Spettroscopia EPR ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE E’ una tecnica basata sull’assorbimento di radiazione elettromagnetica (frequenza nel campo delle microonde) da parte di un campione paramagnetico immerso nelle linee di forza di un campo magnetico esterno. L’assorbimento avviene per ben precise coppie di valori campo-frequenza dipendenti dalla natura del campione (assorbimento risonante). Il paramagnetismo di un sistema è legato alla presenza di elettroni disaccoppiati portatori di momento di dipolo magnetico. Campo elettrico λ Campo magnetico L’ EPR è basato sull’interazione del momento di dipolo magnetico (µ µe) con il vettore magnetico associato alla radiazione EPR: applicazioni biologiche • Piccole molecole coinvolte in reazioni Enzimatiche Rapid freeze-quench EPR • Proteine Fotosintetiche: Reaction Centres, Oxygen evolving complex;Cytochrome b6fComplex • Metalloproteine -Copper (Cu) Proteins: Type I and Type II copper proteins; Multicenter copper proteins -Iron (Fe) proteins: Non-haem Iron proteins and Haem Iron proteins Iron Sulphur Proteins -Nickel: enzimi contenenti Ni -Molybdenum: enzimi contenenti Mb -Tungsten; enzimi contenenti W -Manganese enzimi contenenti Mn EPR: applicazioni biologiche • Spin labeling accoppiata a mutagenesi sito-specifica (SDSL) Site directed spin labelling (SDSL) • Determinazione di concentrazioni e cinetiche di radicali a vita corta mediante spin trapping (ex. Free radicals in tessuti) R R N O + X N O X Nitrosoderivati alifatici o aromatici NMR Resonance freq. (0.32 T) Wavelength Transition energy Rel. population difference Sensitivity EPR EPR 9000 MHz 3.3 cm 3.7*10-5 eV ~10-3 ~1011 spins µ e ≅ 1000 ⋅ µ H NMR 14 MHz ~2200 cm 5.6*10-8 eV ~10-6 ~1017 spins Momento di dipolo magnetico Il momento di dipolo magnetico ( o momento magnetico) è proporzionale al momento angolare ma ha verso opposto: r µe = − g e µ B S r S fattore-g o fattore di Landé g e = 2.0023 per l'elettrone libero magnetone di Bohr µ µB = eh = 9.273 ⋅10−24 JT -1 2me Sono i momenti magnetici ad interagire con un campo magnetico esterno B0 secondo una nota equazione della fisica classica E = -µ µ • B0 Effetto Zeeman Iα>, Iβ> Sono le autofunzioni di spin per l’elettrone su cui operano gli operatori di spin. Sz Iα>= +1/2 Iα> Sz Iβ>= -1/2 Iβ> Traduciamo l’equazione classica.. E = -µe • B0 …in forma operatoriale (µe = -ge µB S) Ĥ = + ge µB Sz B0 E = ge µB Sz B0 Hamiltoniano di spin Applicando Ĥ alle funzioni Iα> e Iβ> si ottiene Ĥ Iα α> = +1/2 ge µB B0 Iα α> Eα = +1/2 ge µB B0 Ĥ Iβ β> = -1/2 ge µB B0 Iβ β> Eβ = -1/2 ge µB B0 In presenza di un campo magnetico gli stati α e β hanno diversa energia Effetto Zeeman Gli stati α e β in un campo magnetico B0 mostrano una differenza di energia che dipende linearmente da g (2.0023 per un elettrone libero) e dal valore di B0 z MS = 1 h 2 x E y α 1 Eα = + gµ B B0 2 ∆E = hν = gµBB0 ∆E = g e µ B B0 0 x β y 1 MS = − h 2 1 EΒ = − gµ B B0 2 z B E’ possibile indurre transizioni tra i due livelli irraggiando il sistema con una radiazione tale che: hν = Eα − Eβ = gµ B B0 L’esperimento EPR L’equazione base dell’EPR hυ = ∆E = g µB B0 suggerisce che la condizione di risonanza possa essere ricercata giocando su due parametri: la frequenza e il campo magnetico. Ragioni tecnologiche spingono ad utilizzare il secondo approccio. Frequenza costante Campo variabile Campo mag. costante Frequenza variabile E E α α 0 0 β β ν0 ν B0 B Lo spettro EPR in onda continua Lo spettro CW-EPR di un sistema S = ½ senza interazioni di alcun tipo si ottiene irraggiando il campione in cavità con la microonda selezionata facendo variare con continuità il campo magnetico in un determinato intervallo. Frequenza costante Campo variabile E α 0 β B0 B Bo B Quando si determina la condizione di risonanza hυ = ∆E = g µB B0 si osserva un assorbimento registrato in termini di derivata prima del segnale. E Saturazione in EPR 0 1/T1 L’assorbimento di mw A prevale sulla emissione stimolata ES − gµ β B0 N +1/ 2 = exp N −1/ 2 kT . A = ES SATURAZIONE (nessun segnale EPR) Il trasferimento di energia non radiativo dal sistema di spin al reticolo (spin-lattice relaxation) tende a ristabilire la differenza di popolazione A RT e per un campo magnetico di 0.35 T (Banda X) la differenza tra le due popolazioni è di circa 1/1000 Dipendenza del segnale EPR dalla potenza delle MW ω1M 0T2 My = 1 + T22 (ω − ω0 ) 2 + ω12T1T2 ω1 = gµ B B1 Saturazione B1 ampiezza del campo mw fattore di saturazione B1 ∝ Pm w 1,0 0,9 0,8 EPR intensity ω12T1T2 ω12T1T2 > 1 0,7 ω12T1T2 << 1 0,6 0,5 No saturazione 0,4 0,3 0 20 40 60 80 ( Microwave power P )1/2 mw 100 Interazione Zeeman: fattore-g Spin-orbit coupling geff ≠ ge ∆E = hν = geffµ BB0 geff µB B0 B Il tensore g Il risultato dell’esperimento può essere descritto dal seguente Hamiltoniano H 0 = µ B B% 0 g S g è una matrice 3x3 ( o tensore di secondo rango) che modula l’interazione tra il campo magnetico e lo il momento magnetico associato allo spin g xx g yx g zx g xy g yy g zy g xz g yz g zz E’ sempre possibile trovare una terna di assi per cui la matrice è diagonale DT tij= 0 (i≠j) ASSI PRINCIPALI La diagonalizzazione corrisponde ad una rotazione degli assi: U T U-1 = DT gxx 0 0 D g = 0 gyy 0 0 0 gzz Anisotropia del fattore g Dipendenza orientazionale delle righe di risonanza EPR: gxx=2.0085 . gyy=2.0065 gzz=2.0027 High field EPR: risoluzione dell’anisotropia di g Fattori-g di alcuni composti paramagnetici di rilevanza biologica Flavin semiquinone, ubiquinone, ascorbate, etc Nitroxide spin labels and traps g-value 2.0030 2.0050 2.0020 2.0090 sulphur radicals : S-S, S-H MoV (in aldehyde oxidase) Cu2+ Fe3+ (low spin) Fe3+ (high spin) 2.02 - 2.06 1.94 2.0 - 2.4 1.4 - 3.1 2.0 - 10 •Molecole con un elettrone spaiati in orbitali di atomi leggeri, di tipo organico o contenenti metalli di transizione della I serie sono caratterizzati da fattori-g ≅ 2.0023 •Molecole con un elettrone o piu’ elettroni spaiati in orbitali di atomi pesanti sono caratterizzati da fattori-g che si discostano anche notevolmente da 2.0023 e da forte anisotropia. Lo spin dei nuclei Anche i nuclei hanno momento angolare di spin (I). Ad esso corrisponde un momento magnetico µN con la stessa direzione e verso di I. Il numero quantico I relativo allo spin nucleare può assumere valori interi o seminteri incluso lo zero. Le regole di quantizzazione sono quelle di ogni momento angolare Per il nucleo d’idrogeno (1H): I=½ a.n. = 99.985 gN = 5.5856912 µN = 28.212x10-27 JT-1 µ = gNµNI = γNI r I I Nucleo 0 12C, 16O ½ 1H, 13C, 15N, 31P 1 2H, 14N 3/2 23Na, 35Cl, 37Cl, 39K, 41K, 63Cu, 65Cu 5/2 17O, 27Al, 55Mn In un campo magnetico B0 il momento magnetico nucleare assumerà, se I = 1, tre valori permessi (uno dei quali è zero) In generale i valori sono 2I+1 14N 99.63% , 15N 0.366% Hyperfine interaction r r Hˆ = S AI A = a1 + A' Electron spin density at nucleus: ISOTROPIC a a ∝ g e β e g N β N ψ (r = 0 ) 2 Dipolar coupling to nucleus: ANISOTROPIC A’ Spettri EPR di un sistema S=1/2, I=1/2 (H) Hˆ = µ B gBSˆ z − g N µ N BIˆz + aiso Iˆz Sˆ z Campo nullo Zeeman elettronico ½geµBB Zeeman nucleare ½gNµNB0 Accoppiamento iperfine a/4 Costante di accoppiamento iperfine E1 αe αn 0 -½gNµNB0 ≈ ½gNµNB0 ≈ -a/4 a/4 E2 αe βn E3 βe βn B0 BI -½geµeB0 -½gNµNB0 -a/4 regole di selezione per EPR sono: E4 βe αn ∆Sz = ± 1 e ∆ Iz = 0 BII B L’intensità relativa delle righe spettrali dovute all’accoppiamento con nuclei con I=1/2 è data dai coefficienti dello sviluppo binomiale (a+b)n. Per calcolare questi ultimi si può utilizzare il triangolo di Tartaglia. Nuclei (I=1/2) Equivalenti Intensità relativa 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 9 1 1 8 9 10 35 1 5 15 35 70 126 1 4 20 56 84 3 10 21 1 6 15 28 36 3 5 7 2 4 6 1 6 21 56 126 1 1 7 28 84 1 8 36 1 9 1 k ∏ ( 2n I k k + 1) n = number of equivalent nuclei k =1 k = sets MS n=4 I = 1/2 (ex.H) k=1 n=1 I = 1 (ex. N) k=1 MI Anisotropic Hyperfine interaction: H = b S g(W) B orientational sensitivity of EPR spectra + S A(W) I disorded sample PROTEINS
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