IDENTIFICAZIONE DEL POLIMORFISMO H1299R DEL GENE CODIFICANTE IL FATTORE V DELLA COAGULAZIONE AMPLI-set-FV H1299R Cat. n. 1.315 L’eterogeneità del fenotipo clinico e la variabilità delle manifestazioni trombotiche presenti nei pazienti con familiarità per patologie trombotiche ha fatto ipotizzare che la predisposizione a tali disordini sia attribuibile a più fattori genetici. Recentemente è stato identificato un complesso aplotipo del fattore V (HR2), che comprende 13 differenti polimorfismi. Tra questi, 7 provocano una sostituzione aminoacidica ed una modificazione funzionale della proteina, risultando in un eccesso della concentrazione plasmatica della isoforma FV1, maggiormente trombogenica. Non è ancora chiaro se l’aplotipo HR2 rappresenti da solo un fattore di rischio. E’ certo che aumenta il rischio di manifestazioni cliniche nei soggetti portatori della mutazione FV Leiden. La ricerca del polimorfismo H1299R viene eseguita previa amplificazione con primers specifici per l’esone 13 di un frammento di 703 bp, con successivo taglio di restrizione ad opera dell’enzima Rsa I. La presenza della mutazione viene rivelata dalla acquisizione di un sito di restrizione. Principio del metodo: A) estrazione del DNA genomico B) amplificazione C) digestione enzimatica D) rivelazione sul gel di agarosio. Applicabilità: Su DNA genomico estratto e purificato da campioni di Sangue Intero. Numero di Test: 40. CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE ESTRAZIONE Reagente 1 (Buffer di separazione) Reagente 2 (Buffer di lisi) Reagente 3 (Soluz. di deproteinizzazione) Reagente 4 (Proteinase k) Reagente 5 (soluzione satura NaCl) AMPLIFICAZIONE e DIGESTIONE PCR mix H2O sterile Taq Polymerase (5U/µl) Enzima Rsa I (10 U//µl) BUFFER di digestione 10X Controllo positivo Eterozigote RIVELAZIONE Gel precast di agarosio 1% per elettroforesi in TBE 1X Loading buffer 10 X Buffer di corsa 5 X (TBE 5X) Marker di peso molecolare +4°C +4°C +4°C -20°C +4°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C T.A. T.A. T.A. -20°C Stabilita': superiore a 12 mesi se correttamente conservato (I gels di agarosio, se conservati lontano dalla luce, sono stabili per un anno a temperatura ambiente). Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; tubi da 15 ml in polipropilene; portaprovette refrigerato; puntali sterili con barriera antiaerosol; bacchetta di vetro (o pasteurs di vetro); portaprovette refrigerato; tubi PCR. Reagenti richiesti non compresi nel kit: acqua bidistillata sterile, cloroformio, etanolo 100 %, etanolo 70 %. Strumenti richiesti: centrifuga con rotore ad angolo fisso per tubi da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante con adattatori per tubi da 15 ml (1.500 x g), set di pipette prePCR e post-PCR: 1)0.5 – 10 microlitri 2)5 – 50 microlitri 3)50 – 200 microlitri 4)200 – 1000 microlitri; Termociclatore programmabile; Cappa Biohazard classe II; Camera elettroforetica con alimentatore; Transilluminatore UV; Apparato fotografico. Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere sterili, DNase e RNase free e monouso. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Il prodotto di amplificazione e’ un frammento di 703 bp. Il successivo taglio di restrizione ad opera dell’enzima Rsa I può dare i seguenti risultati: 1 Assenza della mutazione Soggetto Omozigote Normale Presenza di 1 banda 703 bp 3 2 Presenza della Presenza della mutazione mutazione Soggetto Soggetto Omozigote Mutato eterozigote Presenza di 3 bande 703 bp 493 bp 210 bp Presenza di 2 bande 493 bp 210 bp REFERENZE: Thrombosis and Haemostasis, 1996, 75; 45-48. Blood, 1997, 90, 4; 1552-1557. Blood, 2000, 96, 4; 1443-1448. Thrombosis and Haemostasis, 2000, 83; 577-82. Haematologica, 2001, 86, 6; 629-633. Blood, 2001, 98, 2; 358-367. Hum. Genet., 2002, 111; 59-65. REV. 01
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