Lezione (5) XV 28.04.14 Peptidasi 2

Continua
Peptidasi
H 2O
APPLICAZIONI INDUSTRIALI
Gli enzimi sono molto utilizzati nell'industria chimica e in altre applicazioni
industriali che richiedono catalizzatori estremamente specifici.
Le principali limitazioni al loro impiego sono la scarsa stabilità in un solvente
differente da quello biologico e - ovviamente - il numero limitato di reazioni per
cui l'evoluzione ha messo a punto enzimi efficaci.
Di seguito viene riportato un elenco di settori/applicazioni in cui vengono
impiegati enzimi.
Successivamente gli enzimi verranno discussi in base alla classe di appartenenza
(in base al meccanismo d’azione)
Tabella 1. Alcune applicazioni di enzimi .
SETTORE APPLICAZIONE
Panificazione
Alimenti per
neonati
Industria
alimentare
Birrificazione
ENZIMI
Fonte: Wikipedia Enzima
FUNZIONI
Catalizzano la conversione dell'amido presente
nella farina in zuccheri semplici. Utilizzate nella
α-amilasi fungine
produzione di pane in genere, si inattivano
intorno ai 50 °C e sono dunque distrutte
durante il processo di cottura.
Proteasi
I produttori di biscotti le utilizzando per ridurre
la concentrazione di proteine nella farina.
Tripsina
Proteasi utilizzata per predigerire gli alimenti
destinati ai neonati.
Degradano amido e proteine producendo
Enzimi contenuti
zuccheri semplici, amminoacidi e brevi peptidi,
nell'orzo.
utilizzati dai lieviti per la fermentazione.
Enzimi dell'orzo
Largamente utilizzati per la birrificazione
prodotti
industriale come sostituto degli enzimi naturali
industrialmente.
dell'orzo.
Amilasi, glucanasi e Degradano i polisaccaridi e le proteine del
proteasi
malto.
Beta glucosidasi
Ottimizza il processo di filtrazione.
Permette la produzione di birre a basso
Amiloglucosidasi
contenuto calorico.
Rimuovono la torbidezza che si genera durante
Proteasi
la conservazione delle birre.
SETTORE APPLICAZIONE
Succhi di frutta
ENZIMI
UTILIZZATI
Cellulasi, pectinasi
Rennina
Industria
casearia
FUNZIONI
Chiarificano i succhi di frutta
Derivata dallo stomaco di giovani ruminanti
(come vitelli e agnelli), è usata nella manifattura
di formaggi per idrolizzare proteine.
Vari enzimi prodotti
Il loro impiego è crescente nel settore.
da microrganismi
Utilizzata nella produzione di formaggi come il
Lipasi
Roquefort.
Lattasi
Degradano il lattosio a glucosio e galattosio.
Industria
Con la sua azione proteolitica, ammorbidisce la
alimentare Intenerimento Papaina
carne per la cottura.
della carne
Amilasi,
amiloglucosidasi e Convertono l'amido in glucosio (molto utilizzati
glucoamilasi
nella produzione di sciroppi).
Trattamento
dell'amido
Glucosio isomerasi
Converte il glucosio in fruttosio, per la
produzione di sciroppi ad alta concentrazione di
fruttosio (che, rispetto al saccarosio, presenta
alte caratteristiche dolcificanti e basso
contenuto calorico).
SETTORE
Industria cartiera
Produzione di
biocarburanti
Detersivi
ENZIMI UTILIZZATI
Amilasi, xilanasi,
cellulasi e ligninasi
Cellulasi
FUNZIONI
- Le amilasi favoriscono la degradazione
dell'amido, al fine di ottenere una viscosità
inferiore.
- Le xilanasi favoriscono lo sbiancamento della
carta.
- Le cellulasi ammorbidiscono le fibre.
- Le ligninasi rimuovono la lignina per rendere
la carta più morbida.
Utilizzate per degradare la cellulosa in
zuccheri semplici utilizzabili perle
fermentazioni.
Soprattutto proteasi,
in una specifica
Utilizzate nelle fasi di prelavaggio, con
isoforma in grado di applicazione diretta sulle macchie di natura
funzionare all'esterno proteica.
delle cellule.
Utilizzate per il lavaggio di stoviglie con
Amilasi
macchie particolarmente resistenti di amido e
derivati.
Utilizzate per ottimizzare la rimozione di
Lipasi
macchie di unto e grassi di vario tipo.
SETTORE
Pulizia delle lenti a
contatto
ENZIMI UTILIZZATI
FUNZIONI
Permettono la rimozione di varie proteine
Proteasi
dalle lenti, per prevenire eventuali
infezioni.
Consente la produzione di ossigeno a
Produzione di gomma Catalasi
partire dal perossido, per convertire il
lattice in gomma schiumosa.
Degradano la gelatina presente sulle
Fotografia
Proteasi (ficina)
pellicole di scarto per il recupero del
contenuto di argento.
Enzimi di
Utilizzate per la manipolazione del DNA
Biologia molecolare restrizione, DNA nelle tecniche di ingegneria genetica. Ampi
ligasi e polimerasi utilizzi in farmacologia, agricoltura e
medicina (tra cui la medicina forense).
Applicazioni industriali delle cistein-proteasi
Produzione di birra e bevande alcoliche
Durante la preparazione della birra vengono aggiunti diversi ingredienti che
possono formare complessi proteici insolubili che intorbidiscono il prodotto,
soprattutto quando questo viene raffreddato.
Il trattamento con enzimi proteolitici quali papaina o bromelina consentono
alla birra di rimanere limpida quando viene raffreddata.
Industria dei prodotti da forno
Le proteasi vengono utilizzate perché consentono di preparare l’impasto più
velocemente, in quanto il glutine viene parzialmente idrolizzato. Evitano il
ritirarsi dell’impasto; permettono di avere una doratura più uniforme.
La proteasi più utilizzata è la bromelina, che ha un ampio intervallo di pH
ottimale (6-8,5) e temperature ottimali di reazione tra 50-60 °C.
Trasformazione dei prodotti alimentari
L’idrolisi delle proteine alimentari (animali o vegetali) viene realizzata per
differenti motivi:
1. Aumentare le caratteristiche nutrizionali (morbidezza, tenerezza)
2. Ritardare il deterioramento
3. Modificare varie proprietà funzionali (solubilità, schiumabilità, coagulazione
e proprietà emulsionanti)
4. Prevenire interazioni indesiderate
5. Modificare odore o sapore
6. Rimuovere fattori tossici o inibenti
L’idrolisi enzimatica viene preferita a quella chimica in quanto porta alla
formazione di idrolizzati contenenti miscele di peptidi ben conosciute e
impedisce la distruzione parziale o totale di determinati amminoacidi e la
formazione di sostanze tossiche.
Le cistein-proteasi più utilizzate sono papaina e bromelina.
Gli idrolizzati di pesce, uova e vegetali non solo favoriscono la formazione
di ottimi aromi, ma anche l’assimilazione delle proteine.
Le caseine e le proteine del siero sono i substrati proteici più importanti in
natura:
1. l’idrolisi delle proteine del siero riduce la loro tendenza a schiumare;
2. L’idrolisi delle proteine del latte riduce l’allergenicità dei derivati del latte;
3. Gli idrolizzati proteici del latte vengono utilizzati nelle bevande energizzanti,
nei cibi per l’infanzia, per la nutrizione parenterale e nei prodotti dietetici.
Le proteasi vengono utilizzate per aumentare la tenerezza della carne,
attraverso la rottura dei legami crociati delle proteine fibrose (collagene ed
elastina)  papaina, bromelina o ficina, che vengono spruzzate sulla superficie
della carne.
La carne degli animali più vecchi può essere resa più tenere iniettando la
papaina inattiva nella vena giugulare degli animali vivi poco prima della
macellazione  con la morte dell’animale si accumulano gruppi tiolici nel
muscolo, che attivano la papaina, intenerendo la carne.
Aspartico-proteasi
Il principale utilizzo delle aspartico-proteasi (AP) si ha nell’industria lattierocasearia.
La coagulazione enzimatica del latte avviene i due fasi:
1. Le aspartico-proteasi idrolizzano il legame Phe105-Met106 della k-caseina,
dividendo la proteina in due: la para-k-caseina, idrofobica, e il caseinomacropeptide, idrofilico.
2. Le micelle di caseina coagulano a causa della destabilizzazione provocata
dall’attacco proteolitico.
Gli enzimi per la coagulazione del latte si ottengono da mammiferi (vitelli,
ovicaprini lattanti o maiale), piante (fico e carciofo-caciofiore) e funghi (estratti
da una muffa (Mucor miehei)*, sono coagulanti economici e di qualità inferiore a
causa dell’attività proteolitica meno specifica) ma possono anche essere prodotti
con la tecnologia del DNA ricombinante.
Gli enzimi estratti dal quarto stomaco (abomaso) dei vitelli da latte (caglio o
presame) sono quelli tradizionalmente usati (è l'unico permesso per la
produzione di tutti i formaggi DOP come Parmigiano Reggiano, Grana Padano,
Caciocavallo Silano, Pecorino Romano o il Castelmagno e il Pecorino di Farindola).
In aggiunta alla chimosina, la miscela di enzimi contiene anche pepsina A.
*
Tecnologia del DNA ricombinante.
Le aspartico-proteasi (EC 3.4.23.X) esibiscono una gran numero di attività e
specificità.
Sono coinvolte in numerose funzione fisiologiche
1. Digestione dei nutrienti nei mammiferi (chimosina, pepsina A)
2. Difesa contro i patogeni
3. Virulenza dei lieviti (candidopepsina)
4. Metastasi del cancro al seno (catepsina D)
5. Interazioni polline-pistillo (cardosina A)
6. Controllo della pressione sanguigna (renina)
7. Degradazione dell’emoglobina da parte di parassiti (plasmepsina
di Plasmodium
falciparum che taglia l’emoglobina tra i residui Phe 33- Leu 34 della subunità α-globina )
8. Maturazione delle proteine dell’HIV (retropepsina)
Strutturalmente, appartengono alla famiglia della pepsine A1.
Sono sintetizzate come pre-pro-enzimi: dopo il taglio del peptide segnale, il proenzima viene secreto e attivato da una auto-catalisi.
SP
P
M
Strutturalmente, sono costituite da:
1. singola catena polipeptidica di 320-360
amminoacidi
2. Peso molecolare 32-36 kDa
3. Struttura terziaria  soprattutto
foglietti
b,
arrangiati
in
una
conformazione bilobata (i due lobi sono
omologhi).
SP  peptide segnale
P  pro-segmento
M  enzima maturo
Il sito catalitico è localizzato tra i due lobi e contiene due residui di aspartato
(uno in ogni lobo), essenziali per la catalisi.
In molti degli enzimi appartenenti alla famiglia delle pepsine,
i residui di Asp si trovano in un motivo Asp-Thr-X, dove la X è una Ser o una Thr.
I residui di Asp attivano una molecola d’acqua che media l’attacco nucleofilo sul
legame peptidico del substrato.
La tasca catalitica è abbastanza grande da ospitare al massimo 7 residui della
catena polipeptidica del substrato.
All’ingresso della tasca catalitica è
localizzata una regione “flessibile”
(flap) che controlla la sitospecificità.
Metallo-proteasi
Le metallo-proteasi tagliano il legame peptidico attraverso l’azione di una
molecola d’acqua attivata dal legame con ioni bivalenti.
In base alla classificazione MEROPS, le metallo-proteasi vengono classificate in
14 diversi CLAN. Il CLAN MA comprende le metallo-proteasi maggiormente
utilizzate a livello industriale, tra cui le Gluzincine [MA(E)] e le Metzincine
[MA(M)] da Bacillus sp.
Fanno parte delle metallo-proteasi:
Amminopeptidasi (M1, M61),
Carbossipeptidasi (M2, M32),
Peptidil-dipeptidasi (M2),
Oligopeptidasi (M3, M13)
Endopeptidasi (M4, M10, M12 e altre)
Tutti i membri di questo CLAN sono caratterizzati dalla presenza di uno ione zinco
all’interno del sito attivo e dal motivo HEXXH, altamente conservato: i due residui
di His (H) sono coinvolti nel legame con lo zinco, mentre Glu (E) è considerato il
residuo importante per la catalisi.
Le sottoclassi MA(E) e MA(M) differiscono per il terzo residuo amminoacidico
legante lo zinco:
- gluzincine  Glu
- metzincine  Asp o His
Termolisina (famiglia delle glucinzine)
1. 316 amminoacidi
2. Due domini:
- dominio N-terminale  principalmente foglietti  e -eliche in piccola parte;
- dominio C-terminale  soprattutto  -eliche
3. Il sito catalitico con lo ione zinco è localizzato tra i due domini
4. Il motivo HEXXH è integrato nell’  -elica centrale
Meccanismo:
Il legame tra lo zinco e il substrato è favorito dal legame dell’acqua con il residuo
di Glu143 e dal suo successivo attacco nucleofilo al carbonio carbonilico del
legame peptidico da idrolizzare.