelli: • Pre-‐attivazione (Induzione di uno stato trascrizionalmente competente) • Inizio/re-‐inizio della trascrizione § Fattori di trascrizione legati a specifici promotori/enhancers § Co-‐attivatori (acetilasi degli istoni, attivita’ che rimodellano la cromatina) § Fattori “generali” di trascrizione (GTFs) e RNA polimerasi • Elongazione del trascritto • Terminazione del trascritto trascrizione dei geni eucarioti controllata da numerosi elementi TBP TFIIs Pol.II ery machin Basal tr. ~ -‐200 ENHANCER (~ 100 bp) TATA PROSSIMALE ~ -‐50 CORE PROMOTORE § La funzione principale dei fattori di trascrizione e’ di facilitare l’assemblaggio del macchinario basale di trascrizione sul promotore essenziale (core). § Questo avviene -‐ tramite reclutamento di GTF -‐ tramite reclutamento di HAT oppure rimodellamento cromatina -‐ tramite attivita’ acetilasiche intrinsiche 16 23/04/14 Il promotore essenziale (core promoter) • Determina il sito di inizio della trascrizione e dirige il legame dell’ RNA Pol II • I promotori essenziali più frequenti per l’RNA Pol II sono: – TATA box: la sua sequenza e’ altamente conservata (TATAAA); si trova prevalentemente in geni che vengono trascritti rapidamente, ed e’ localizzata ~25-‐30 bp a monte del sito di inizio della trascrizione. è la TATA box dirige l’inizio della trascrizione a siti ben definiti – Isole CpG: proprio di molti geni “house-‐keeping”. La trascrizione comincia a siti multipli disseminati in una regione di circa 20-‐200 bp. Inizio trascrizione richiede • Fattori di trascrizione generali (GTF) insieme con l’RNA Pol II formano l’apparato trascrizionale basale, che lega il promotore essenziale ed è sufficiente alla trascrizione in vitro – TBP + TAF forma -‐> TFIID – TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH • Fattori di trascrizione specifici, anche richiesti per la trascrizione attivata: servono per reclutare e assemblare l’apparato trascrizionale – Si legano a elementi di riconoscimento sul promotore e sull’enhancer nell’attivazione di un gene sono normalmente coinvolti multipli fattori di trascrizione 17 23/04/14 I meccanismi di controllo usati per regolare l espressione dei geni umani devono essere molto più complessi da quelli utilizzati dagli altri organismi. • Regolazione trascrizionale • Regolazione post-‐trascrizionale • Meccanismi epigenetici e controllo dell espressione genica a lunga distanza Controllo dell espressione genica a lunga distanza 1. attivatore si lega al DNA su enhancer (o intensificatore) 2. Si legano GTF 3. Il DNA si ripiega ad ansa 4. Legame attivatore con Mediatore 5. Si lega RNA polimerasi 18 23/04/14 Gli attivatori trascrizionali reclutano TFIID NB I fattori di trascrizione devono legarsi al promotore prima dell’RNA pol RNA pol inizierà la trascrizione in maniera dipendente dal legame di attivatori e repressori. Elementi distali Elementi prossimali Promotore basale 19 23/04/14 enhancers intensificano la trascrizione indipendentemente da orientamento (d, f), distanza (e) e posizione (g) 20 23/04/14 Gli enhancers o gli elementi di risposta legano fattori di trascrizione (TF) tessuto specifici e/o inducibili: responsabili delle regolazione genica differenziale nei vari tessuti Riassunto delle principali caratteristiche degli enhancers attivano l utilizzazione di un promotore, controllandone l efficienza e la velocità di trascrizione Non è necessario che siano posti sul lato 5 del gene (a monte) ma possono essere anche all estremo 3 , negli introni o anche nel filamento di DNA complementare Regolano l espressione genica in modo tempo-‐ e tessuto-‐specifico La maggior parte dei geni necessita di enhancer per essere trascritta sono i principali determinanti della trascrizione differenziale nello spazio (tipo cellulare) e nel tempo Un dato gene può avere più siti enhancers e ciascun enhancer può legare più fattori di trascrizione attivano la trascrizione: a) stabilizzando i TAF e quindi facilitando il legame della RNApol al promotore b) rimodellando la cromatina in modo da esporre il sito promotore 21 23/04/14 Sinergia e cooperazione tra molecole di fattori trascrizionali: concetto di enhanceosoma Sinergia TBP + TAFs=TFIID Enhanceosoma Cooperazione Il legame cooperativo porta all assemblaggio di strutture nucleoproteiche specifiche per ogni promotore: l enhanceosoma I geni eucariotici sono regolati da combinazioni di proteine: CONTROLLO COMBINATORIO 22 23/04/14 Repressori trascrizionali eucariotici 23 23/04/14 Repressori trascrizionali eucariotici Controlli post-‐trascrizionali Operano dopo che la RNA polimerasi si è legata al promotore del gene ed ha iniziato la sintesi di RNA 24 23/04/14 RIBOINTERRUTTORI (riboswitch) Brevi sequenze di RNA che cambiano conformazione in seguito a legame con piccole molecole Molto comuni nei batteri In assenza di G questa struttura a doppio filamento non si forma perché uno dei filamenti di RNA è accoppiato a con una regione del biointerruttore ESEMPI Proteina si lega all apposita sequenza di riconoscimento del ribosoma situata all inizio del gene mRNA della Listeria contiene sequenza di RNA termosensibile che controlla la traduzione di un gruppo di geni per la virulenza Nell uomo la T alta denatura sequenza termosensibile ed i geni si esprimono 25 23/04/14 -‐ Legame di una piccola molecola al biointerruttore -‐ riarrangiamento strutturale RNA -‐ sequestro sequenza di riconoscimento per il ribosoma -‐ NO trascrizione RNA antisenso complementare prodotto da un altro genesi appaia con mRNA specifico e blocca traduzione L’interferenza dell’RNA (o RNAi) Ė una forma di silenziamento genico mediata da un doppio filamento di RNA (dsRNA). In pratica… Ė un processo in cui un doppio filamento di RNA segnala la degradazione di un RNA messagero omologo. 26 23/04/14 Quale è la funzione biologica dell RNA interference? • L iRNA svolge un ruolo protettivo del genoma da situazioni di instabilità causate da transgeni e trasposoni. • Costituisce un meccanismo di difesa contro attacchi virali. • Regola l espressione genica (microRNA). Andrew Z. Fire Craig C. Mello 27 23/04/14 certe regioni genomiche codificano per alcune brevi molecole di RNA (dette genericamente microRNA), in grado di ripiegarsi a formare una forcina (short hairpin RNA, o shRNA). I miRNA sono trascritti da RNAPol II come precursori piu’ lunghi (pri-‐miRNA) con struttura a forcina, maturati nel nucleo a pre-‐miRNA ed esportati nel citoplasma 28 23/04/14 Nel citoplasma, i pre-‐miRNA vengono maturati a miRNA ad opera di nucleasi chiamate DICER: I miRNA maturi vengono inglobati in un complesso RISC (RNA-‐ Induced Silencing Complex), che svolge la doppia elica e viene guidato dal filamento anti-‐senso sull’mRNA bersaglio, inibendone la traduzione 29 23/04/14 Meccanismo d azione miRNA due modi diversi d agire a seconda della complementarietà che vi è tra il miRNA e il suo target 1. Complementarità imperfetta • bloccano l espressione dei loro geni target a livello post-‐trascrizionale • Per inibire la traduzione legano solitamente le regioni non tradotte al 3 (3 UTR), per le quali presentano omologia 2. Complementarità perfetta • legano i loro RNA bersaglio con complementarietà perfetta inducono il taglio del bersaglio che non può più essere tradotto • In questo caso i miRNA trovano la loro regione di omologia o nell ORF (open reading frame) o nella sequenza codificante microRNA (miRNA) 1. Un solo miRNA può regolare un intero gruppo di mRNA diversi con sequenze comuni 2. Gene che codifica miRNA occupa poco spazio nel genoma 3. Nell uomo oltre 400 miRNA diversi 30 23/04/14 Riassumendo miRNA: • La loro espressione e’ altamente regolata durante lo sviluppo • regolano l’espressione dei geni bersaglio a livello della traduzione, bloccando l’attacco del ribosoma -‐> non mediano la degradazione dell’RNA bersaglio (tranne che nelle piante) • L’omologia con l’RNA bersaglio e’ a livello della regione 3’UTR, e non e’ completa. Quando l’omologia e’ completa mediano DEGRADAZIONE DELL’RNA BERSAGLIO • Rappresentano un importante livello di regolazione dell’espressione genica! piccoli RNA interferenti (siRNA, small interfering DNA) rappresentano un altra classe di piccoli RNA non codificanti pur presentando numerose analogie con i miRNA in termini di struttura e biogenesi,svolgono funzioni essenzialmente diverse • siRNA si producono a partire da lunghe molecole di RNA prodotte da elementi genetici normalmente silenti o estranei alla cellula, quali trasposoni,virus o transgeni: un sistema di difesa contro l invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma • siRNA agiscono solo per complementarietà perfetta per cui ogni siRNA può avere un unico mRNA bersaglio • Diversamente, i miRNA costituiscono una numerosa classe di geni endogeni filogeneticamente conservati, la cui funzione è di inibire l espressione genica principalmente attraverso l inibizione della traduzione • Ogni miRNA, per il suo caratteristico meccanismo d azione può avere più di un mRNA bersaglio 31 23/04/14 livelli di regolazione dell espressione genica negli eucarioti NUCLEO Meccanismi epigenetici: controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina DNA controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita a elementi responsivi di geni inducibili Trascritto primario (precursore) controllo post-‐trascrizionale: splicing alternativo, polyA alternativo mRNA controllo del trasporto CITOPLASMA traduzione controllo traduzionale mRNA controllo della stabilità degradazione PROTEINA controllo post-‐traduzionale PROTEINA attiva o inattiva 32 23/04/14 Modificazioni epigenetiche La 5a Base… mCpG Modificazioni istoniche Variazioni stabili del DNA o degli istoni che influenzano l espressione genica, ma non consistono in variazioni della sequenza del DNA l’epigenoma è il risultato delle trasformazioni della cromatina che partecipano alle funzioni regolative del genoma trasformazioni della cromatina e non del DNA (la sequenza nucleotidica resta immutata) epigenoma riguarda le trasformazioni del genoma a livello cellulare epigenetica studia la trasmissibilità di queste trasformazioni nelle generazioni successive. • trasformazioni degli istoni della cromatina e metilazione del DNA • I due aspetti considerati sono interconnessi Queste trasformazioni influenzano il funzionamento del genoma tramite i cambiamenti della struttura della cromatina na non del contenuto del DNA (quindi epi-‐genetici) 33 23/04/14 CROMATINA • EUCROMATINA -‐> TRASCRIZIONE POTENZIALE a) geni housekeeping b) geni tessuto-‐specifici • ETEROCROMATINA FACOLTATIVA -‐> inattiva quando condensata. • ETEROCROMATINA COSTITUTIVA -‐> sempre inattiva; Localizzata nelle regioni peri -‐ e centromeriche Meccanismi epigenetici Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA. • Metilazione del DNA Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C. Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio della metilazione la C della doppietta CpG. • Modificazioni degli istoni Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina. 34 23/04/14 Metilazione del DNA La metilazione del DNA è un processo post-‐replicativo. L estensione delle modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite l inibizione dell espressione genica a livello trascrizionale. METILAZIONE DEL DNA NEI VERTEBRATI 35 23/04/14 MECCANISMO DI AZIONE DELLE DNMT Il quadro di metilazione del DNA viene ereditato Una volta stabilito, lo schema di metilazione viene mantenuto ad opera di DNA-‐metil transferasi che hanno particolare affinità per le sequenze emi-‐ metilate: tendono quindi a metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo metilato. -> mantenimento del pattern di metilazione (modificazione epigenetica - memoria cellulare) 36 23/04/14 Quali regioni sono bersaglio della metilazione? • Nel genoma umano la frequenza della sequenza 5 CpG è inferiore del 20 % rispetto all attesa a causa di un incremento della frequenza di mutazione: Le transizioni C-‐T avvengono 10-‐40 volte più spesso di altri eventi di mutazione. • I geni dei vertebrati attivamente trascritti sono marcati al 5 da ISOLE CpG: regioni in cui la frequenza 5 CpG è = a quella attesa nel DNA totale • Nel genoma umano il 50 % dei geni sono associati a isole CpG: tutti i geni hoisekeeping ed il 40 % dei geni con espressione tessuto-‐specifica • I geni tessuto-‐specifici sono metilati in CpG nei tessuti dove non sono espressi Modificazioni degli Istoni I residui amminoacidici all N-‐terminale di ciascun istone (20-‐60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma. Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e metilazione. 37 23/04/14 MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DEGLI ISTONI 5F3 Modificazioni degli istoni H3 e H4 La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. L acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina. 38 23/04/14 IL CODICE ISTONICO 5F4 L acetilazione degli istoni è associata alla decondensazione della cromatina 39 23/04/14 Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a livello di specifici geni Schema riassuntivo del controllo dell espressione genica 40
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