Mattana - VeLiCa

Caratterizzazione di
composti bioattivi da
canapa e lino
Milano, Palazzo Pirelli, 3 febbraio 2014
Monica Mattana
Istituto di Biologia e Biotecnologia
Agraria CNR-IBBA
Regione Lombardia – Accordo Istituzionale n.14840/RCC 2011-2013
Metaboliti primari e secondari
METABOLITA PRIMARIO
METABOLITA SECONDARIO
composto sintetizzato da ogni cellula di un
organismo vivente, è essenziale alla vita e alla
sopravvivenza della cellula stessa:
composto sintetizzato principalmente da cellule
vegetali a partire dalle vie del metabolismo primario,
che non è fondamentale per la vita e la sopravvivenza
della cellula ma che concorre alla sopravvivenza e
all’adattamento dell’intero organismo nell’ambiente
in cui lo stesso si trova.
Spesso è specie-specifico.
PROTEINE, ZUCCHERI, LIPIDI, ACIDI NUCLEICI.
DIFESA DA STRESS AMBIENTALI, PATOGENI, ERBIVORI
RESPONSABILI DEL COLORE E PROFUMO
FENILPROPANOIDI, TERPENI, ALCALOIDI
Uso dei metaboliti secondari
STORIA:
•Lascaux caves (Francia): Pitture rupestri di piante usate
come rimedi terapeutici (25000 – 13000 a.C.)
• Sumeri (5000 a.C.): Prima testimonianza scritta
sull’uso di timo e alloro quali rimedi curativi
• I popoli antichi usavano estratti di piante medicinali
come antitosse, sedativi, veleni…
•Socrate nel 399 a.C. bevve un estratto di cicuta
contenente coniina
•La regina Cleopatra usava estratti contenenti
iosciamina per dilatare le pupille e apparire più
Atropa belladonna
attraente agli occhi dei suoi rivali
Conium maculatum
Oggi circa il 75% dei medicinali e il 60% dei medicinali anticancro
sono prodotti naturali o loro analoghi
CANAPA e LINO
Obiettivi
Caratterizzare diverse cultivar di Canapa e Lino per la produzione di metaboliti secondari mediante:
 valutazione dell’espressione e dell’attività di geni ed enzimi della via biosintetica dei fenilpropanoidi
 analisi dei metaboliti prodotti
Gene
Analisi di espressione genica mediante qPCR
Proteina
Analisi delle attività enzimatiche
Metabolita
Analisi dei metaboliti secondari
La via dei fenilpropanoidi
O
OH
Biosintesi lignine e lignani
NH2
L-Fenilalanina
Via biosintetica
fenilpropanoidi
CH3
PAL
CH3
O
OH
O
O
OH
HO
OH
HO
Ac. trans cinnamico
COMT
HO
O
TAL
CH3
HO
O
HO
HCT+C3H+
CCaOMT+ …..
Feruloil-CoA
O
SCoA
HO
CHS + CHR
+
HO
HO
STS
CCRD+
CAD+
…..
OH
OH
OH
HO
O
Tri-idrossi-calcone
OH
resveratrolo
OH
O
Tetra-idrossi-calcone
isoflavonoidi
flavoni
flavonoli
flobafeni
CH3
Siringil lignina
OH
HO
Sinapoil-CoA
O
3- malonil CoA
CHS
OH
SCoA
p-idrossi-fenil lignina
CCRD+ CAD+ ?
p- cumaroil CoA
F5H +COMT
CCRD+
CAD+
…..
Guaiacil lignina
4CL
Biosintesi flavonoidi
Ac. sinapico
O
SCoA
NH2
Ac. p- cumarico
CH3
O
O
OH
CH3
4CL
4CL
O
O
F5H +COMT
Ac. ferulico
C4H
OH
O
O
antociani, tannini condensati
Studio della via dei fenilpropanoidi in canapa e lino
Set up sperimentale Canapa:
• Varietà: Fedora, Fibranova, Ferimon, Futura, Carmagnola, Felina e Cs
• Tessuti: Foglie da piante adulte e semi
• Analisi di espressione dei geni: PAL, 4CL e CHS mediante qPCR
• Analisi delle attività enzimatiche dei corrispondenti prodotti genici
• Preparazione di estratti di foglie e semi per analisi NMR
Set up sperimentale Lino :
• Varietà: Linoal, Valoal, Natural, Festival, Merlin, Solal, Kaolin
• Tessuti: Foglie da piante adulte e semi
• Analisi di espressione dei geni: PAL e 4CL mediante qPCR
• Analisi delle attività enzimatiche dei corrispondenti prodotti genici
• Preparazione di estratti di foglie e semi per analisi NMR
CANAPA – Foglie: espressione genica
C4H
Acido p-cumarico
4CL
4 Cumaroil CoA+ Malonil CoA
CHS
6
4
2
Relative expression
Acido cinnamico
4CL
PAL
Relative expression
PAL
8
8
Fenilalanina
Naringenina calcone
• Futura: miglior genotipo per livello di espressione
• Le attività enzimatiche presentano una minor
variabilità tra le cultivar
4
2
0
0
8
Relative expression
Flavonoidi
6
6
4
2
0
CHS
CANAPA – Foglie: metaboliti identificati
A: apigenina-7-glucoside
L: luteolina-7-glucoside
A
A,L
A
A
A
L
L
L
L
Canapa var. Futura: geni e metaboliti
Rad.
Fusto
F.G.
Fenilalanina
mg G-1 DM
Lignin content
PAL
40
Acido cinnamico
35
C4H
F.M.
30
Lignine
Acido p-cumarico
25
4CL
20
4 Cumaroil CoA+ Malonil CoA
15
CHS
10
1: trigonellina, 2: formiato, 3: apigenina-7-O-glucoside, 4: citidina, 5: n.d., 6: luteolina-7-O-glucoside, 7: fumarato, 8: n.d., 9: n.d.
Naringenina calcone
5
0
Flavonoidi
Docimo T., Consonni R, Coraggio I, Mattana M.,“Early Phenylpropanoid Biosynthetic Steps in Cannabis sativa: Link between Genes and
Metabolites”. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 13626-13644
CANAPA – semi: espressione genica
6
12
5
PAL
8
6
4
2
0
Relative expression
Relative expression
10
4CL
4
3
2
1
0
• Carmagnola presenta il livello di espressione dei geni più alto
rispetto alle altre varietà
•Le attività di PAL e 4CL seguono lo stesso andamento dei geni
Relative expression
8
CHS
6
4
2
0
Proprietà Nutraceutiche dei Semi
Fibranova
Carmagnola
Carmagnola
Contenuto Fenolico totale:
Test di Folin-Ciocalteu
30
Futura
Felina
Fedora
Mg Ac.Gallico/kg estratto
Contenuto in flavonoidi:
Test con sodio nitrito
120
Mg Rutina/kg estratto
Ferimon
Futura
Potere antiossidante:
Test con DPPH
0,3
25
100
0,25
20
80
0,2
15
60
0,15
10
40
0,1
5
20
0,05
0
0
Semi Treviglio Semi Cavriana
Carmagnola
Felina
IC50
0
Semi Treviglio Semi Cavriana
Semi Treviglio Semi Cavriana
Metodica
Semi macinati degrassati
Analisi HPLC-MS
Estrazione in MeOH/H2O (8:2)
80°C – 3 h x 3 volte
Evaporazione del solvente
Confronto HPLC con
standard autentici
Frazioni arricchite
Analisi 1H e 13C NMR
Mono e bidimensionale
(prodotti puri o in miscela)
Separazione in colonna
(Sephadex LH-20)
PRODOTTI NOTI
CARBOIDRATI
α-Glucosio
β-Glucosio
Saccarosio
Xilosio
Arabinosio
Ribosio
Mioinositolo
Acido Galatturonico
ACIDI GRASSI
Acido Oleico
Acido Linoleico
Acido Linolenico
ALCALOIDI
Trigonellina
AMINOACIDI
Valina
Alanina
Glutammato
LIGNANAMIDI
Cannabisina A
Cannabisina E
Cannabisina F
Cannabisina G
AMMIDI FENOLICHE
N-trans-caffeoiltiramina
N-trans-feruloiltiramina
N-trans-coumaroiltiramina
Nuovi prodotti
SINTESI TOTALE:
DEMETIL-CANNABISINA G
CANNABISINA G-LIKE
SINTESI IN CORSO:
DEMETIL-CANNABISINA F
CANNABISINA A RIBOSIDE
Lino: espressione genica e attività enzimatica
FOGLIE
•L’espressione di 4CL risulta simile nelle
varietà analizzate.
4CL
PAL
• Le attività enzimatiche rispecchiano
l’andamento dei relativi messaggeri.
2,5
2
1,5
1
0,6
0,4
0,2
0
0
18
16
Relative expression
•Il trascritto per 4CL non è stato rilevato nella
maggior parte delle varietà in esame.
0,8
0,5
SEMI
•Il gene PAL risulta maggiormente espresso in
Solal e Valoal.
1
Relative expression
più elevato rispetto alle altre varietà.
1,2
3
Relative expression
• Valoal: livello di espressione di PAL
3,5
14
PAL
4CL
12
10
8
6
4
2
0
Linoal Valoal NaturalFestival Merlin Solal Kaolin
LINO – Foglie: metaboliti identificati
-tocoferolo
-tocoferolo
esperidina
esperidina
LINO – Foglie: varietà analizzate
linoal
solal
kaolin
festival
valoal
natural
merlin
Caratteristiche dei composti identificati
Esperidina:
Flavonoide degli agrumi, proprietà
antiossidanti e antiflogistiche
Luteolina:
Flavonoide di carote, sedano, peperone
ed erbe aromatiche con proprietà antiox,
antinfiammatorie e anticancro
Apigenina:
Flavonoide di sedano, prezzemolo, cipolla,
camomilla, proprietà antiox, anticancro,
antivirali, fitoestrogeniche
Caffeoiltiramina: Ammide fenolica, proprietà antiossidanti
Cannabisine: Lignano ammidi con potenziale attività citotossica
Conclusioni e Prodotti della Ricerca
Canapa
• Foglie: dai dati ottenuti la varietà Futura risulta la migliore
• Metaboliti identificati: Apigenina e Luteolina
• Semi: dai dati ottenuti la varietà Carmagnola risulta la migliore
• Metaboliti identificati: Cannabisine, ammidi fenoliche
Lino
• Foglie: dai dati ottenuti la varietà Valoal risulta la migliore
• Metaboliti identificati: Tocoferolo ed Esperidina
Prodotti
• Registrazione sequenze PAL e 4CL da canapa in EMBL database
• Pubblicazione peer-review: Docimo et al., Int. J. Mol. Sci., 2013.
• Comunicazione al XIII Congresso della Società di fitochimica italiana
Prospettive e applicazioni
Lo studio effettuato sulla via biosintetica dei fenilpropanoidi in queste specie
permette di selezionare varietà per un utilizzo biotecnologico
Carta
Fibra tessile
Cibo
Oli essenziali
Farmaci
Edilizia
Nutraceutica/additivi alimentari
Progetto Filagro
ottimizzare la produzione di composti bioattivi da colture cellulari di canapa e lino
Ringraziamenti
CNR-IBBA
Teresa Docimo (Assegnista)
Immacolata Coraggio
Franca Locatelli
Annamaria Genga
NMR - Lab
Roberto Consonni
Laura Ruth Cagliani
Dipartimento di Chimica
Giordano Lesma
Claudia Remuzzi
Vito Vece (Assegnista)
Alessandra Silvani
Gabriella Roda
Grazie per l’attenzione

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