TECNOLOGIE PER LINEE CELLULARI E CELLULE STAMINALI – aa 2013-‐2014 ESERCITAZIONE: CARATTERIZZAZIONE CELLULARE TRAMITE PCR Introduzione L’esercitazione ha lo scopo di fornire allo studente le conoscenze di base per la caratterizzazione molecolare (tramite PCR) delle differenti tipologie cellulari. I geni espressi in maniera specifica in un determinato tipo cellulare (cell-type specific markers) ne permettono l’identificazione a partire da un campione di tessuto o da una coltura cellulare mista. Negli ultimi anni tali metodiche hanno trovato largo impiego negli studi riguardanti le cellule totipotenti naturali e indotte e le loro caratteristiche differenziative. Le fasi per l’allestimento di una caratterizzazione cellulare: 1. Estrazione dell’RNA da cellule in coltura 2. Retrotrascrizione dell’RNA in cDNA 3. PCR con primer specifici per amplificare marker cellulari preselezionati: Materiali e Reagenti necessari -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ Puntali e Micropipette Termociclatore cDNA (ottenuto dal campione da analizzare) Master mix (Composition of Buffers and Solutions PCR Master Mix: 50units/ml Taq DNA polymerase [supplied in a proprietary reaction buffer (pH 8.5), 400µM each: dATP, dGTP, dCTP, dTTP 3mM MgCl) Coppie di Primer (stock 10µM) Gel casting Agarosio Bromuro di Etidio Buffer di corsa (TBE buffer) Loading buffer (blu di bromofenolo) Apparato elettroforetico TECNOLOGIE PER LINEE CELLULARI E CELLULE STAMINALI – aa 2013-‐2014 Protocollo PCR Allestimento della reazione: Vortex the Master Mix and then spin it briefly in a microcentrifuge to collect the material in the bottom of the tube. Prepare the following reaction mixes on ice: For a 25µl reaction volume: -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ PCR Master Mix, 2X 1X upstream primer, 10µM 0.1–1.0µM downstream primer, 10µM 0.1–1.0µM DNA template 1–5µl < 250ng Nuclease-Free Water to 25µl Ciclo di PCR: Denaturation Generally,2-minute initial denaturation step at 95°C is sufficient. Subsequent denaturation stepswill be between 30 seconds and 1 minute. Annealing Optimize the annealing conditions by performing there action starting approximately 5°C below the calculated m elting temperature of the primers and increasing the temperature in increments of 1°C to the annealing temperature. The annealing step istypically 30seconds to1minute. Extension The extension reaction is typically performed at the optimal temperature for Taq DNA polymerase, which is 72–74°C. Allow approximately1minute for every1kb of DNA to be amplified. A final extension of 5minutes at 72–74°C is recommended. TECNOLOGIE PER LINEE CELLULARI E CELLULE STAMINALI – aa 2013-‐2014 CycleNumber Generally, 25–30 cycles result in optimal amplification of desired products. Occasionally, up to 40 cycles may be performed, especially for detection of low-copy targets. Visualizzazione degli amplificati su gel di agarosio Pesare l’agarosio (1.8% gr/l) Sciogliere l’agarosio in TBE (1X) Aggiungere il bromuro di Etidio (!!!!!5ul!!!!) Posizionare i pettini nello stampo e colare in gel nel gel casting Aspettare la solidificazione del gel….. Campioni: 10ul di amplificato + Loading buffer (4X) MK: 7ul Corsa: 95mV 25’