Stafilococcus aureus

Staphylococcus aureus
Concetta Scalfaro
Istituto Superiore di Sanità
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Microrganismi e Tecnologie Alimentari
Università di Tor Vergata, 20 Marzo 2013
Caratteristiche morfologico-biochimiche
• Cocchi Gram-positivi disposti a grappoli
• Privi di capsula evidente, asporigeni,
immobili
• Aerobi ed anaerobi facoltativi, catalasipositivi e fermentanti il glucosio
• Crescita in presenza del 5% di NaCl,
alcuni anche con 10-15%
• Produttori di numerose tossine ed enzimi
• Acquisiscono facilmente resistenze a
numerosi antibiotici
• S. aureus è la specie più frequentemente
responsabile di tossinfezione alimentare
Caratteristiche di crescita
 Gli stafilococchi producono catalasi, che li differenzia dagli streptococchi.
 Fermentano lentamente diversi carboidrati con produzione di acido lattico
e producono diverse sostanze extracellulari.
 Pur non essendo sporigeni, mostrano una notevole resistenza a
condizioni ambientali sfavorevoli: essicamento e calore.
In base alla produzione dell’enzima coagulasi si distinguono:
Stafilococchi coagulasi positivi: S. aureus, S. intermedius, S.
delphini, S. schleiferi subsp. schleiferi, S. schleiferi subsp.
coagulans, S. lutrae.
Stafilococchi coagulasi negativi: oltre 40 specie non patogene
o patogene opportuniste (S. epidermidis).
Staphylococcus spp.
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
S. auricolaris
S. capitis
S. chromogenes
S. cohinii ssp cohinii
S. caprae
S. sciuri
S. simulans
S. warnerii
S. xylosus
S. gallinarum
S. kloosi
S. lentus
S. lugdunensis
S. cohinii ssp urealyticum
S. intermedius
S. haemolyticus
S. hominis
S. hycus
S. saccharolyticus (schleiferi)
Staphylococcus aureus
• E’ uno dei batteri più temuti, anche per la grande diffusione di
ceppi multiresistenti agli antibiotici e, tra i segreti della sua
virulenza, vi è l’inconfondibile color oro
• La caratteristica colorazione giallo-oro deriva dalla elevata
concentrazione di carotenoidi dotati di proprietà antiossidanti.
Tali composti proteggono il batterio da sostanze ossidanti, come
il perossido d'ossigeno e radicali liberi, che i neutrofili producono
per eliminare i batteri
• Alcuni ricercatori ipotizzano che farmaci in grado di inibire la
sintesi dei carotenoidi possano rivelarsi utili per il trattamento di
infezioni di S. aureus
Fattori di virulenza
Nel determinismo dell’azione patogena concorrono numerosi fattori di
virulenza e la produzione di diverse sostanze extracellulari, quali:
• Esotossine (tossine citolitiche con attività emolitica)
-emolisina: proteina eterogena che lisa i globuli rossi e danneggia le piastrine
β-emolisina: degrada la sfingomielina ed è tossica per molti tipi di cellule
g-emolisina e d-emolisina: sono dotate di potere emolitico in vitro per le
__emazie
di uomo
• Leucocidina (tossina con attività litica nei confronti dei leucociti).
• Esoenzimi
Coagulasi
Enzimi lipolitici
Proteasi
DNAsi
• Componenti strutturali
Capsula
Catalasi, Superossidodismutasi
Ialuronidasi
Stafilochinasi
Coagulasi legata
Proteina A
Le citolisine
Citolisine o Emolisine e Leucocidina PV (tossine proteiche) sono
in grado di ledere le membrane delle cellule bersaglio,
provocandone la morte.
Agiscono con due meccanismi di azione:
• formazioni di pori (tossina , tossina d)
• azione enzimatica sui lipidi di membrana [tossina b, tossina g, e
__tossina di Panton Valentine (PV)]
Tossina 
K+
Formazione di pori,
perdita dei nutrienti
Morte cellulare
Gli enzimi
Catalasi: gli stafilococchi producono una catalasi, che converte il perossido di
idrogeno in acqua e ossigeno. Il test della catalasi differenzia gli stafilococchi, che
sono positivi, dagli streptococchi, che sono negativi.
Coagulasi: in combinazione con il fattore denominato CRF (coagulase
reacting factor) presente nel plasma di uomo e di altre specie animali
provoca la trasformazione del fibrinigeno in fibrina. E’ in grado di creare la
formazione di uno strato protettivo di fibrina interno alla cellula batterica,
che ne ostacola la fagocitosi.
Stafilochinasi: converte il plasminogeno presente nel plasma in plasmina,
permettendo una maggiore invasività.
Ialuronidasi: depolimerizza l’acido ialuronico ed agisce da fattore
diffusore, facilitando la diffusione del processo infettivo e dei prodotti
tossici elaborati dai batteri.
Proteinasi: enzimi con attività proteolitica svelabili con la fluidificazione della
gelatina.
Lipasi, esterasi, fosfatasi: enzimi con attività lipolitica.
DNAsi: enzima termoresistente e presente generalmente in tutti i ceppi di
Stafilococchi patogeni. Dotati di attività depolimerizzante il DNA.
Antigeni di superficie
Antigene capsulare: specie-specifico polisaccaridico, composto di ac. Dglucosaminuronico e di alcuni aminoacidi come L-alanina
La capsula inibisce la fagocitosi da parte dei leucociti polimorfo-nucleati in
assenza di anticorpi specifici
Antigeni parietali: antigene proteico A e due antigeni polisaccaridici A e
263 (complesso peptidoglicano-acidi teicoici)
Tutti i ceppi di S. aureus possiedono antigeni comuni superficiali
tipo-specifici. Se si adsorbono i
sieri agglutinanti con ceppi
eterologhi, è possibile mettere in
evidenza un certo numero di
anticorpi tipo-specifici e i relativi
antigeni, ai fini della loro
identificazione
Capsula (solo in
alcuni tipi)
Parete cellulare
Tossine TSS e SSS
• Tossina TSS (dello shock tossico): viene prodotta dopo la
colonizzazione di alcune mucose; è in grado di funzionare come
superantigene capace di indurre la formazione di una serie di
citochine e di indurre grave tossiemia e shock
• Tossina SSS (epidermolitica o tossina esfoliativa): provoca la
cosiddetta sindrome della cute ustionata (scalded skin
syndrome) o necrolisi epidermica acuta della prima infanzia. Si
manifesta con uno scollamento spontaneo di ampie zone degli
strati superficiali dell’epidermide a causa della rottura dei
desmosomi
Le enterotossine
• Il p.m. è di circa 3,5x104 Da
• Resistono a 100°C per 15' minuti
• Sono inattivate a 110°C per 50' ed a 120°C per oltre 20'
• Resistono all'azione degli enzimi gastro-intestinali
• Sono cronoresistenti (negli alimenti fino a 18 mesi)
• Sono crioresistenti
• Sono acido-resistenti
Sintomatologia
nell’uomo:
le
Ne sono stati identificati 14 tipi
enterotossine sono essenzialmente
antigenici, indicati con le lettere
degli emetici, in grado di agire sui
da A ad O, in grado di provocare
visceri addominali, dove lo stimolo
sindrome gastroenterica a dosi di
raggiunge i nervi simpatici e il vago.
0,5-5μg.
Si
manifesta
quindi
vomito,
Sono tossiche per ingestione e,
accompagnato in alcuni casi da
quella di tipo B, anche per
diarrea, dopo 1-6 h dall’ingestione
inalazione (rientra tra le armi
del cibo. Inoltre, ipersalivazione,
biologiche).
crampi addominali e prostrazione
Infezione da S. aureus
L’uomo è continuamente esposto al rischio di un’infezione stafilococcica e
dal 50 al 70% degli individui adulti è colonizzato da stafilococchi
potenzialmente patogeni sulla cute e soprattutto, nel naso faringe (portatori
sani).
Lo stato di portatore è spesso transitorio o comunque intermittente.
La maggior parte delle affezioni stafilococciche sono costituite da casi
singoli che si verificano sporadicamente e senza alcun legame tra di loro,
tuttavia, l’intossicazione di origine alimentare da enterotossina e
l’impetigine stafilococcica si manifestano spesso in forma di episodi
epidemici che coinvolgono contemporaneamente numerosi individui.
Principali quadri patologici
Cute e tessuti
molli:
foruncoli, favi

Apparato
respiratorio:
polmonite
favi

Apparato
scheletrico:
osteomielite

Apparato
genitourinario:
ascesso renale,
infezione basse
vie urinarie
foruncoli
polmonite
Sistema
nervoso centrale:
ascessi cerebrali
ed epidurali

orzaiolo
sinusite
ascessi
mediastinici
endocardite
Mediastino:
possibili ascessi

Mucose:
tossiemia

vomito
impetigine

diarrea
TSS
SSS
osteomielite
cistite
Apparato
gastrointestinale:

intossicazioni
alimentari
Resistenza a farmaci
Gli stafilococchi hanno un ampio spettro di sensibilità ai
farmaci antimicrobici.
La resistenza è data :
• produzione di beta-lattamasi (sotto il controllo plasmidico);
• resistenza alla nafcillina, meticillina e oxacillina.
Il meccanismo è la mancanza o la inaccessibilità ad alcune
penicillin-binding proteins:
• tolleranza: i microrganismi sono inibiti e non uccisi, per la
mancata attivazione di enzimi autolitici nella parete cellulare;
• presenza di plasmidi per la resistenza a tetracicline,
eritromicina, aminoglicosidi, ecc.
Epidemiologia di S. aureus
Il numero dei casi di intossicazione stafilococcica nel mondo sembra
diminuire nel tempo, probabilmente per la maggiore consapevolezza sulle
problematiche sanitarie e alimentari da parte della popolazione e degli
operatori, ma anche per la meccanizzazione di molti processi produttivi che
ha consentito una notevole riduzione della manipolazione degli alimenti.
Negli Stati Uniti annualmente sono riportati circa 200.000 casi di
intossicazione stafilococcica, mentre in Europa, dal 1988 al 1992,
Staphylococcus aureus, si è reso responsabile del 5,1% di tutti gli episodi
epidemici tossinfettivi riportati dalle autorità sanitarie.
Alimenti implicati nelle tossinfezioni alimentari
• Prodotti ad elevato contenuto
proteico, a base di carne,
molto manipolati, poco acidi
e non propriamente sottoposti
a refrigerazione dopo la cottura
• Pesci cotti ed affumicati
• Latte e latticini
• Uova e creme di uova, sia crudi che cotti
• Prodotti di gastronomia sottoposti a salagione
• Dolci a base di creme
Particolare attenzione va posta agli alimenti cotti, successivamente
ricontaminati, conservati a temperature permissive per la replicazione
di S. aureus e serviti dopo diverse ore dalla preparazione (carni fredde,
polpettoni, insalate miste contenenti carne, ecc.).
Un altro alimento spesso coinvolto è il prosciutto crudo: infatti S.
aureus è un microrganismo alofilo, cioè in grado di sopravvivere e
replicare in presenza di elevate concentrazioni di sale.
In una recente indagine (2004) volta a valutare la presenza di
stafilococchi
potenzialmente
enterotossici
negli
alimenti
commercializzati in Italia, è emerso che il latte crudo era contaminato
nel 38,4% dei casi, la ricotta nel 24,2%, le preparazioni a base di carne
nel 48,1%, la carne macinata nel 31,2% ed il prosciutto nel 11,5%.
Sindromi gastroenteriche
• INTOSSICAZIONE ALIMENTARE: per ingestione di una
enterotossina preformata negli alimenti contaminati.
• ENTERITE ACUTA: più rara, per colonizzazione del tratto
enterico da parte del microorganismo.
Caratteristiche
• Breve periodo di incubazione: 1-6 ore.
• Insorgenza improvvisa della sintomatologia: vomito, crampi
addominali, malessere, talvolta diarrea
• Principale fonte di contaminazione è l’uomo, in particolare gli
operatori addetti alla lavorazione degli alimenti
Dose infettiva
La patologia è causata dall’assunzione di una sostanza tossica presente
nell’alimento a prescindere dalla presenza del microrganismo che l’ha
sintetizzata; quindi più che la dose infettiva è importante conoscere il
numero di cellule di S. aureus enterotossico presente nell’alimento.
Affinché si abbia la manifestazione clinica è necessario ingerire circa 100200 ng di enterotossina; ciò significa che è necessario che il germe si
replichi e raggiunga una carica microbica di circa 500.000-1.000.000 di
cellule per grammo di alimento.
Queste cariche microbiche possono essere raggiunte nell’alimento
conservato a temperature permissive per la replicazione in 2-4 ore.
Fattori coinvolti nelle tossinfezioni …
•
•
•
•
Inadeguato raffreddamento
Lungo intervallo di tempo tra la preparazione ed il consumo
Personale malato e/o portatore sano
Inadeguata cottura
... e precauzioni
• Massimo rispetto delle norme di buona produzione
• Mantenere i cibi cotti a temperatura al di sopra della quale
gli stafilococchi cessano di moltiplicarsi (> 70°C).
• Raffreddare rapidamente gli alimenti e conservarli
refrigerati in contenitori poco profondi (temperatura al cuore
non superiore a 7°C).
• Preparare e consumare gli alimenti nel più breve tempo
possibile al fine di non dare ai microrganismi, eventualmente presenti, il tempo di moltiplicarsi (2-3 ore).
Sicurezza alimentare
In termini di sicurezza alimentare, la caratteristica di variabilità più
importante è rappresentata dalla possibilità di poter distinguere ceppi
capaci di produrre enterotossine stafilococciche, i cosiddetti ceppi
enterotossici, e ceppi non enterotossici.
I ceppi enterotossici rappresentano circa la metà del totale.
Un altro fattore di variabilità intraspecifica è rappresentato dalla
presenza di stipiti ospite-adattati; è così possibile distinguere diversi
“biotipi” (umano, bovino, ovino, aviare, ecc.). Il biotipo più
frequentemente enterotossico è quello umano, produttore
prevalentemente di enterotossina tipo A.
Diffusione
L’intossicazione stafilococcica è una patologia che si registra
soprattutto nei paesi sviluppati, la cui popolazione si nutre sovente di
alimenti complessi e manipolati.
Diagnosi differenziale
La rapida comparsa della sintomatologia dopo l’assunzione del cibo
contaminato è un elemento che consente di escludere agenti
responsabili di infezioni alimentari (Salmonella spp., Escherichia
coli patogeni, Campylobacter spp., Listeria monocytogenes, ecc.).
Infatti, quando la patologia è sostenuta da un agente infettivo
introdotto con l’alimento, il periodo di incubazione è generalmente
più lungo (da 1 a diversi giorni).
Dal punto di vista clinico, una forma simile di intossicazione è
causata dalla tossina emetica di Bacillus cereus.
Metodi d’identificazione
L’isolamento e l’identificazione di S. aureus da alimenti o superfici
dell’industria alimentare non richiede particolari attrezzature e risulta
piuttosto semplice (grazie anche all’esistenza di protocolli operativi
standardizzati).
Di norma si impiegano terreni solidi per l’isolamento e prove biochimiche
per l’identificazione del batterio.
Per verificare la capacità enterotossica del ceppo isolato, invece, possono
essere utilizzate tecniche immunologiche (ELISA, Agglutinazione Inversa
al Lattice, Immunodiffusione, ecc.) o tecniche di biologia molecolare in
grado di svelare la presenza di geni codificanti per le enterotossine
stafilococciche.
• Campioni: alimenti, tamponi, materiale purulento, sangue, broncoaspirato
e liquor
• Esame colturale: piastre di agar sangue, addizionato del 7,5% di NaCl
con l’aggiunta di_mannitolo (Terreno di Chapman), o piastre di terreno
selettivo a base di tellurito di potassio e rosso d’uovo (Baird-Parker)
• Esame microscopico: cocchi Gram-positivi
___con la tipica disposizione a grappolo
Metodi d’identificazione
• Test della catalasi: una goccia di soluzione al 3% di perossido di
idrogeno viene posta su un vetrino a una piccola quantità della colonia
sospetta viene aggiunta alla soluzione. La formazione di bolle (rilascio
di ossigeno) indica la positività del test. I batteri produttori di catalasi
causano la liberazione di ossigeno che svolgendosi in forma gassosa
provoca la formazione di una schiuma evidente intorno e sulla patina
batterica
Distinzione con streptococchi e pneumococchi
Negativo
Positivo
• Test della coagulasi: in una provetta viene miscelata una piccola quantità
(0,5 ml) di una brodocoltura dello stafilococco in esame con 1 o 2 ml di
plasma citratato ricco in CRF (es. di coniglio) e si incuba a 37°C.
Nel caso di stafilococchi patogeni, entro 3 ore si produce un evidente
coagulo, mentre gli stafilococchi non patogeni lasciano inalterata la fluidità
della miscela.
• Test della DNAsi: le colture in esame vengono inoculate su una piastra
di agar-nutritivo che incorpora una certa quantità di DNA (in genere da
timo di vitello), che opacizza il terreno. Intorno alle colture di batteri con
attività DNAsica si produce un alone chiaro per la depolimerizzazione del
DNA.
Conclusione
L'uso indiscriminato di antibiotici ha portato, allo sviluppo di ceppi
meticillino resistenti, quindi insensibili all'azione delle penicilline e delle
cefalosporine, e in epoca più recente di altri ceppi a resistenza multipla,
sviluppata anche nei confronti della vancomicina, uno dei pochi farmaci
ancora capaci di debellare le infezioni di questo batterio.
Dei circa due miliardi di esseri umani colonizzati da Staphylococcus
aureus, è stato stimato che nel 2006 i portatori di ceppi MRSA erano
compresi tra i 2 e i 53 milioni, ma altri studi attribuiscono al fenomeno
una portata maggiore.

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