La mitosi è un processo dinamico che serve a separare copie identiche di cromatidi in due cellule figlie La progressione mitotica è associata a variazioni dinamiche della morfologia e del movimento dei cromosomi che si realizzano in 4 fasi, profase, metafase, anafase e telofase DNA damage associated with mitosis and cytokinesis failure - MT Hayashi and J Karlseder - Oncogene advance online publication, 14 January 2013; doi:10.1038/onc.2012.615 Il fallimento della mitosi genera cellule con anormale numero di cromosomi che possono diventare tumorigene e che quindi debbono essere rimosse dalla popolazione per evitare la formazione del cancro Le cellule che non riescono a portare avanti la mitosi attivano il programma genetico di morte cellulare (apoptosi) o percorsi di arresto del ciclo cellulare. Malfunzionamento durante la mitosi e la citodieresi portano alla generazione di danni al DNA DNA damage associated with mitosis and cytokinesis failure - MT Hayashi and J Karlseder - Oncogene advance online publication, 14 January 2013; doi:10.1038/onc.2012.615 Architettura e scorrimento del fuso dipendono dai microtubuli (MT) (a) dineina e kinesina-14 sono motori che si muovono verso l’estremità (-), e questo fa scorrere MT in parallelo verso i poli (b) i motori kinesina-5 sono diretti verso l’estremità (+) e possono far scorrere MT sovrapponendoli in modo antiparallelo e quindi spingere i poli verso due regioni opposte (c) la kinesina-13 ai poli depolimerizza i MT all’estremità (-) e contribuisce così al controllo della lunghezza del fuso (d-f) MT si possono nucleare in tre siti: nei centrosomi che formano i poli del fuso (d), nei cromosomi che vengono a trovarsi nel piano equatoriale in metafase (e) e nei complessi di augmina legati alle pareti del microtubuli preesistenti (f) Sett 2014 Sliding filaments and mitotic spindle organization - Nat Cell Biol. 2014 Aug;16(8):737-9. doi: 10.1038/ncb3019. Wang et al. Fuso mitotico: macchinario proteico che si autoorganizza e sfrutta vari team di generatori di forza (tra cui kinesine e dineine) per guidare la segregazione dei cromosomi Durante la profase, gran parte della coesina si dissocia dalle braccia dei cromosomi Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins - Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Apr;15(4):257-71. doi: 10.1038/nrm3768. Cross and McAinsh Mar 2014 Il motore della mitosi nelle cellule umane (a) Il movimento dei centrosomi (centrioli) duplicati verso i lati opposti del nucleo durante la profase della mitosi richiede assolutamente le kinesine della famiglia 11 (KIF11) (step 1), che spinge i microtubuli facendoli scorrere verso l’esterno. Al movimento dei cromosomi contribuiscono anche le dineine legate alla membrana nucleare (step 2) e alla membrana cellulare (step 3) contribuiscono a questo movimento dei cromosomi. (b) La prometafase inizia con frammentazione della membrana nucleare e il completamento della condensazione dei cromosomi. Il fuso bipolare si forma grazie alla cattura, scorrimento e riorientamento dei microtubuli (step 4) da parte di più motori molecolari. Le dineine e le KIFC1 si posizionano alle estremità dei microtubuli per formare i poli del fuso (step 5). La lunghezza del fuso viene mantenuta dal bilanciamento delle forze di scorrimento verso l'esterno e verso l'interno (step 6). I cinetocori sono inizialmente distaccati (tipo I) prima di formare attacchi bi-orientati (amphitelic; tipo IV), che possono essere preceduti da intermedi monotelici (tipo II), sintelici (tipo III) o laterali (tipo V). KIF10 guida i cinetocori ben agganciati verso l'equatore del fuso all’opposto delle dineine (step 7). I cromosomi bi-orientati (step 8) si muovono dalla piastra metafasica mediante trazione generata dalla depolimerizzazione (Pacman) al cinetocore del cromatide fratello. KIF2B e KIF2C promuovono la depolimerizzazione dei microtubuli, mentre KIF18A smorza la dinamica dei microtubuli. Anche KIF10 contribuisce ai movimenti del cinetocore. Le cromokinesine (per esempio, KIF22) generano una forza di espulsione polare (punto 9) che spinge le braccia dei cromosomi lontano dai poli, e la depolimerizzazione delle estremità meno (mediata da KIF2A e KIF2C) (step 10) spinge il flusso di microtubuli verso i poli esercitando un’ulteriore forza sui cinetocori. (c) Durante la metafase, la trazione e la spinta dai cinetocori (step 8), la forza di espulsione polare e del flusso verso i poli (step 9 e 10) portano i cromosomi ad oscillare all'equatore del fuso. (d) Durante l'anafase A, i cinetocori fratelli segregano verso i poli guidati dal movimento accoppiato alla depolimerizzazione (step 11) e dalla spinta del flusso dei microtubuli verso i poli (step 10). Nello stesso tempo il fuso si allunga (anafase B) attraverso lo scorrimento antiparallelo dei microtubuli sovrapposti (step 6) e la trazione corticale (step 3). Il fuso centrale (step 12) si assembla e modula l'allungamento del fuso man mano che l’anafase progredisce. Si sta cominciando a chiarire come un lungo filamento di DNA genomico sia compattato in un cromosoma mitotico. I cromosomi mitotici di cellule HeLa umane sono costituiti principalmente da fibre di cromatina irregolari piuttosto che da fibre di 30 nm. Il cromosoma mitotico sembra costituito da fibre irregolarmente disposte, con una natura frattale, che permette una organizzazione del genoma più dinamica e flessibile di quanto sarebbe consentito dalle strutture regolari statiche. Le condensine (blu) trattengono le fibre nucleosomiche (rosso) intorno al centro del cromosoma. Human mitotic chromosomes consist predominantly of irregularly folded nucleosome fibres without a 30-nm chromatin structure - EMBO J. 2012 Apr 4;31(7):1644-53. doi: 10.1038/emboj.2012.35. Epub 2012 Feb 17. Nishino et al. . Giu 2014 Centromeri = caratteristici dei cromosomi eucariotici, sono i siti di attacco per la segregazione durante la mitosi e la meiosi L’unità fondamentale della struttura del centromero è il nucleosoma centromerico, che differisce dal nucleosoma convenzionale per la presenza di uno specifico istone centromero (CenH3) al posto del canonico istone H3 La struttura ad emisomi dei nucleosomi centromerici può spiegare le proprietà enigmatiche dei centromeri, tra cui l'accessibilità del cinetocore, l’eredità epigenetica, il rapido turnover di CenH3 disincorporato, e la quiescenza trascrizionale dell’eterocromatina pericentromerica Il meccanismo di differenziazione tra i nucleosomi centromerici e gli altri nucleosomi si è forse evoluto da un ancestore Archaea-simile agli albori dell'evoluzione degli Eucarioti Structure, dynamics, and evolution of centromeric nucleosomes - (Dalal et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2007 Oct 9;104(41):15974-81. Epub 2007 Sep 24) Nella cromatina dei centromeri l’istone H3 è rimpiazzato da CENP-A In molti metazoi, gli istoni CENP-A restano nella cromatina durante la meiosi per far sì che i centromeri siano già pronti per quando avverrà la fecondazione L’istone CENP-A è una proteina con tre domini funzionali: (a) Il dominio CATD (CENP-A targeting domain) che lega il chaperon HJURP che lo aiuta nella sua localizzazione sulla cromatina centromerica; (b) una volta legato alla cromatina centromerica, il dominio (CAC) dirige l’assemblaggio del cinetocore reclutando CENP-C; (c) ulteriore CENP-C verrà reclutato da CENP-B che si lega all’N-terminale di CENP-A fornendo un pathway altrernativo per la formazione del cinetocoro. Swapping CENP-A at the centromere - Nat Cell Biol. 2013 Sep 2;15(9):1028-30. doi: 10.1038/ncb2833 - French BT, Straight AF. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins - Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Apr;15(4):257-71. doi: 10.1038/nrm3768. Cross and McAinsh Per evitare la separazione prematura dei cromatidi fratelli, il checkpoint del fuso (SAC) che controlla la progressione mitotica rimane attivo fino alla metafase (cromosomi allineati nella piastra equatoriale) Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins - Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Apr;15(4):257-71. doi: 10.1038/nrm3768. Cross and McAinsh DNA damage associated with mitosis and cytokinesis failure - MT Hayashi and J Karlseder - Oncogene advance online publication, 14 January 2013; doi:10.1038/onc.2012.615 Centromeri : struttura di assemblaggio del cinetocore in cui si ha il contatto tra il cromosoma e fuso mitotico. Centromeri e cinetocori difettosi portano ad instabilità cromosomica ed aneuploidia per diminuzione di numero Swapping CENP-A at the centromere - Nat Cell Biol. 2013 Sep 2;15(9):1028-30. doi: 10.1038/ncb2833 - French BT, Straight AF. All’inizio dell’anafase, la proteolisi della subunità Scc1 apre gli anelli di coesina permettendo la separazione dei cromatidi fratelli Il complesso di promozione dell’anafase (APC), una ubiquitina ligasi, induce la distruzione della ciclina B e della securina La distruzione della ciclina B inattiva CDK1 che inibisce le reazioni necessarie per completare la mitosi, mentre la distruzione della securina attiva la separasi che taglierà la coesina che tiene uniti i cromatidi fratelli DNA damage associated with mitosis and cytokinesis failure - MT Hayashi and J Karlseder - Oncogene advance online publication, 14 January 2013; doi:10.1038/onc.2012.615 Fino alla metafase => fosforilazione Della fine della metafase => defosforilazione In anafase, i cromatidi fratelli sono allontanati dalla forza del macchinario mitotico, i microtubuli si decondensano quando raggiungono i poli opposti della cellula, dando avvio alla telofase con la riformazione della membrana nucleare attorno ad essi DNA damage associated with mitosis and cytokinesis failure - MT Hayashi and J Karlseder - Oncogene advance online publication, 14 January 2013; doi:10.1038/onc.2012.615 CITODIERESI Decisione binaria tra la vita e la morte • apoptosi riconosciuta per l’arrotondamento delle cellule, la frammentazione del DNA, l'esternalizzazione della fosfatidilserina, l’attivazione delle caspasi e l'assenza di reazione infiammatoria • autofagia, caratterizzata dalla formazione di grandi vacuoli e dal fatto che le cellule possono ancora recuperare fino a stadi molto avanzati di tale processo • necrosi, associata a rigonfiamento della cellula e rottura della membrana con rilascio incontrollato del contenuto cellulare, forte risposta infiammatoria. La necroptosi è una morte cellulare in assenza di caspasi La morte della cellula è raramente accidentale I vari compartimenti cellulari (nucleo, mitocondri, membrana plasmatica, reticolo endoplasmatico, apparato di Golgi, lisosomi, citoscheletro e citosol) percepiscono le perturbazioni omeostatiche e le traducono in segnali che attivano i processi di morte cellulare Se lo stimolo viene eliminato la cellula sopravvive, altrimenti attiva uno dei programmi di morte cellulare programmata CASPs, caspases; MLKL, mixed-lineage kinase domain-like; CYPD, cyclophilin D; MPT, mitochondrial permeability transition; PARP1, poly(ADP-ribose) polymerase 1. Cell-death-inhibitory factors are shown in blue. Sett 2014 NUCLEO - Rotture del DNA: della doppia elica sono riconosciute dalle ATM, della singola elica dalle ATR. Si attivano varie vie, la più studiata è quella della p53 che induce un arresto temporaneo del ciclo cellulare per permettere il ristabilimento dell’omeostasi; se non viene raggiunta si attiva l’apoptosi MEMBRANA CELLULARE LISOSOMI permeabilizzazione e morte cellulare per apoptosi e varie forme di necrosi New frontiers in promoting tumour cell death: targeting apoptosis, necroptosis and autophagy - Oncogene. 2012 Dec 6;31(49):5045-60. doi: 10.1038/onc.2012.7 - Long JS, Ryan KM. L’apoptosi diventa irreversibile quandi si attivano le DNAsi CAD che frammentano l’eucromatina tagliando il DNA nelle regioni internucleosomiche APOPTOSI è una morte cellulare programmata, esecuzione di un programma genetico ordinato che richiede trascrizione e traduzione la cellula in apoptosi si frammenta in corpi apoptotici che sono fagocitati dai fagociti APOPTOSI : quando? nel corso dello sviluppo embrionale/fetale, l’apoptosi rimuove le cellule indesiderate; per esempio quelle della membrana interdigitale, circa metà delle cellule del cervello per consentire il differenziamento dei neuroni, i linfociti che possono aggredire il “self” nelle cellule dei tessuti che si rinnovano, come il sangue e gli epiteli, ’apoptosi è l’autoeliminazione delle cellule vecchie e non più utili l alcune cellule difensive si sacrificano nell’espletamento della loro funzione di protezione del corpo, ad esempio i granulociti neutrofili o i linfociti le cellule infettate da virus impediscono la diffusione del contagio ad altre cellule attivando il programma genetico dell’apoptosi l’apoptosi interviene nel ricambio ciclico delle cellule dell’endometrio uterino, del corpo luteo, dell’epitelio della ghiandola mammaria Shaping organisms with apoptosis - Cell Death Differ. 2013 May;20(5):669-75. doi: 10.1038/cdd.2013.11 - Suzanne M, Steller H. L’apoptosi permette di rimuovere cellule e tessuti superflui, come organi larvali durante la metamorfosi, cellule durante lo sviluppo del sistema nervoso, per guidare la formazione del corretto pattern muscolare e la morfogenesi del cuore Escherichia coli trattata con antibiotici genera di ROS ed attiva un meccanismo di morte che ha i segni chiave dell’apoptosi Evoluzione dell’apoptosi dai Procarioti agli Eucarioti e non la sua improvvisa scoperta negli organismi pluricellulari. Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis Dwyer, D. J. et al. - Mol. Cell 24 May 2012 (doi:10.1016/j.molcel.2012.04.027) Nel caso di stimoli fisiologici o di danni eccessivi, le cellule attivano apoptosi o senescenza, evitando in tal modo la proliferazione di cellule potenzialmente tumorali L'autofagia è attivata da situazioni stressanti come fame e stress ossidativo, regola il destino delle cellule dopo il danno al DNA ed ha anche un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'integrità genomica nucleare e mitocondriale e nel prevenire l'instabilità genomica e tumorigenesi Autophagy and genomic integrity - Cell Death and Differentiation (2013) 20, 1444–1454; doi:10.1038/cdd.2013.103 – Vessoni et al. L’autofagia è una via di degradazione lisosoma-dipendente controllata dalla famiglia di geni atg e modulata da diverse chinasi (mTOR, PI3K/AKT, AMPK e MAPK, …). I prodotti della degradazione autofagica consentono il riciclaggio di componenti danneggiate o non funzionanti, rimuovendo dall’interno della cellula gli aggregati disfunzionali Autophagy and genomic integrity - Cell Death and Differentiation (2013) 20, 1444–1454; doi:10.1038/cdd.2013.103 – Vessoni et al. • Le cellule sane utilizzano l'autofagia come un meccanismo generale di pulizia e di sopravvivenza allo stress. • L'autofagia inizia con la crescita di una membrana di isolamento per l'azione coordinata delle proteine ATG: ne risulta la formazione dell'autofagosoma. L’autofagosoma si forma rapidamente e si fonde con i lisosomi. Disregolazione dell’autofagia si osserva in varie patologie umane, quali malattia di Crohn, cancro e neurodegenerazione. MVB =MultiVesicular Body Alcuni miRNA regolano l’espressione di proteine necessarie per l’autofagia The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013 Dec;14(12):759Nov 2013 74. Epub 2013 Nov 8. Lamb et al. .The return of the nucleus: transcriptional and epigenetic control of autophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Jan;15(1):65-74. doi: 10.1038/nrm3716. Epub 2013 Dec 11 Gen 2014 Füllgrabe et al. • Autofagia e apoptosi spesso si escludono a vicenda: l’induzione dell’autofagia blocca l’induzione dell’apoptosi, le caspasi attivate nel corso dell’apoptosi bloccano il processo autofagico • In alcuni casi i due processi coesistono portando ad una morte per autofagia • La P53 nel citosol inibisce l’autofagia, quando trasloca nel nucleo attiva geni per l’autofagia e successivamente l’apoptosi, quando migra sui mitocondri induce mitofagia ed apoptosi DISC, death-inducing signalling complex; PTP, permeability transition pore. Self-consumption: the interplay of autophagy and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Feb;15(2):81-94. doi: 10.1038/nrm3735. Epub 2014 Jan 8. Mariño et al. Gen 2014 Due forme di autofagia, mitofagia e xenofagia, sono attivate da Parkin (una ubiquitina ligasi) che media la resistenza a patogeni intracellulari: (a) il processo di mitofagia inizia quando PINK1 (e ROS) reclutano Parkin avviando l’ubiquitinazione delle proteine mitocondriali e l’autofagia dei mitocondri ubiquitinati, che vengono impacchettati in autofagosomi che si fondono con i lisosomi per formare un lisosoma secondario dove i mitocondri vengono digeriti; (b) Parkin costituisce il collegamento tra mitofagia e xenofagia, anch’essa dipendente dalla presenza di ROS e dal legame di Parkin a fagosomi contenenti agenti patogeni intracellulari ingeriti (come il batterio Mycobacterium tuberculosis e la Salmonella Typhimurium). Non è noto come Parkin si leghi ai fagosomi, ma una volta legato, Parkin ubiquitina alcune proteine, indirizzando il fagosoma verso la distruzione lisosomiale. Cell biology: A table for two - Nature. 2013 Sep 26;501(7468):498-9. doi: 10.1038/nature12555 - Behr MA, Schurr E. Necrosi (Necroptosi= morte cellulare senza caspasi) Le due protein kinasi RIPK1 e RIPK3 sono essenziali per la necrosi indotta da recettori di morte (DR), mentre RIPK1 da sola è implicata nella segnalazione di sopravvivenza In vivo, la necrosi programmata si verifica principalmente in processi fisiopatologici quali danno per ischemia-riperfusione a cuore-cervello-reni, infezione virale, sepsi e pancreatite, ed è inoltre in grado di uccidere cellule tumorali che hanno sviluppato strategie per eludere l’apoptosi The flick of a switch: which death program to choose? - Vandenabeele & Melino - Cell Death and Differentiation (2012) 19, 1093–1095; doi:10.1038/cdd.2012.65 La trogocitosi esiste a livello del sistema immunitario ma anche di alcuni parassiti come l’ameba Entamoeba histolytica Le cellula bersaglio viene letteralmente uccisa “a morsi” Infection biology: Nibbled to death. -Nature. 2014 Apr 24;508(7497):462-3. doi: 10.1038/nature13223. Epub 2014 Apr 9 - Guillén N. Apr 2014 La necrosi può essere un processo altamente regolato Oltre alla necroptosi mediata da RIPK1 (receptor-interacting protein kinase 1) e RIPK3-MLKL (mixed lineage kinase domainlike), si stanno scoprendo altri meccanismi di necrosi regolata, quali ferroptosis, parthanatos (indipendente dalle caspasi), pyroptosis, … Conoscere I dettagli di questi meccanismi potrebbe guidare interventi terapeutici Gen 2014