Cromosoma del batterio “donatore” Trasferimento della ORF nel vettore di espressione PRODUZIONE DELLA PROTEINA RICOMBINANTE Abbondante e facilmente purificabile Contiene una ORF continua !! Retrotrascrizione in cDNA 5’ NT “non tradotto” 3’ NT PURIFICAZIONE DELLA FRAZIONE polyA+ Catene di oligo dT legate alla matrice Si generano estremità “piatte” TESSUTO O COLTURA CELLULARE COSTRUZIONE DI UNA “LIBRARY” DI cDNA mRNA cDNA Inserimento nel vettore Trasformazione in cellule batteriche “SCREENING” PIASTRA “PETRI” DA 10 cm Fosforilazione al 5’OH i deossi-oligonucleotidi sintetici hanno sempre il 5’ con solo un OH Nitrocellulosa trattata con NaOH: •Lisi delle cellule batteriche • Legame covalente del DNA al supporto • Denaturazione del DNA 1. “Ibridazione” in liquido 2. Lavaggi 3. Autoradiografia ds cDNA sonde degenerate Denaturazione (NaOH) e ibridazione 5’ 5’ 5’ Fosforilazione al 5’OH i deossi-oligonucleotidi sintetici hanno sempre il 5’ con solo un OH C 8h 12h 15h Proteina “ricombinante” Biofarmaci o Farmaci proteici In un primo tempo solo come farmaci che “replicano la funzione”. La loro attività è uguale a quella naturale. Le proprietà farmacologiche non sono “migliorate” rispetto al prodotto naturale PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) VACCINI RICOMBINANTI tPA INSULINA ANTICORPI L’INSULINA E’ UNA PROTEINA DI SECREZIONE Sequenza (o peptide) segnale Sequenza di inizio della traslocazione al RER • Peptide segnale • che verrà prontamente digerito dalla peptide-segnalepeptidasi Pre-proinsulin: per la secrezione dal pancreas è presente anche il peptide segnale all’ N-terminale Il peptide segnale Si perde dopo l’entrata nel RER Espressione di INSULINA UMANA ricombinante in batteri Aggiunta di un peptide segnale per facilitare la purificazione (proteina nel “sopranatante”) Purificazione del r-hGH dal terreno di coltura (dopo centrifugazione) Ormone della crescita umano hGH PROTEINE DI SECREZIONE IN BATTERI Prima la SINTESI e poi la SECREZIONE Taglio del peptide segnale CREAZIONE DI PROTEINE IBRIDE CON L’ AGGIUNTA DI SPECIFICI DOMINI PROTEICI “PROTEINE DI FUSIONE” PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) VACCINI RICOMBINANTI tPA INSULINA ANTICORPI Azione della Pol I In vitro si usa il frammento di Klenow MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Oligonucleotide-diretta MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Oligonucleotide-diretta DUPLICAZIONE SEMI-CONSERVATIVA Codice genetico Ridondante (degenerato) Codoni sinonomi Non ambiguo Universale (quasi !) Letto in direzione 5’ – 3’ Produce polipeptide in direzione NH2 - COOH Senza punteggiatura Un mRNA ha un solo “frame” di lettura (determinato da AUG) Mutagenesi oligonucleotide-diretta INSULINA INSULINA Lys-Pro: inversione in posizioni 28 e 29 oppure mutazione Pro/Asp maggiore solubilità e minore formazione di polimeri. Altre mutazioni per causare precipitazione a pH neutro dopo iniezione per un rilascio graduale Insulina per via orale Mutagenesi oligonucleotide-diretta ATTIVATORE TISSUTALE DEL PLASMINOGENO VACCINO PER LA PERTOSSE MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Utilità nella ricerca di base Utilità a fini applicativi TNF - Tumor Necrosis Factor • Induttore della via estrinseca della apoptosi (recettori di morte) • Regolatore del sistema immunitario • Citochina prodotta dai macrofagi, con un ruolo chiave nella regolazione della risposta infiammatoria – Elevati livelli ematici presenti in condizioni patologiche (artrite reumatoide , spondilite anchilosante, inflammatory bowel disease / Crohn’s disease) – Farmaci che ne bloccano l’azione sono utili nel controllo di tali patologie DOMINANTI NEGATIVI TNF TRIMERO DEL RECETTORE del TNF TNF TNF Mutato Dominante negativo Un trimero recettoriale si forma e si attiva interagento con tre molecole di TNF Vaccino ricombinante per la pertosse ADP-ribosilasi Tossina attiva Enzima inattivo Proteina non tossica Tossicità mediata da ADP-ribosilazione di proteine G ADP-ribosilazione NAD + CONCENTRAZIONE DI ANTICORPI SPECIFICI NEL SIERO