1.331 Scheda tecnica CBS I278T

IDENTIFICAZIONE DELLA MUTAZIONE I278T
DEL GENE CISTATIONINA-β
β-SINTETASI (CBS)
AMPLI-SET-CBS I278T
Cat. n. 1.331
Il deficit dell’enzima cistationina-β-sintasi (CBS) è una patologia ereditaria a trasmissione autosomica recessiva.
L’enzima condensa l’omocisteina e la serina per formare cistationina. Il deficit causa omocistinuria e la patologia
conseguente è caratterizzata da ectopia lentis, ritardo mentale, alterazioni dell’apparato scheletrico e disordini vascolari
con severe complicanze tromboemboliche. Comunemente si distinguono due forme in relazione alla responsività o
meno al trattamento con piridoxina.
Le mutazioni presenti a carico del gene CBS possono essere presenti, però, anche allo stato di eterozigosi. Tale
condizione provoca una moderata iperomocisteinemia e, quindi, un fattore di rischio per lo sviluppo di patologie
cardiovascolari.
Nella popolazione Europea le mutazioni più frequenti sono la mutazione I278T e la mutazione A114V. Inoltre nella
popolazione italiana è frequente la mutazione 844ins68.
Il kit permette l’identificazione della mutazione I278T in cui c’è la sostituzione di un residuo di isoleucina in un residuo
di treonina in posizione aminoacidica 278 causata da una transizione T→C in posizione 833.
La metodica prevede l’amplificazione con primers specifici di un frammento di 174 bp ed il taglio di restrizione con
l’enzima BsrI. La mutazione provoca l’inserzione di un nuovo sito di taglio per cui l’allele mutato presenta un pattern di
restrizione con due frammenti (132 bp e 42 bp).
Principio del metodo: A) estrazione del DNA genomico B)
amplificazione C) digestione enzimatica D) rivelazione sul
gel di agarosio.
Applicabilità: Su DNA genomico estratto e purificato da
campioni di Sangue Intero.
Numero di Test: 40.
microlitri 3) 50 – 200 microlitri 4) 200 – 1000
microlitri;Termociclatore programmabile; Cappa Biohazard
classe II; Camera elettroforetica con alimentatore;
Transilluminatore UV; Apparato fotografico.
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono
essere sterili, DNase e RNase free e monouso
CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
ESTRAZIONE
Reagente 1 (Buffer di separazione)
Reagente 2 (Buffer di lisi)
Reagente 3 (Soluz. di deproteinizzazione)
Reagente 4 (Proteinase k)
Reagente 5 (soluzione satura NaCl)
AMPLIFICAZIONE e DIGESTIONE
PCR mix
H2O sterile
Taq Polymerase (5U/µl)
Enzima Bsr I (10U//µl)
BUFFER di digestione 10X
Controllo positivo eterozigote
RIVELAZIONE
Gel precast di agarosio 4% per elettroforesi in TBE 1X
Loading buffer 10 X
Buffer di corsa 5 X (TBE 5X)
Marker di peso molecolare ladder 100 bp
+4°C
+4°C
+4°C
-20°C
+4°C
Il prodotto di amplificazione e’ un frammento di 174 bp. Il
successivo taglio di restrizione ad opera dell’enzima Bsr I
può dare i seguenti risultati:
Marker
1
2
3
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
T.A.
T.A.
T.A.
-20°C
Stabilità: superiore a 12 mesi se correttamente conservato (I
gels di agarosio se conservati lontano dalla luce, sono stabili
per un anno a temperatura ambiente).
Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; tubi da 15 ml in
polipropilene; portaprovette refrigerato; puntali sterili con
barriera antiaerosol; bacchetta di vetro (o pasteurs di vetro);
Portaprovette refrigerato; tubi PCR.
Reagenti richiesti non compresi nel kit: acqua bidistillata
sterile, cloroformio, etanolo 100 %, etanolo 70 %.
Strumenti richiesti: centrifuga con rotore ad angolo fisso
per tubi da 2 ml (12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante
con adattatori per tubi da 15 ml (1.500 x g), Set di pipette
pre-PCR e post-PCR: 1) 0.5 – 10 microlitri 2) 5 – 50
174 bp
132 bp
1
Assenza della
mutazione
Soggetto Normale
2
Presenza della
mutazione
Soggetto eterozigote
Presenza di 1 banda
Presenza di 3 bande
174 bp
174 bp
42 bp
3
Presenza della
mutazione
Soggetto Omozigote
Mutato
Presenza di 2 bande
42 bp
REFERENZE:
Hum. Mol. Genet. 1993; 2:1633-8.
Am. J. Hum. Genet. 1995; 56:1324-1333
Thromb Haemost 2000; 84 (4); 576-82.
REV. 01

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