Si generano estremità “piatte” TESSUTO O COLTURA CELLULARE COSTRUZIONE DI UNA “LIBRARY” DI cDNA mRNA cDNA Inserimento nel vettore Trasformazione in cellule batteriche “competenti” SCREENING PIASTRA “PETRI” DA 10 cm Fosforilazione al 5’OH i deossi-oligonucleotidi sintetici hanno sempre il 5’ con solo un OH Nitrocellulosa trattata con NaOH: •Lisi delle cellule batteriche • Legame covalente del DNA al supporto • Denaturazione del DNA 1. “Ibridazione” in liquido 2. Lavaggi 3. Autoradiografia ds cDNA sonde degenerate Denaturazione (NaOH) e ibridazione 5’ 5’ 5’ Fosforilazione al 5’OH i deossi-oligonucleotidi sintetici hanno sempre il 5’ con solo un OH Condizioni di ibridazione Alta “stringenza” Bassa “stringenza” PROMOTORI INDUCIBILI DALLA TEMPERATURA 30° 42° Proteina ricombinante CREAZIONE DI PROTEINE IBRIDE CON L’ AGGIUNTA DI SPECIFICI DOMINI PROTEICI “PROTEINE DI FUSIONE” Biofarmaci o Farmaci proteici In un primo tempo solo come farmaci che “replicano la funzione”. La loro attività è uguale a quella naturale. Le proprietà farmacologiche non sono “migliorate” rispetto al prodotto naturale PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI Aggiunta di un peptide segnale per facilitare la purificazione (proteina nel “sopranatante”) Ormone della crescita umano Purificazione del r-hGH dal terreno di coltura (dopo centrifugazione) hGH PROTEINE DI SECREZIONE IN BATTERI Prima la SINTESI e poi la SECREZIONE Taglio del peptide segnale Sequenza (o peptide) segnale Sequenza di inizio della traslocazione al RER • Peptide segnale • che verrà prontamente digerito dalla peptide-segnalepeptidasi Pre-proinsulin: per la secrezione dal pancreas è presente anche il peptide segnale all’ N-terminale Per la espressione in batteri sia aggiunge un dominio utile per la purificazione MBP Maltose binding protein Proteina di “fusione” Prima purificazione su colonna Seconda purificazione su colonna PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) VACCINI RICOMBINANTI tPA INSULINA ANTICORPI Azione della Pol I In vitro si usa il frammento di Klenow MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Oligonucleotide-diretta MUTAZIONI DI SINGOLA BASE Codice genetico Ridondante (degenerato) Codoni sinonomi Non ambiguo Universale (quasi !) Letto in direzione 5’ – 3’ Produce polipeptide in direzione NH2 - COOH Senza punteggiatura Un mRNA ha un solo “frame” di lettura (determinato da AUG) Mutagenesi oligonucleotide-diretta INSULINA INSULINA Lys-Pro: inversione in posizioni 28 e 29 oppure mutazione Pro/Asp maggiore solubilità e minore formazione di polimeri. Altre mutazioni per causare precipitazione a pH neutro dopo iniezione per un rilascio graduale Insulina per via orale Mutagenesi oligonucleotide-diretta ATTIVATORE TISSUTALE DEL PLASMINOGENO VACCINO PER LA PERTOSSE MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Utilità nella ricerca di base Utilità a fini applicativi Vaccino ricombinante per la pertosse ADP-ribosilasi Tossina attiva Enzima inattivo Proteina non tossica Tossicità mediata da ADP-ribosilazione di proteine G ADP-ribosilazione NAD + CONCENTRAZIONE DI ANTICORPI SPECIFICI NEL SIERO TNF - Tumor Necrosis Factor Citochina prodotta dai macrofagi, con un ruolo chiave nella regolazione della risposta infiammatoria – Elevati livelli ematici presenti in condizioni patologiche (artrite reumatoide , spondilite anchilosante, inflammatory bowel disease / Crohn’s disease) – Farmaci che ne bloccano l’azione sono utili nel controllo di tali patologie • Induttore della via estrinseca della apoptosi (recettori di morte) • Regolatore del sistema immunitario DOMINANTE NEGATIVO
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