MS/MS is any general method involving involving at least two stages

MS/MS is any general method involving at least two
stages of mass analysis
analysis,, either in conjunction with a
dissociation process or in a chemical reaction that
causes a change in the mass or charge of an ion
ion..
In the most common MS/MS experiment a
is used to isolate a precursor ion
ion,,
undergoes spontaneously or by some
fragmentation to yield product ions
fragments::
fragments
first analyser
which then
activation a
and neutral
mp+ → mf+ + mn
A second spectrometer analyses the product ions
ions..
1
1
Profilo
Centroide
3
E’ possibile aumentare il numero di passaggi:
passaggi: selezionare
ioni di una prima massa, dopo selezionare ioni di una
seconda massa dai frammenti ottenuti, e infine analizzare i
frammenti di questi ultimi ioni selezionati esperimento
MS/MS
MS/
MS//MS o MS3.
In base all’analizzatore utilizzato, il numero di passaggi può
essere aumentato fino a n per avere esperimenti di MSn
(dove n si riferisce al numero di generazioni di ioni da
analizzare)
4
2
Tandem Mass Spectrometry
in Space or in Time
Basically, a tandem mass spectrometer can be conceived in
two ways
ways:: performing tandem mass spectrometry in space by
the coupling of two physically distinct instruments,
instruments, or in time
by performing an appropriate sequence of events in an ion
storage device.
device. Thus there are two main categories of
instruments that allow tandem mass spectrometry
experiments:: tandem mass spectrometers in space or in time
experiments
time..
To obtain higher order MSn spectra requires n analysers to
be combined, increasing the complexity and thus also the
cost of the spectrometer.
spectrometer. Furthermore, successive analysers
can be arranged in any number, but because the fraction of
ions transmitted at each step is low, the practical maximum
is three or four analysers in the case of beam instruments
instruments..
Mass
Analyzer
•
•
Mass
Analyzer
…
Multiple quadrupoles are very common (e.
(e.g. QqQ systems,
EB for doubledouble-focusing, Q-TOF )
Why tandem MS? Because of the possibility of doing CID –
collisionally induced dissociation
dissociation.. Ions are allowed to
collide with a background gas (He, N2, Ar
Ar)) for several
millliseconds,, prior to analysis
millliseconds
analysis.. Allows for MSn experiments
in an ion trap
trap..
3
I°analizzatore
(filtro per m/z)
Cella di collisione
II°analizzatore
Scansione m/z
MS/MS nello spazio
7
Tandem mass spectrometry can also be achieved through
time separation with a few analysers such as ion traps,
orbitrap and FTICR, programmed so that the different steps
are successively carried out in the same instrument
instrument.. The
maximum practical number of steps for these instruments is
seven to eight.
eight. In these instruments the proportion of ions
transmitted is high, but at each step the mass of the
fragments becomes lower and lower
lower..
A significant difference between the two types of trapping
instruments is that in the ion trap mass spectrometers, ions
are expelled from the trap to be analysed
analysed.. Hence they can be
observed only once at the end of the process.
process. In FTMS, they
can be observed nondestructively,
nondestructively, and hence measured at
each step in the sequential fragmentation process
process..
4
Nomenclatura
Ione Molecolare
Molecolare:: ion formed by the addition or the removal of one
or several electrons to or from the sample molecule.
molecule.
Molecola protonata/
protonata/deprotonata
deprotonata:: ion originating from the molecule
by the abstraction of a proton [M−H]− or by a hydride abstraction
[M−H]+, or by interaction with a proton or a cation to form a
protonated molecule [M+H]+ or a cationized molecule [M+Cat]
M+Cat]+.
The ambiguous and obsolete terms ‘quasimolecular ion’ or
‘pseudomolecular ion’ should be avoided.
avoided.
Ione Addotto:
Addotto: ion formed by direct combination of two separate
molecular entities, usually an ion and a neutral molecule, in such
a way that there is change in connectivity promoted by
intermolecular binding, but no loss of atoms within the precursor
entities..
entities
Cluster ion:
ion: ion formed by a multimulti-component atomic or molecular
assembly of one or more ions with atoms, ions or molecules.
molecules.
Precursor ion: any ion undergoing either a fragmentation or a
charge change.
change.
Product ion: ion resulting from the above reaction.
reaction.
Fragment ion: ion resulting from the fragmentation of a precursor
ion.
Neutral loss:
loss: fragment lost as a neutral species.
CAD Collision
Collision--Activated Dissociation
CID
Collision--Induced Dissociation
Collision
CAR Collision
Collision--Activated Reaction
5
Il sistema di scansione più utilizzato è il “PRODUCT ION SCAN”: la
selezione dello ione precursore, il CID o CAD (dissociazione indotta
dalle collisioni) e la scansione a livello del secondo analizzatore.
Nella seconda fase ci deve essere aumento di energia cinetica degli
ioni e aumento della probabilità che questi collidano con molecole
11
di gas inerte.
CID: Collision
Collision--Induced Dissociation
CAD: Collision Activated Dissociation
Lo ione entra nella cella di collisione
Lo ione collide con una molecola di gas presente
nella cella di collisione
Lo ione passa ad uno stato attivato (energia dell’urto)
Lo ione dissipa l’energia frammentandosi.
Gli ioni generatisi per frammentazione possono
essere analizzati dal secondo analizzatore
6
Product Ion Scan – Role of Collision Energy
CE = 15 V
CE = 35 V
CE = 20 V
Diverse
scansioni
effettuabili con
uno
spettrometro
dotato di
analizzatori in
serie
7
Tandem mass spectrometry in time
Note
Le modalità Precursor o neutral loss scan,
scan, così come la modalità
MRM (SRM), non sono possibili in analizzatori con separazione “in
time””.
time
La modalità product ion scan è l’unica disponibile direttamente con
questi spettrometri di massa.
massa.
Tuttavia, con questi strumenti, il processo può facilmente essere
ripetuto su diverse generazioni di ioni.
ioni. Così gli strumenti basati sul
tempo facilmente consentono di ottenere spettri di massa MSn in
modalità product ion.
ion.
As the number of transmitted ions decreases at every step because
of the ionic species trajectory lengths and the presence of a
collision gas, the practical maximum number of steps is 3-4 in the
case of MS/MS in space, and 7-8 for MS/MS in time.
time.
However, chemical noise may decrease more than the ionic signal,
so often the signal
signal--to
to--noise ratio increases in addition to the
sensitivity..
sensitivity
8
Data Dependent Acquisition
•Data Dependent Scans
MS/MS based on intensity ranking of precursor ions
•Dynamic Exclusion
Precursor m/z of previous MS/MS are memorized and
no MS/MS done on them during a defined time period
•Automatic Gain Control (AGC, unique to ion trap)
Control how many ions are scanned – to achieve
signal/noise ratio and to minimize space charge effect
17
Data--Dependent Scan (Q3)
Data
Purpose: Simultaneous acquisition of full-scan, as well as product ion information,
for qualitative purposes
Survey Scan: Full Scan Q3 Mode
Data-Dependent Scan: Product Ion Mode
Survey Scan
Data - Dependent Scan
Q2
Q1 RF Only RF Only + Ar Q3 Scanning
9
Dynamic Exclusion
MS
MS/MS
*
MS
407
MS/MS
MS
MS
MS/MS
MS
377
Threshold
MS
365
452
231
m/z
m/z
206
407
MS/MS
*
452
255
377
MS
m/z
m/z
Applicazioni della Tandem MS
•Determinazione della struttura primaria
Viene isolato lo ione precursore e si fa la scansione degli ioni
prodotto. Si deve avere una serie di informazioni sulla tipologia
delle frammentazioni.
•Determinazione selettiva di una classe di
composti
Si utilizza la scansione degli ioni precursori che forniscono uno
ione prodotto tipico della classe oppure la scansione di una perdita
neutra caratteristica per tutta una classe di composti.
•Determinazione quantitativa di composti target
Si utilizza la modalità Multiple (Selected) Reaction Monitoring
10
1. Collision
Collision--Activated Decomposition or
Collision--Induced Dissociation
Collision
MS/MS requires the fragmentation of precursor ions selected by the
first analyser in order to allow the second analyser to analyse the
product ions.
ions.
The ions leaving the source can be classified into three categories.
categories.
1. The first category of ions, with a lifetime greater than 10−6 s,
reaches the detector before any fragmentation has occurred.
occurred.
2. The second category, with a lifetime smaller than 10−7 s,
fragments before leaving the source and only the fragments are
detected..
detected
3. The last category, called metastable ions,
ions, have an intermediate
lifetime.. These ions are stable enough to be selected by the first
lifetime
analyser while containing enough excess energy to allow their
fragmentation before they reach the second analyser.
analyser. The
probability associated with this phenomenon is relatively low (1%)
because their number is small and they spend a very short time in
the reaction region.
region.
If precursor ions undergo a collisional activation (CA), that is an
increase in their internal energy that induces their decomposition,
then the situation described above is much improved.
improved.
This collision
collision--activated decomposition (CAD) technique, also
known as collision
collision--induced dissociation (CID),
(CID), allows one to
fragment a certain number of precursor ions in the reaction region
and also the number of fragmentation pathways.
pathways.
An overall view shows the CID process as a sequence of two
steps::
steps
1. The first step is very fast (10-14 to 10-16 s) and corresponds to
the collision between the ion and the target when a fraction of
the ion translational energy is converted into internal energy,
energy,
bringing the ion into an excited state.
state.
2. The second step is the unimolecular decomposition of the
activated ion.
ion. The collision yield then depends on the activated
precursor ion decomposition probability.
probability.
11
da teoria del quasi-equilibrio o RRKM:
•
1. Il tempo di dissociazione dello ione è lungo rispetto al tempo
di formazione e il tempo di eccitazione.
eccitazione.
•
2. La velocità di dissociazione è bassa rispetto alla velocità di
ridistribuzione dell’energia di eccitazione fra tutti i modi interni
dello ione.
ione.
•
3. Lo ione raggiunge una condizione di equilibrio interno dove
l’energia è distribuita con un’uguale probabilità fra tutti i modi
interni.. Considerando che uno ione con N atomi non lineari ha
interni
3N−
N−6
6 modi vibrazionali, è facile capire come la resa di collisione
diminuisce in maniera inversamente proporzionale alla massa
dello ione.
ione.
•
4. I prodotti di dissociazione osservati sono il risultato di una
serie di reazioni competitive e consecutive.
consecutive.
CID consente una ridistribuzione dell’energia nei modi
vibrazionali dello ione perché la velocità di dissociazione è
più bassa della
della velocità di randomizzazione dell’energia
In queste condizioni, i percorsi di frammentazione dipendono dalla
quantità di energia depositata e non dal metodo di attivazione dello
ione utilizzato
utilizzato..
Poiché l’energia è distribuita con un’uguale probabilità tra tutti i
modi interni dello ione, si ha la rottura PREFERENZIALE dei legami
più deboli
deboli.. Per lo stesso motivo, molecole con più atomi
necessitano di più energia, o più tempo, per dissociarsi.
dissociarsi.
Le moderne tecniche di ionizzazione permettono la produzione di
ioni da composti ad alta massa molecolare, perciò sono stati
sviluppati altri metodi di attivazione degli ioni che aumentano il
trasferimento di energia.
energia.
12
Esistono diversi metodi per attivare gli ioni mediante collisioni.
collisioni. Il
più diffuso consiste nel far collidere gli ioni accelerati a bassa o
alta energia con molecole di gas (bersagli fermi):
fermi):
Per ottenere l’attivazione collisionale in strumenti MS/MS
MS/MS con
analizzatori separati spazialmente, fra i due analizzatori di massa
viene posta una cella di collisione.
collisione.
In strumenti MS/MS
MS/MS basati su step di analisi di massa separati
nel tempo, un gas inerte è semplicemente introdotto nella trappola
ionica o nell’ICR.
nell’ICR. In alcune elaborazioni di questi esperimenti, il gas
è introdotto solo in una certa regione o in un momento particolare
della sequenza operativa usando una valvola pulsata.
pulsata.
1.1. Collision Energy
Conversion to Internal Energy
The kinetic energy for internal energy transfers is governed by the
laws concerning collisions of a mobile species (the ion)
ion) and a static
target (the collision gas)
gas).
According to the law of conservation of momentum, the kinetic
energy of a rapid particle colliding with a static target (v2=0) cannot
be entirely converted into internal energy.
energy.
Thus,, the conservation of energy and of momentum imply that only
Thus
a fraction of the translational energy is converted into internal
energy under inelastic conditions.
conditions.
Consequently, an increase in the ion kinetic energy or in the target
Consequently,
gas mass increases the energy available for the conversion.
conversion.
Et = kinetic energy available for conversion,‘relative kinetic energy
13
m1 è la massa dello ione;
ione;
m2 è la massa del target gas (molecole
(molecole di gas a v2=0);
Ek è l’energia cinetica dello ione;
ione;
Et è la massima frazione dell’energia convertita in energia interna
Et è inversamente proporzionale a mione
Esempio: mione = 100 u con Ek = 10 eV
se mtarget = 28 u (N2)
aumento massimo della sua E interna = 10 × 28/(28
28/(28 + 100) = 2.19 eV
se mtarget = 40 u (Ar)
aumento massimo della sua E interna = 10 × 40/(40
40/(40 + 100) = 2.86 eV
se mione = 200 u e mtarget = 40 u (Ar)
aumento massimo della sua E interna = 10 × 40/(40
40/(40 + 200) = 1.67 eV
27
Bisogna distinguere due regimi di collisione:
collisione:
1. bassa energia
energia:: nell’intervallo 1–100 eV,
eV, come si verifica in
strumenti quadrupolo,
quadrupolo, ICR o trappola ionica;
ionica;
2. alta energia
energia:: diverse migliaia di eV,
eV, come si verifica
comunemente per strumenti a settore magnetico e tempo di
volo..
volo
Per scambi di energia teoricamente comparabili,
comparabili, a bassa ed alta
energia si osservano differenti pattern di frammentazione.
frammentazione. In linea
generale,, gli spettri ad alta energia presentano una
generale
frammentazione più semplice e chiara e sono molto diversi dagli
spettri a bassa energia.
energia. Questi ultimi infatti danno spettri con
diversi percorsi di frammentazione, spesso includendo diversi
riarrangiamenti.
14
1.2. High
High--Energy Collision (keV)
keV)
Solo strumenti elettromagnetici, TOF o ibridi in cui gli ioni hanno
un’energia traslazionale molto alta possono funzionare ad alta
energia.. In questi strumenti c’è una cella di collisione tra due
energia
analizzatori..
analizzatori
La configurazione strumentale che è più favorevole a studi CID ad
alta energia è quella che offre la risoluzione migliore sia sugli ioni
precursori sia sugli ioni prodotto, ossia EBEB o BEEB.
BEEB. In
alternativa:: EBE e BEB.
alternativa
BEB.
Si introduce un gas dentro la cella di collisione come un fascio
molecolare diretto perpendicolarmente al fascio di ioni accelerato
da un potenziale di pochi kilovolt verso l’uscita (dove una pompa
rimuove gas dallo strumento per preservare il vuoto necessario
all’analizzatore elettromagnetico).
elettromagnetico).
Ad alta Energia, l’eccitazione dello ione è prevalentemente
elettronica!
30
15
Ad alta Energia, l’eccitazione dello ione è prevalentemente
elettronica.. La conversione dell’energia cinetica interna, infatti,
elettronica
avviene più efficientemente quando il tempo di interazione di
collisione e il periodo interno del modo che va incontro a
eccitazione sono comparabili.
comparabili.
Esempio ione con massa 1000 Da e energia 8 keV, il tempo di
interazione con un target largo pochi Å è 10-15 s, che corrisponde a
transizione elettronica verticale E acquisita è ridistribuita in
forma di E vibrazionale, con eventuale rottura di legame.
legame.
He è il gas più comunemente usato in studi CID ad alta E, perché
minimizza la reazione di dissociazione (neutralizzazione
precursore e deviazione ioni prodotto rispetto ad angolo massimo
per la focalizzazione nel secondo settore).
settore).
Tuttavia, l’uso di gas più pesanti come Ar o Xe permette un
maggior trasferimento di E (maggior resa di collisione).
collisione).
L’energia interna acquisita durante la permanenza degli ioni nella
cella di collisione è in media 1–3 eV (con una dispersione
dell’energia fino a 15 eV)
eV) Solo una piccola frazione dell’energia
disponibile è effettivamente convertita.
convertita.
Ricordare che la massima energia che può essere converita in un
sistema dove uno ione con massa 1000 Da ha un’energia di 4 keV
e dove il gas di collisione è elio è 16 eV:
eV:
= 4000 * 4/(1000 + 4) = 15.93 eV
He
N2
Ar
Kr
Xe
4u
28 u
40 u
84 u
131 u
16
1.3. Low-Energy Collision (1-100 eV)
Low-energy CID spectra are measured using QqQ, IT, ICR or hybrid
instruments. For tandem mass spectrometers in space, the
collision chamber is most often a multipole in the RF mode only,
which allows one to focus the ions that are angularly dispersed by
the collision. The pressure difference between the collision cell and
the rest of the analyser is obtained through differential pumping.
At low energy, the ions’ excitation energy is mostly of a vibrational
nature because the interaction time between an ion with mass 200
Da at an energy of 30 eV with a target of a few angstroms is about
10-14 s, corresponding approximately to the bonds’ vibration period.
Heavier gases such as argon, xenon or krypton are preferred
because they allow the transfer of more energy. The collision yields
are extremely high when compared with the energy available, this
is due to the great focusing characteristic of RF-only quadrupoles
and to the length of the collision chamber that allows multiple
collisions.
Positive-ion CID spectra of the [M + H]+ ion of bacitracin A by (B)
vacuum-MALDI-MS2 using a Kratos Axima-QIT (LE-CID) and (C)
vMALDI-MS2 using a prototype Kratos instrument (HE-CID).
34
17
Altri metodi di attivazione
Uno dei principali inconvenienti con CID è la limitazione
dell’energia trasferita a uno ione e quindi la limitazione del suo
grado di frammentazione. Quando gli ioni sono grandi, l’energia è
distribuita su un numero maggiore di legami. Il risultato è una più
lenta velocità di reazione della frammentazione. Inoltre, deve essere
introdotto un gas di collisione dentro lo strumento,
compromettendo il vuoto.
Per evitare questi inconvenienti, sono stati sviluppati altri metodi di
attivazione degli ioni SID (surface induced dissociation), IRMPD
photodissociation or infrared multiphoton dissoc.), ECD/ETD.
Electron capture dissociation (ECD)
Altro metodo di attivazione effettuato senza molecole di gas (oltre a
SID e IRMPD), rimpiazzate da fascio di elettroni.
Per ICR e IT, perché t di residenza e di interazione sono maggiori.
ECD applicata a ioni positivi multicaricati (peptidi lunghi, proteine)
soggetti a un raggio di bassa energia prodotto da un catodo di
emissione. Devono essere usati elettroni a bassa energia (<0.2 eV)
per avere una sezione di cattura sufficiente.
When multiply charged positive ions are irradiated with lowlow-energy
electrons, electron capture occurs with charge state reduction to
produce a radical positive ion that can then dissociate.
dissociate.
The 5–7 eV of recombination energy induces the increase of ion
internal energy that allows its dissociation.
dissociation. This activation process
is very short and it is assumed to occur much faster than 10−14 s.
Because bond dissociation occurs faster than a typical bond
vibration, ECD allows only the direct bond cleavage without prior
randomization of the internal energy.
energy. This explains why this
activation method is well suited to the fragmentation of large ions.
ions.
Bond cleavage can be induced by addition of a low energy because
it occurs before the randomization of this energy over a great
number of vibration modes of a large ion.
ion.
The dissociation obtained by ECD involves the fragmentation of an
odd--electron cation.
odd
cation.
18
Furthermore, from the non-ergodic nature of ECD, it is not
generally the weakest bonds that are preferentially the cleavage
sites but the dissociation of the ion that is restricted to positive
charge sites where the electron is captured. As a result,
fragmentation pathways are governed by radical ion chemistry
and they can be different to all other activation methods. Thus,
ECD is a complementary activation method to CID and IRMPD.
However, from the relatively narrow diameter of the electron beam
compared with the size of the volume where the ions are trapped,
only a small number of ions are activated instantaneously.
Consequently, the overall efficiency of ECD is typically lower than
that obtained with CID and longer interaction times are needed.
[M + nH]n+ + e- [M + nH](n-1)+●
Es.: [M+11H]11+ + e- [M+11H]10+●
Comparison of (a) CID MS/MS and (b) ECDMS/MS techniques in the analysis of modified
polypeptides. Whereas collisional excitation
leads to polypeptide chain unfolding and
losses of labile groups, ECD largely preserves
the secondary structure and the labile groups
38 of
(left panels). This facilitates the assignment
the sites of labile groups
19
It is difficult to perform the ECD method with an ion trap analyser
because the strong electric field applied to the trap affects the
movement of the electrons in the trap. In consequence, electrons
cannot maintain their thermal energy and finally they are expelled
from the trap.
To overcome this limitation, an ECD-like activation method for use
with an ion trap has been developed. This method, which is called
electron transfer dissociation (ETD),
(ETD) uses gas–phase
ion/ion chemistry to transfer an electron from singly charged
anthracene (fluoranthene) anions to multiply charged ions. The
mechanism of this method and the observed fragmentation
pathways are analogous to those observed in ECD.
40
20
Reazioni studiate in MS/MS
MS/MS
Il tipo di reazione più studiato è quello prodotto da collisione con
una molecola neutra N e che porta ad un cambio di massa.
massa. Si tratta
quindi di una dissociazione covalente per espulsione di una specie
neutra:
Se il gas target è una specie chimicamente reattiva,
reattiva, può avvenire
una reazione di associazione,
associazione, che può portare a uno ione addotto
con massa maggiore di quella del precursore:
precursore:
da fullurene a
endohedral
Questi due tipi di reazione avvengono anche con ioni negativi.
Un altro tipo di reazioni prodotte mediante collisione è la variazione
di carica
carica::
1. Scambio di carica
2. Parziale trasferimento di carica
3. Ionizzazione,
Ionizzazione, stripping di carica
o inversione di carica
41
Distinzione fra:
cationi a numero dispari
(odd
odd)) di elettroni (es. radicali
derivanti dall’EI) e
cationi a numero pari
(even)
even) di elettroni (es. la
maggior parte di ioni generati
con tecniche di ionizzazione
soft)
in assenza di azoto
42
21
Frammentazione di cationi con
numero pari di elettroni (EE
(EE+)
ESI, CI
CI,, APCI, MALDI, (APPI), FAB
Cationi più stabili dei radicali
Spettri MS più semplici (meno segnali)
Riarrangiamenti più vari e più frequenti
Spettri danno meno informazioni e sono più difficili da
interpretare rispetto spettri EI
Presente picco della specie molecolare (molecola
protonata o addotto)
Possibile distinguere isomeri e diasteroisomeri
diasteroisomeri,, sia in MS
sia in MS/MS
MS/MS
43
INTERPRETAZIONE DI SPETTRI CID
Per l’interpretazione di spettri CID non esiste una teoria della
dissociazione indotta da collisioni, come nel caso della
ionizzazione elettronica:
elettronica: per questo è molto più complessa.
complessa.
Si può però fare riferimento ad alcune regole derivanti dalla teoria
della frammentazione di ioni con un numero pari di elettroni,
presente in letteratura, tenendo conto però del fatto che a queste
regole corrispondono numerose eccezioni.
eccezioni.
La prima regola si basa sulla stabilità termodinamica dei prodotti
della frammentazione:
frammentazione: sono favorite le collisioni che danno luogo
alla formazione di uno ione ed un frammento neutro stabile.
stabile.
Sperimentalmente si è visto che ioni con un numero pari di
elettroni sarebbero i più stabili.
stabili. Più in generale si ha sempre che la
frammentazione dipende da dove si trova la carica.
carica.
A seconda che si lavori in ionizzazione positiva o in ionizzazione
negativa, le regole poi variano leggermente.
leggermente.
44
22
Ionizzazione positiva (EE
(EE+)
quando si ha la rottura di un legame si ha sempre migrazione di
carica,, anche nel caso in cui si verifichino riarrangiamenti o
carica
ciclizzazioni dei frammenti degli ioni:
ioni
Classificazione di McLafferty per EE+
(frammentazioni che obbediscono alla regola di parità)
1. Rottura di un legame con migrazione di carica
Più facile quando sito
protonato è meno basico:
NH2<SH<OH<I<Br<Cl.
Dipende anche da stabilità
catione formato
2. Rottura di un legame con ciclizzazione e migrazione di carica
molecole
n-butil-XR
Es. amminoalcoli
[M+H-NH3]+ solo per n=4-5
46
23
se si rompono due legami, sia che si verifichi o meno un
riarrangiamento,, la carica rimane dov’è
riarrangiamento
3. Rottura di due legami in uno ione ciclico con ritenzione di
carica
4. Rottura di due legami con riarrangiamento e ritenzione di
carica
Queste poche regole si rifanno alla classificazione di Mc Lafferty per
la dissociazione di ioni positivi
positivi;; la casistica in realtà è molto più
ampia.. Le eccezioni inoltre sono molte e si verificano in particolare in
ampia
presenza di grandi sistemi di elettroni (es.
(es. sistemi coniugati).
coniugati).
Esteri spesso danno ione corrispondente ad acido protonato
Frammentazione che non obbedisce alla regola di parità
(stabilità del radicale gioca ruolo fondamentale)
casi rari e difficili da
predire, spesso in ioni
con estesi sistemi π (es.
tropilio)
48
24
Ionizzazione negativa (EE-)
Studio di anioni in MS sviluppato molto dopo lo studio di cationi:
con EI classica produzione ioni(-) << ioni(+)
Sviluppo dinodi di conversione e sorgenti di ionizzazione idonee
anche per (-)
[M-H]- : solo da composti con funzioni acide selettività
Pathway di frammentazione includono rotture di legame omolitiche,
perdita di uno o più radicali H• (piuttosto comune). Anche perdite di
radicali alchilici.
49
APPLICAZIONI: ACIDI GRASSI
Fatty acids are a class of molecules that are made up of a
long hydrocarbon chain, of varying length and varying
degrees of unsaturation
unsaturation,, terminated by a carboxylic group
group..
Some organisms such as bacteria, sponges and some
plants can produce modified fatty acids
acids::
branchings
branchings;; introduction of a cyclopropane
cyclopropane,, cyclopropene
or epoxy ring;
ring;
hydroxylations or alkoxylations
alkoxylations;;
or even unusual unsaturations
unsaturations..
These fatty acids are interesting not only for their particular
biological activities but also for their rarity, which allows one
to classify and identify the organisms that produce them
much faster than by the classical characterization
techniques
50
25
Collision-induced dissociation FAB/MS/MS trace of octadecanoic
acid acquired in the negative ion mode at high energy.
Frammentazione parte dalla coda,
CnH2n+2 , -14
Poiché la carica negativa in genere è più localizzata di quella positiva, sono
molto frequenti rotture di legami con perdite neutre stabili e ritenzione
della carica sul sito originario.
La frammentazione a carica remota è la regola, a differenza degli ioni positivi
(richiede più Energia)
-28
52
26
-54
53
Per la ionizzazione negativa, la frammentazione a carica
remota è la regola
regola,, perché la carica è fortemente
localizzata (diversamente da modalità positiva).
positiva).
Anche nel caso della ionizzazione negativa, però, le
regole sono superate da numerose eccezioni;
eccezioni; in
particolare si è visto che quando la carica negativa è
delocalizzabile (es
(es.. carbanione),
carbanione), essa diventa mobile e
la frammentazione segue le regole viste per la
ionizzazione positiva
positiva..
54
27
-28?
-CH3•
Elucidation of
fragmentation
mechanisms
-C3H7
137 Th =
corresponding
to 135 Th with
an 18O ior with
two 13C: the
oxygen atom is
preserved in
the fragment.
EI spectrum of p-t-butylphenol. Spectrum A: fragments of the precursor ion
135 Th. This spectrum shows that the ion of m/z 107 results from a loss of
28 Da after the loss of a methyl by the molecular ion. Spectrum B proves
that the oxygen atom is not lost during this fragmentation: the loss of 28 Da
55
is thus a loss of C2H4, not of CO.
Determinazione selettiva di una classe di composti
(es.: carnitine, legate ad acidi di grassi con catene di varia lunghezza)
Spettro CID della
ottanoil-carnitina
protonata
acido ottanoico
covalentemente
legato alla carnitina
56
28
Schema di frammentazione dedotto da spettri di diverse carnitine e
confermato dagli spettri CID dei frammenti precursor scan di m/z 144 e 85
(non contengono acido grasso) o neutral loss di 59 or 161 Da.
Left: FAB spectrum of a crude biological sample containing carnitine
conjugates. Right: the spectrum of the same sample obtained by
detecting the precursors of the 85 Th fragment. At 162 Th, carnitine;
58
at 204 Th, acetylcarnitine; at 218 Th, propionyl; and so on.
29
R1NHSO2+
H
N
m/z =92
- H
+ H
R1NH3
+
+ H
O
S
H2N
+
N HH2RR1
N
O
- H2SO2
(M+H-H2SO2)+
- R1NH2
O
H
+
S
N
H
O
m/z =156
- SO
H
+
O
N
H
m/z =108
59
Trifenilfosfato, picco [M+H
Trifenilfosfato,
[M+H]]+ a
327.1 m/z e il primo frammento
è a 309.1 m/z
m/z,, (H2O). Un H+ è
quello che si lega direttamente
all’O legato al P e che dà luogo
al segnale [M+H
[M+H]]+. E il secondo
protone della molecola di
H2O?? Nella molecola tutti i
protoni sono legati agli anelli
aromatici, non facili da
rimuovere.
Si marca quindi la molecola con
D, in modo da sostituire tutti gli
H degli anelli benzenici. Ora
[M+H
M+H]]+ = 342.2 m/z e il primo
frammento = 322.2 m/z
m/z.. Perdita
è di 20 contro i 18 precedenti o
19 come ci si potrebbe
aspettare
aspettare
H+ catturato
durante ionizzazione non
partecipa alla frammentazione
né nel caso della molecola
marcata né nel caso della
molecola non marcata.
30
OLIGOSACCARIDI
61
FLAVONOIDI
R1
R4
C15 (C6 - C3 - C6) STRUTTURA BASE
O
R2
R3
C
3'
8
O
A
C
7
R1
R2
B
R5
O
R3
5'
2
6'
OH
OH
flavonoli
O
3
6
C
O
4'
2'
O
flavoni
R4
OH
5
4
HO
O
isoflavoni
O
R2
R1
O
R3
•O-glicosidi: più frequenti su OH legato al C-7
•C-glicosidi: più frequenti su C-6 o C-8
OH
HO
O
•O,C-glicosidi
OH
OH
antocianine
31
Domon B, Costello CE. Glycoconjugate J.
1988; 5: 397
0,4
Frammenti contenenti aglicone o
zucchero: Xi, Yi, Zi, con i = numero del
legame interglicosidico contato
dall’aglicone (0, Y0 e Z0).
Per aglicone, i,jA0+ e i,jB0+ = ioni prodotto
contenenti anelli A e B intatti,
rispettivamente, con i e j = legame
anello C rotto.
Xi
0,3
OH
4
Xi
OH
3
HO
0,2
Xi
2
5
O
0
1,3
1
OH
B0
OH
0,1
Xi
0,2
X1
HO
0
O 1
OH
OH
2
HO
O
Y1
Z1
O
HO
4
Z0
O
O
3
O
Y0
1,3
A0
OH
HO
C-glicoside: [M±H]±, [M-nH2O]±
O-glicoside: Y0±
OH
di-O,C-glicoside:
O,C-diglicoside:
OH
Y1±
0,2
molto intenso
Y1± debole,
ma
[Y1 -H2O]±
X0
>
di-O-glicoside: Y0± e Y1±
O-diglicoside: Y0± e Y1±
32
Tricina O-esoso,
esoso,O
O-deossiesoso
O CH3
[M-146-162+H]+
OH
HO
O
O CH3
OH
O
[M-146+H]+
[M+H]+
Luteolina C-deossiesoso,
deossiesoso,C
C-esoso
OH
HO
O
OH
OH
O
[M-nH2O+H]+
[M-162-146+H]+
[M+H]+
33
Identification with reference spectra:
MassBank
68
34
69
70
35

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