Ionizzazione in MS 1. Fase Gas: Gas: 1. Electron ionization (EI EI) 2. Chemical ionization (CI CI) 3. Field Ionization (FI FI) Composti volatili e termostabili 2. Desorbimento Desorbimento:: (Non richiedono volatilizzazione: fase condensata) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Field Desorption (FD FD) Fast Atom Bombardment (FAB FAB) Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS SIMS) Laser Desorption (LD LD) MALDI Plasma Desorption (PD PD) Thermal Desorption Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI APCI) and photoionization (APPI) 8. Electrospray ionization (ESI ESI) matrice solida o viscosa API, liquidi 1 2 1 SORGENTI e ANALIZZATORI più utilizzati Sorgenti: • • • • EI (impatto elettronico/ionizzazione elettronica) CI (ionizzazione chimica) ESI (elettrospray) e APCI MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization). Analizzatori: • • • quadrupolo trappola ionica ( linear ion trap orbitrap) TOF (time of flight – tempo di volo) 3 IONIZZAZIONE Ionizzazione “hard” Eccesso di energia nella molecole (rispetto alla energia di ionizzazione) Estesa frammentazione Ionizzazione “soft” Basso contenuto di energia nella molecole Frammentazione limitata 2 Meccanismi di ionizzazzione Espulsione di e-: M + e- M+. + 2e- Cattura di e- : M + e- M-. Protonazione: M + H+ MH+ Deprotonazione: MH M- + H+ Formaz. addotti: M + Cat+ MCat+ Trasferimento specie carica da fase condensata a fase gas 5 Ionizzazione elettronica (EI) tungsteno o renio 2000°C M + e- M+• + 2 e- 6 3 Forte campo elettrico, ioni sono attratti dal piatto di segno opposto P = 10-4 Pa M = molecole neutre; e-; M+• = ione molecolare; F+= ioni frammento; Vacc = potenziale di accelerazione 7 2.7 Å per Ek 20 eV Ogni e- associato a onda con 1.4 Å per Ek 70 eV Per valori λ prossimi a lunghezze di legame: onda diventa complessa. Se una delle frequenze ha E hν corrispondente a transizione nella molecola eccitazione elettronica se c’è E sufficiente, e- può essere espulso e- NON IMPATTA! Vario il potenziale di accelerazione di e- (ossia sua E cinetica) 70 eV Ioni prodotti per molecole che entrano in sorgente: 1/1000 10-20 eV: trasferiti alle molecole durante ionizzazione eccesso di E Per un certo Vacc , T cost: I =N p i V I = ioni prodotti per unità di tempo in un volume V è legato alla pressione p del campione e alla corrente elettronica i con 8 fattore di proporzionalità N 4 9 A 10 V elettrone ha v=1.88*108 cm s-1 e attraversa molecola (1.88 Å = 1.88 10-8 cm) in 10-16 s. 4. non ho più frammentazione 3. può avvenire o meno 2. Energia ridistribuita attraverso le vibrazioni nello ione, t <10-10 s 1. in EI, ionizzazione avviene in tempi molto brevi 10 5 Ioni Stabili, Metastabili e Instabili Terminologia per gli ioni è stata coniata come diretta conseguenza della scala dei tempi della spettrometria di massa (classificazione priva di giustificazione al di fuori della MS, dove ioni si decomporrebbero) Gli ioni molecolari che non si decompongono o che si decompongono a velocità inferiori di 105 s–1 raggiungeranno il rivelatore senza frammentazione ioni stabili Ioni che si dissociano a velocità superiori a 106 s–1 non possono raggiungere il rivelatore. Saranno invece rivelati i loro frammenti e quindi sono chiamati ioni instabili. Tuttavia, una piccola percentuale si decomporrà a velocità comprese tra 105–106 s–1 e frammenterà nel passaggio verso l’analizzatore di massa ioni metastabili 11 Picco dello ione molecolare Lo ione molecolare si genera dalla molecola originale M per eliminazione di un elettrone: è un radicale catione contenente un elettrone a spin spaiato, indicato dal simbolo • NO• + e– NO+ + 2e– La sua massa è praticamente uguale a quella della molecola originaria, dato che la perdita di massa dovuta all'espulsione dell'elettrone è trascurabile. In pratica, assegnando con certezza il picco dello ione molecolare di una sostanza pura si determina immediatamente la massa molecolare M. Tuttavia il picco può essere poco intenso o addirittura assente nel caso di molecole facilmente frammentabili (l’intensità del picco dipende dalla stabilità della specie che lo genera); la sua intensità è maggiore per molecole lineari e minore per molecole ramificate. 12 6 Formazione di ioni negativi per cattura elettronica M + e– M-• • solo con e- termici (no a 70 eV) • possibile, con scarsa efficienza, solo per molecole contenenti elementi fortemente elettronegativi 13 EI: formazione degli ioni Sotto alto vuoto, no reazioni ione-molecola: frammentazioni unimolecolari in tempi brevissimi prodotti cinetici Riarrangiamenti/aperture anello visibili solo se ho frammentazione Efficienza ionizzazione dipende da Eionizzaz. molecole Presenza ione molecolare: dipende da facilità di frammentazione Frammentazione spesso dà sia radicale sia catione (specie con più bassa Ei ) 14 7 Quasi-Equilibrium e RRKM Theory Nel 1952 vennero proposte due teorie per lo più identiche per spiegare i fenomeni osservati nel caso delle reazioni unimolecolari in fase gas sotto alto vuoto. I. Quasi-equilibrium theory (QET), proposta da Rosenstock et al., si applica alla MS II. RRKM, dalle iniziali degli autori Rice, Rampsberger, Kassel e Marcus, tratta le molecole neutre. Entrambe basate su ipotesi e postulati: 1- movimenti di rotazione, vibrazione, traslazione ed elettronici sono indipendenti uno dall’altro 2- movimento dei nuclei può essere espresso dalla meccanica classica …………. Ai fini del corso, non è necessario trattare queste due teorie 15 EI adatta per composti piccoli (< 800 Da), volatili, termicamente stabili. E’ una ionizzazione ‘hard’: l’eccesso di energia da luogo a frammentazione dello ione molecolare. Regola di Stevenson: scissione legame semplice può dare 2 gruppi di ioni e radicali 16 8 'Even-Electron Rule' presenta numerose eccezioni 17 Lo ione molecolare può decomporsi in un’ampia varietà di modi ed i frammenti prodotti possono subire un ulteriore processo di scissione. Le principali frammentazioni delle molecole organiche si distinguono in: Frammentazioni primarie avvengono sullo ione molecolare Frammentazioni secondarie avvengono sui frammenti Frammentazioni semplici con rottura di un legame semplice fra due atomi Frammentazioni multiple o riarrangiamenti reazioni di frammentazione con rottura di due legami covalenti 18 9 Stabilità degli ioni molecolari e dei frammenti Per le diverse classi di composti organici si osservano i seguenti ordini di intensità: Picco molecolare molto intenso: aromatici > alcheni coniugati > alcheni > alcani a catena lineare corta Picco poco intenso: chetoni > alcani lineari > eteri >esteri > ammine > acidi carbossilici > alcoli Picco assente: molecole ramificate, alcoli terziari, nitrili, nitrocomposti Sono favorite le frammentazioni che portano a frammenti stabili. 19 Lo spettro di massa è caratterizzato da un segnale dello ione molecolare (spesso non presente a causa dell’intensità dell’impatto) che ha massa uguale a quella della molecola originaria, dato che la perdita di massa dovuta all’eliminazione di un elettrone è trascurabile. La sua intensità è maggiore per molecole lineari e minore per molecole ramificate, inoltre in una serie omologa diminuisce all’aumentare della massa molecolare. ione tropilio 20 10 Alcool primario 21 Regola dell’azoto In MS considero massa (nominale) relativa a isotopo più abbondante. Composti organici contengono C, H, O, S, Si, P, alogeni, (met. alcalini) e N, unico tra gli elementi considerati con massa atomica pari e numero di valenza dispari: 14 u, 5 e (devo considerare isotopo più abbondante: Br 80 u, ma predomina 79Br) *Se la molecola contiene solamente un numero pari di atomi di azoto (o non lo contiene affatto), lo ione molecolare è di massa nominale pari. N pari (incluso 0), Massa molecolare pari [es. CH3CH3 30 u] *Se la molecola contiene un numero dispari di atomi di azoto, la massa nominale dello ione molecolare è dispari. N dispari, Massa molecolare dispari [es. CH3NHCH3 45 u] 22 11 CH3CH3 30 u N = 0, massa pari, e- pari CH3CH3 + e- CH3CH3+• massa pari, e- dispari (radicale) (M+ H)+ massa dispari, e- pari (ione) CH3NHCH3 45 u NH3 17 u CH3NH2 31 u N = 1, massa dispari, e- pari CH3NHCH3 + e- CH3NHCH3+• massa dispari, e- dispari (radicale) (M+ H)+ massa pari, e- pari (ione) (M-H)- massa pari, e- pari (ione) 23 In alcuni casi l’identificazione del picco molecolare può essere fatta con la regola dell’azoto: •Se la molecola contiene solamente C, H, O, S, alogeni o un numero pari di atomi di azoto, lo ione molecolare è di massa nominale pari. •Se la molecola contiene un numero dispari di atomi di azoto, la massa nominale dello ione molecolare è dispari. OH C6 H12 O NH2 C6 H14 N 12 Nel radicale catione, la carica è delocalizzata su tutta la molecola siti preferenziali di radicale e catione derivano da perdita di e- a più bassa E ionizzazione nella molecola. Quando si scrivono reazioni di frammentazione, la carica viene quindi rappresentata localizzata sul sito con la più debole E ionizzazione (in media 7-15 eV). Ordine è: elettroni n > π > σ quindi eteroatomi con preferenzialmente la carica debole E ionizzazione portano Se •+ sono in fondo alla molecola, non indico localizzazione Siti di carica (+) e radicale: sono siti deficienti di e-: -reazioni di rottura iniziati dal sito della carica (+) comportano l’attrazione di una coppia di e-, il cui movimento induce rottura eterolitica con migrazione del sito della carica (i) - reazioni di rottura iniziati dal sito del radicale derivano dalla sua forte tendenza all’accoppiamento di e- e- dispari è donato per formare un nuovo legame, mentre il trasferimento di un singolo e- induce la rottura omolitica con migrazione del sito dell’e- spaiato (α) 25 La rottura di un legame sullo ione molecolare può essere: •Omolitica se c’è separazione dei due elettroni del legame (scissione radicalica) E’ l’elettrone dispari a dare inizio al processo (sito radicale: forte tendenza ad accoppiamento e- donazione di 1 edispari per formare nuovo legame, migrazione sito di e- spaiato) 13 •Eterolitica se non c’è separazione dei due elettroni del legame (scissione ionica) E’ la carica positiva a dar origine al processo migrazione carica (attrazione coppia e) Lo ione molecolare può decomporsi in un’ampia varietà di modi ed i frammenti prodotti possono subire un ulteriore processo di scissione. Le principali frammentazioni delle molecole organiche si distinguono in: Frammentazioni primarie avvengono sullo ione molecolare Frammentazioni secondarie avvengono sui frammenti Frammentazioni semplici con rottura di un legame semplice fra due atomi Frammentazioni multiple o riarrangiamenti reazioni di frammentazione con rottura di due legami covalenti 28 14 Rottura del legame σ (dissociazione diretta) avviene quando lo ione molecolare si è formato per rimozione di un elettrone da un legame σ 29 regola di Stevenson: se due frammenti carichi sono in competizione per produrre un radicale neutro mediante attacco di un elettrone, si forma il radicale con E ionizzazione più alta. Può essere considerata una competizione tra due cationi a portarsi via l’elettrone 30 15 • Rottura legame adiacente a un eteroatomo (i) Attrazione della coppia elettronica da questo legame con eteroatomo • Rottura legame α Trasferimento di un e spaiato per formare legame con atomo adiacente, con concomitante rottura di un altro legame di questo atomo Posso avere diverse rotture competitive. In base a regola di Stevenson: perdo radicale con più alta E di ionizzazione, però per catene alchiliche: perdita catena più lunga è favorita Competizione fra: 1. Rottura legame adiacente a un eteroatomo - avviene più facilmente se eteroatomo è grande - per due eteroatomi vicini, il più elettronegativo porta più facilmente questo tipo di rottura 2. Rottura legame α - predominante per elettron donatori: Br, Cl < R• , legame π, S, O < N Gli alogeni preferenzialmente causano la perdita del radicale X• attraverso meccanismo 1, mentre le ammine preferenzialmente perdono un radicale attraverso meccanismo 2 32 16 t-butil etil etere Rottura legame adiacente eteroatomo. Frammento con O, molto elettronegativo, porta via eNo m/z 45 (CH3CH2O)+ Rottura legame α riarrangiamento 33 etil 2-butil etere Due possibilità di perdere metile e una etile. Poco intenso m/z 87 da perdita CH3• perdo radicale idrocarburico più grande, seguito da perdita di etilene (m/z 45, ma m/z 59 se ho perso prima metile) Rottura legame adiacente eteroatomo 34 17 Riarrangiamenti (circa 20) Molecola neutra + nuovo radicale cationico radicale catione distonico: ho i due siti separati Il riarrangiamento di Mc Lafferty è il più caratteristico di ed è tipico di chetoni, acidi e esteri alifatici. Si ha la rottura del legame C-C e la formazione di un’olefina e di uno ione radicale. L’idrogeno migrante si deve trovare sull’atomo in γ rispetto a quello portante l’eteroatomo, in modo che si possa avere uno stato di transizione ciclico a sei. Frammentazioni primarie Avvengono con: 1) Perdita di un radicale (a numero dispari di elettroni) Forniscono un frammento cationico a numero pari di elettroni. Se lo ione molecolare non contiene azoti e ha quindi massa pari, i frammenti così generati hanno massa dispari. 18 Se ione molecolare e frammenti contengono un numero dispari di atomi di azoto la regola è invertita. 2) Perdita di una molecola neutra Il frammento è un radical-catione a numero dispari di elettroni. Se nella molecola non sono contenuti atomi di azoto, le masse nominali dello ione molecolare e dello ione frammento sono entrambi pari. 19 Frammentazioni secondarie Gli ioni generati dalle frammentazioni primarie possono ancora contenere un eccesso di energia e subire a loro volta processi di frammentazione. Frammentazioni semplici Sono reazioni che avvengono con rottura di un legame semplice tra due atomi. Possono essere di vario tipo Frammentazioni in α non attivate Frammentazioni che avvengono in composti che non hanno eteroatomi e non hanno particolari insaturazioni (per esempio idrocarburi saturi). Lo spettro di massa è caratterizzato dalla presenza di ioni provenienti dalla sola rottura dei legami σ e da picchi: M-15; M-29; M-43, provenienti dalla rottura di un CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3. 20 14 u 14 u 14 u 14 u 14 u Lo ione molecolare, specialmente per le molecole a catena lunga, è di scarsa intensità. La distribuzione delle intensità dei frammenti è di tipo binomiale. Non ho sito preferenziale per la localizzazione della carica. Non ho più rottura α, ma rotture σ aspecifiche La presenza di ramificazioni induce irregolarità nella distribuzione. In tali casi, lo ione più abbondante è quello con la più bassa energia di ionizzazione. 14 u 14 u 14 u 21 n-decano 2,7-dimetil-ottano 2,5,5-trimetil-eptano 43 Scissione benzilica Negli alchil benzeni si verifica la perdita di un atomo di idrogeno o di un radicale metilico con formazione dello ione tropilio (ione estremamente stabile) con picco molto intenso a m/z 91 (ha perso il radicale, infatti, la sua massa è dispari). 22 ione benzilio/tropilio ione fenilio, m/z 77 45 La completa aromatizzazione attraverso la perdita di 4 atomi di H è indicata dalla presenza del picco a m/z 128. Lo ione più abbondante risulta dalla perdita di etilene. Come per la maggior parte dei cicloalcani, si osserva uno ione intenso a (M-15), derivato dalla perdita di un metile, in seguito a un riarrangiamento. I tipici ioni tropilio (91) e fenilio (77) perdono 26 Da, acetilene, producendo i frammenti a m/z 65 e 51, 46 rispettivamente 23 Idrocarburi aromatici Lo spettro di massa degli idrocarburi aromatici presenta un abbondante ione molecolare in quanto l’anello aromatico può essere aperto solo in seguito alla rottura di due legami. Si ha uno ione molecolare tanto più intenso quanto maggiore è l’aromaticità del composto (cioè maggiore è il numero di anelli maggiore è la stabilità) Alcoli alifatici Non forniscono segnale apprezzabile per lo ione molecolare. Caratteristica degli spettri di alcoli alifatici è una distribuzione dei picchi binomiale e distanziata di 14 Da (unità metileniche) e soprattutto la presenza dello ione a m/z 31 che si forma secondo il seguente schema (rottura del legame α): •+ • + R − CH2CH2 − O H → R − C H 2 + CH2 = O H H2 C H2 C H3C OH C H2 CH3 H2 C H3C OH m/z 31 OH m/z 45 CH3 CH C H2 H2C OH HC 24 I segnali più intensi dello spettro sono quelli provenienti dalla frammentazione dello scheletro idrocarburico; gli ioni radicali con m/z pari si originano con meccanismo più complesso della rottura del legame σ, indotto dalla presenza della funzione –OH. Probabilmente si ha la perdita iniziale di H2O seguita dalla perdita di olefina: +• R − CH 2CH 2CH 2CH 2 − O H → R − CH = CH + • + H 2O + CH 2 = CH 2 L’assenza di picco molecolare nello spettro MS degli alcol fa preferire la preparazione di derivati trimetilsilil secondo la seguente reazione: E’ una reazione abbastanza semplice adatta anche per gli –OH stericamente impediti (per esempio quelli terziari o secondari o quelli che si trovano in un sistema di tipo steroideo). 25 Lo spettro di massa dei TMS derivati è più semplice, si nota la formazione caratteristica del segnale a M-15, in quanto il trimetilsilil derivato perde un CH3, ed inoltre consente la facile determinazione del peso molecolare: Gli alcoli aromatici non presentano questo problema, in genere il picco base e il picco molecolare corrispondono e quando ci sono gruppi fenolici si ha la rottura dell’anello, poiché la presenza di sostituenti attaccati allo scheletro benzenico indebolisce i legami favorendo l’apertura dell’anello (ciò spiega il picco a m/z 63 di seconda intensità dopo lo ione molecolare). 26 Composti azotati La frammentazione è influenzata da “ +” sull’atomo di N; cioè prevalgono gli ioni in cui la carica è sull’azoto, in quanto è talmente basico che il tempo di migrazione della carica è più lento. 27 Nell’interpretazione di uno spettro si segue una procedura abbastanza semplice: identificazione dello ione molecolare. identificazione di ioni caratteristici. identificazione di processi di frammentazione caratteristici. ricostruzione della struttura della molecola sulla base della conoscenza di meccanismi di frammentazione standard. Nella comune pratica di laboratorio, si suggerisce prima di tutto di eseguire un confronto computerizzato dello spettro appena registrato con il vasto archivio di spettri ormai disponibile su tutti gli spettrometri commerciali. Anche se la molecola esaminata non è compresa nell'archivio, l'elaboratore elenca una serie di composti che contengono il maggior numero possibile di ioni comuni con lo spettro incognito. Oppure: banca dati personalizzata Difficilmente è possibile una interpretazione univoca attraverso la sola spettrometria di massa. E' sempre importante utilizzare informazioni provenienti da altre tecniche chimiche o spettroscopiche, in particolare la spettrometria NMR. BANCHE DATI DI SPETTRI NIST/EPA/NIH Mass Spectral Database Versione 2008: 222.000 spettri EI di più di 192.000 composti più circa 28.000 spettri replicati Dal 2005 anche spettri CID: 14.800 spettri di 5.300 differenti ioni ottenuti con trappola ionica e triplo quadrupolo Wiley/NBS Mass Spectral Database Wiley Registry of Mass Spectra Data Registro 2009: 662.780 spettri di 590.000 composti 56 28 Benzamide: EI 44 77 - NH2h C NH2 O C6H5C=O + m/z 105 - CO C6H5+ m/z 77 105 Spettri di massa di tre composti di MW = 150 Da 58 29 4-dodecanone Esteri metilici degli acidi grassi a catena lunga Questi composti presentano un riarrangiamento che coinvolge la migrazione di un H in γ con rottura del legame in β: 30 Perdite neutre caratteristiche (radicali e non) Potrei avere 2 perdite consecutive: es., in steroidi, ho spesso M-33 = - (Me + H2O) 61 Gap: 1-15, 21-25, 37-41 Ionizzazione elettronica e chimica Ionizzazione “hard” (elettronica) Eccesso di energia nella molecole (rispetto alla energia di ionizzazione) Estesa frammentazione Ionizzazione “soft” (chimica) Basso contenuto di energia nella molecole Frammentazione limitata 31 IONIZZAZIONE CHIMICA La ionizzazione chimica viene utilizzata quando gli ioni molecolari prodotti con il metodo della EI sono troppo poco stabili e si frammentano completamente. Questa è una tecnica di ionizzazione più “soft” rispetto alla EI (complementare; produce ioni con un piccolo eccesso di E). Si basa sull’interazione del campione vaporizzato con un gas reagente ionizzato, che di solito è un acido di Brönsted e/o di Lewis gassoso collisioni ione-molecola indotte (p = 60 Pa, cammino libero medio = 0.1 mm; fuori 10-3 Pa) in zone definite della sorgente. Posso avere ionizzazione chimica: Positiva (PCI) Negativa (NCI) Sebbene la temperatura del gas reagente ionizzato sia ben al di sotto di quella di un plasma, la simultanea presenza di elettroni liberi, protoni, numerosi ioni e radicali hanno portato a descriverlo come plasma di gas reagente Combined EI and CI source Lowering the box 10 switches from the EI to CI mode (1) EI/CI switch; in EI mode, the box serves as a pusher; (2) microswitch; (3) entrance for the reagent gas; (4) flexible capillary carrying the reagent gas; (5) diaphragm; (6) filament giving off electrons; (7) path of the ions towards the analyser inlet; (8) hole for the ionizing electrons in CI mode; (9) sample inlet; (10) box with holes, also named ‘ion volume’. 64 32 La prima osservazione di questa reazione ione-molecola (ma non riconosciuta come tale) in esperimento MS fu fatta da Thomson che osservò nei suoi spettri di massa uno ione a m/z=3. In seguito la formazione di tale ione fu spiegata con la seguente reazione: H 2 + e − → H 2+ • + 2e − H 2+ • + H 2 → H 3+ + H • Altra reazione ione-molecola frequentemente osservata era quella che coinvolge H2O: H 2O + e − → H 2O + • + 2e− H 2O + • + H 2O → H 3O + + HO • 65 E’ un processo che si articola in due stadi Un gas reagente genera ioni primari mediante ionizzazione elettronica, questi a loro volta reagiscono (secondo processi del secondo ordine) con le molecole neutre dello stesso gas reagente per produrre un plasma stabilizzato di ioni secondari; La ionizzazione chimica delle molecole neutre del campione (+ e -) si può realizzare sulla base di un’ampia varietà di reazioni con gli ioni primari e secondari del plasma. Tra questi, i più importanti sono: Trasferimento del protone (reazione acido-base) Formazione di addotti Trasferimento di carica radicale Sottrazione di un anione Cattura di elettroni (-) : elettroni a bassa E del plasma (utilizzati per prima ionizzazione e poi rallentati o prodotti da reazioni di ionizzazione) M- per cattura e- 33 molecular ion Ion formed by the removal of one or more electrons from a molecule to form a positive ion or the addition of one or more electrons to a molecule to form a negative ion Note: Pseudo-molecular ion and quasi-molecular ion are deprecated; molecular ion is reserved for the intact ionized molecule with no component added or removed other than electrons adduct ion Ion formed by the interaction of a precursor ion with one or more atoms or molecules to form an ion containing all the constituent atoms of the precursor ion as well as the additional atoms from the associated atoms or molecules. Note: For example, a Na+ adduct of a molecule (M) that is represented as [M+Na]+. See also anionized molecule, cationized molecule, protonated molecule. protonated molecule Deprecated: protonated molecular ion, pseudo-molecular ion, quasi-molecular ion. Adduct ion, represented by [M+H]+, formed by the interaction of a molecule with a proton (hydron). protonated molecular ion This term is deprecated. 67 deprotonated molecule Deprecated: pseudo-molecular ion, quasi-molecular ion. Ion formed by the removal of a proton from a molecule M to produce an anion represented as [M–H]–. cationized molecule Ion formed by the association of a cation with a molecule M. Note 1: For example, [M+Na]+, [M+K]+, and [M+NH4]+. Note 2: The terms quasi-molecular ion and pseudo-molecular ion are deprecated and should not be used in place of cationized molecule. See also adduct ion. anionized molecule Ion formed by the association of an anion with a molecule, M. Note 1: For example, [M + Cl]–. Note 2: The terms quasi-molecular ion and pseudo-molecular ion are deprecated and should not be used in place of anionized molecule See also adduct ion. 68 34 I STADIO: EI del GAS reagente G + e- G+• + 2 eG+• +G GH+ + G• Gas deve essere 1000 v. più concentrato dell’analita Trasferimento del protone (reazione acidoacido-base) GH+ + M MH+ + G M deve avere affinità per il protone >> di quella di G: PA (M) > PA (G) (PA = gas phase proton affinity) Altri fattori: P e T della sorgente (collisioni) Gas ionizzanti: metano (PA = 5.7 eV) Isobutano (PA = 8.5 eV) Più selettivi e meno energetici (protonazione meno ammoniaca (PA = 9.0 eV) esotermica che con CH4): ho picco molecola protonata (acqua) 69 Quale ione reagente può protonare un dato analita? Si deduce dai dati di gas phase basicity (GB) o gas proton affinity (PA) Tendenza di B ad accettare un protone è quantitativamente descritta da: da ricavo: 70 35 71 M+• =142 Spettri di massa del butil metacrilato ottenuti con: 1. EI 2. CI con metano 3. CI con isobutano La tecnica di ionizzazione (EI vs. CI) e il gas reagente influenzano il livello di frammentazione e l’intensità della molecole protonata a 143 m/z. 1. assenza del picco dello ione molecolare (ionizzazione è forte, il legame molecolare è debole e quindi la molecola si frammenta totalmente) 2. picco della molecola protonata [M+1]+ (m/z 143) ma di bassa intensità 3. picco della molecola protonata = picco base, in quanto la frammentazione con l’isobutano è estremamente ridotta. 36 Estrazione di HM + R+ (M-H)+ + RH Formazione di addotti (con molecole polari, favorita da legami H. Richiede collisione con un terzo partner per eliminare eccesso di E) RH+ + M (MRH)+ Ogni ione nel plasma può associarsi con una molecola di campione o di gas reagente Trasferimento di carica Xe + e- Xe+• + 2 eXe+• + M M+• + Xe Gas rari, N2, CO e altri gas con alto potenziale di ionizzazione. Radicale ma con meno Energia rispetto EI meno frammentazione 73 Ionizzazione chimica positiva Gas reagente: metano Il gas ionizzante più utilizzato è il metano; nel corso della sua ionizzazione, quando la sua pressione parziale è sufficientemente elevata, avvengono le seguenti reazioni: Lo ione radicale CH4+• a sua volta, può CH4 + e- CH4+• + 2 eCH +• 4 → CH + 3 CH +• 4 → CH +• 2 CH +• 4 + CH → CH 4 dare origine alle seguenti reazioni: + H• + H2 + 5 + CH • 3 Essendo il CH3+ pochissimo stabile reagisce a sua volta con altre molecole di CH4 CH 3+ + CH 4 → C 2 H 5+ + H 2 37 + CH 4 → C 2 H 3+ + H 2 + H • C 2 H 3+ + CH 4 → C 3 H 5+ + H 2 CH +• 2 Alla fine, come risultato di queste ionizzazioni primarie, nello spettro di massa si hanno picchi a m/z 17, 29 e 41 (intensità relativa dipende da p) CH 5+ C2 H 5+ C3 H5+ + Lo ione CH 5 è un fortissimo acido di Brönsted (in soluzione non può esistere perché l’acido più forte è H3O+, ma in fase gassosa sì) e continua ad esistere fino a quando non incontra le molecole di analita alle quali cedere H+. Il suo contenuto energetico, però, è minore rispetto a quello dell’elettrone accelerato fino all’energia di 70 eV e quindi spesso si riesce a vedere il picco dello molecola protonata [M+1]+. CH 5+ + M → [ M + H ]+ + CH 4 + Il C2 H 5 è un acido di Lewis molto forte quindi strappa l’idruro per dare C2H6, che è una specie molto stabile. Quindi se incontrasse una specie che può cedere l’idruro (idrocarburo saturo) si avrebbe la formazione della molecola M-1 secondo la reazione: C2 H 5+ + RH → C2 H 6 + R + CH 5+ + RH → R + + CH 4 + H 2 Per molecole polari: addotto CH 3+ + M → [M + CH 3 ] + 38 metionina vedo pattern isotopico di S a M+2 77 Gas reagente: isobutano In condizioni di ionizzazione chimica l’isobutano può dar luogo alle seguenti reazioni: EI m/z 57 m/z 43 39 Lo ione a m/z 39 potrebbe avere anche la seguente struttura aromatica: Ione ciclopropenio Plasma di ioni agirà con trasferimento del protone, ma molecole polari formeranno addotti (M+57)+ e (M+39)+ Scarsa efficienza di ionizzazione per idrocarburi, perché catione t-butil è stabile utile per evitare interferenze degli idrocarburi Utilizzabile anche in NCI Isobutano: EI vs PCI 80 40 GC/MS TIC traces of butyl methacrylate dissolved in C11–C12 saturated hydrocarbon (a) EI. The peaks following are C11 saturated hydrocarbons. (b) Same trace obtained by CI using methane as reagent gas. Butyl methacrylate is still well detected, but the trace of the hydrocarbons is attenuated. (c) CI using isobutane as reagent gas. Butyl methacrylate is well detected, 81 while the hydrocarbons are almost not detected. Gas reagente: ammoniaca L’ammoniaca è il terzo gas più utilizzato per la ionizzazione chimica, è adatto per molecole basiche ed è anche abbastanza selettivo: Trasferimento del protone nel caso delle ammine, formazione addotti per sostanze polari e poco basiche 41 Ammoniaca: EI vs PCI 83 Gas reagenti più comuni per PCI 84 42 Ionizzazione chimica negativa per cattura di elettroni Gli ioni negativi vengono prodotti in condizioni di ionizzazione chimica tramite cattura di elettroni elettroni.. Infatti, in condizioni di elevata pressione, gli elettroni primari (emessi dal filamento) e quelli secondari (prodotti durante la ionizzazione, utilizzando per esempio CH4) subiscono delle collisioni, durante le quali perdono gran parte della loro energia trasformandosi in elettroni termici termici;; in queste condizioni, le molecole con elevata elettronegatività o con gruppi acidi (es (es.. fenoli, fenoli, acidi carbossilici) sono in grado di catturarli.. catturarli A seconda dell’energia dell’elettrone catturato si possono avere tre diversi meccanismi: meccanismi: EC EC--NCI AB + e− → AB•− (cattura di risonanza associativa) 0-2 eV AB + e− → A• + B− (cattura di risonanza dissociativa) 0-15 eV AB + e− → A+ + B− + e− ≥15 eV (formazione coppia ionica) Gli elettroni non sono forniti da uno ione reattivo, reattivo, ma si muovono liberamente attraverso il gas con energia termica - La prima reazione è la più utilizzata (favorita per molecole con molti atomi elettronegativi o che possono stabilizzare ione per risonanza); - L’ultima reazione non ha utilità pratica, in quanto non solo si ha ricombinazione ma si potrebbero formare frammenti tipo Cl-, F-, ecc., con bassa sensibilità. Per alcuni tipi di molecole, come composti insaturi e con sostituenti elettronegativi (es. tetraclorodiossine), questa tecnica è molto sensibile (circa 103 volte più sensibile di una PCI) in quanto esse catturano velocemente gli elettroni e producono intensi picchi molecolari. E’ però irriproducibile (cond. sperimentali). 43 La necessità di analizzare le le tetraclorodiossine a livelli di concentrazione molto bassi ha fatto sviluppare la NCI 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzodioxin 87 Ionizzazione chimica negativa per reazione ione--molecola con uno ione del plasma ione Il reagente più utilizzato è OH-, che viene generato da miscele di N2O con H2, CH4 o altri idrocarburi secondo lo schema: OH- fornisce spettri di massa con abbondanti ioni [M[M-H]- per alcoli, acidi ed esteri. Le reazioni degli ioni negativi primari sono simili a quelle della PCI: acido-base addotto 88 44 EC mass spectrum of benzo[a]pyrene, C20H12 Gas: isobutano Temperatura della sorgente di ionizzazione: 200 °C Lo spettro mostra esclusivamente lo ione molecolare negativo (m/z 252) 89 CE: charge exchange 45 Ottaclorobornano (componente del toxafene) Ionizzazione elettronica Ionizzazione chimica positiva Ionizzazione chimica negativa Possibilità di distinguere due isomeri in base a intensità relativa dei picchi Esempio: cis- e trans-1,4-cicloesandiolo Spettri EI identici In CI, isomero trans ha picco (M+H–H2O)+ di intensità relativa assai maggiore dell’isomero cis Posso distinguerli!! isomero cis può formare legami H Isomero trans ciclizza 92 46 4-metilmetil-cicloesanolo CECE-CI con C6F6+• favorita eliminazione 1,4 93 Distinguo fra cationi a numero dispari (odd) di elettroni, cioè radicali dell’EI, con cationi a numero pari (even) di elettroni, come in tecniche di ionizzazione soft, inclusa CI in assenza di azoto 94 47 VANTAGGI DELLA IONIZZAZIONE CHIMICA Ione molecolare sempre presente Frammenti più significativi della ionizzazione elettronica. Infatti dopo CI i legami C-C tendono a rompersi solo se il prodotto della rottura è particolarmente stabile. Frequentemente lo scheletro degli atomi di carbonio rimane intatto e la scissione è limitata a legami tipo C-O, C-S, C-N. Ne deriva che la CI è particolarmente adatta a molecole come idrocarburi, alcoli, esteri, ammine, amminoacidi, piccoli peptidi che in condizioni di EI darebbero una frammentazione eccessiva. Versatilità. Si può scegliere il tipo di frammentazione, il gas reagente, di operare in positivo o in negativo. Buona sensibilità. Rispetto alla EI ha una maggior sensibilità. Molto utile in (MS)2. A differenza della EI, non si ha una frammentazione spinta, di conseguenza l’abbondanza dello ione molecolare permette di avere più frammenti specifici. SVANTAGGI DELLA IONIZZAZIONE CHIMICA Irriproducibilità. Non sempre la ionizzazione avviene nello stesso modo ed inoltre risente di eventuali tracce di acqua presenti nel campione che potrebbero andare a finire nella zona di ionizzazione. Dipendenza dalla geometria della sorgente. Dipendenza dalla temperatura e dalla pressione. Quest’ultima è particolarmente importante in NCI. Dà frammentazioni differenti da EI. Quando si deve fare un’analisi quantitativa si preferisce uno spettro ottenuto con EI in quanto è più robusto, anche se più complesso; mentre per analisi di screening o di riconoscimento si preferisce la CI. Mancanza di biblioteche di MS. Non si dispone sempre di biblioteche vista la dipendenza dalla temperatura e dalla pressione. 48
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