SDSL-EPR: Site Directed Spin labeling-EPR Uno spin label, generalmente nitrossido, viene introdotto nella proteina mediante mutagenesi sito specifica rendendo possibile un’indagine paramagnetica mediante EPR e SDSL (1-oxil-2,2,5,5-tetramethylpyrroline-3methyl)methanesulphonate • Si produce un mutante sitospecifico sostituendo un amminoacido pre-esistente con cisteina. Si fa reagire la cisteina con un nitrossido funzionalizzato, generalmente un metanotiosulfonato ex. MTSSL Cys native AA Cys SDSL e struttura proteica Proprietà dello SL • Dinamica Parametro sensibile <g>, <A>=f(ω,τ,∆Ω) J=f(ω,C) • Accessibilità (CROX or NiEDDA;O2) • Interazione Dipolare D=f(1/r3) Modelli di domini proteici Interazioni proteina-proteina Cambi conformazionali Spettro EPR del radicale nitrossido: H = βe S g B +SAI gx=2.0091, gy=2.0061, gz=2.0023 I=1, Ax= 6.2, Ay = 6.3, Az=33.6 z x y Segnale di polvere in proteina spettro risultante appare con 5 bande Dinamica L’anisotropia di g ed A rende il nitrossido sensibile alla mobilità della biomolecola cui si trova legato Il moto molecolare modula nel tempo l’anisotropia e lo spettro EPR del nitrossido cambia aspetto a seconda dello stato dinamico della biomolecola marcata. La libera mobilità molecolare provoca il time averaging degli elementi della diagonale principale dei tensori g ed A g = 1/3 (gxx+gyy+gzz) A = 1/3 (Axx+Ayy+Azz)=aiso ne risulta uno spettro EPR caratterizzato da tre bande: VARIAZIONI di M O B I L I T A’ - temperatura - ingombro sterico - interazioni ∆H0 e <H2> parametri spettrali correlati alla mobilità: dipendono dalla mediazione di g e A rispettivamente ∆H0 : sensibile alla mediazione di g ∆H 0 ( B − B ) I ( B )dB ∫ = ∫ I ( B)dB 2 H 2 0 Secondo momento sensibile alla mediazione del tensore A Andamenti per 1/∆ ∆H0 e 1/<H2> parametri di mobilità: ∆H0 5.5 <H2>-1 Gauss-2*1000 mobile immobile loops 5.0 4.5 helix surface 4.0 tertiary interaction buried 0.1 0.2 0.3 0.4 < ∆ H0>-1 Gauss-1 0.5 <H2> Periodicità di “mobilità” per eliche per metà esposte e per metà in contatto terziario < ∆ H0>-1 Gauss-1 <H2>-1 Gauss-2*1000 scanning via SL l’elica H della lisozima T4L : Periodo delle oscillazioni=3.6! residue Accessibilità Π rilassamento collisionale con molecole paramagnetiche: CROX: potassium-tris(oxalatochromate) carico O2: si ripartisce nella fase lipidica non polare entrambi esclusi dal core della proteina CROX fase acquosa O2 CROX CROX CROX O2 R S NO CROX CROX CROX O2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 membrane O2 Curve di saturazione In presenza di rilassatore In assenza di rilassatore A ∆H0 P1/2: livello di potenza al quale l’ampiezza del segnale saturato è metà dell’ampiezza max. Teorica in assenza di saturazione Parametro determinabile sperimentalmente ∆P1/2: differenza nei valori di P1/2 dello SL in presenza e in assenza di rilassatore Accessibilità A = ampiezza max. Π = f(∆P1/2) L’accessibilità varia periodicamente lungo una sequenza con struttura secondaria regolare se vi è asimmetria nell’intorno Max O2 Water-soluble protein Transmembrane water filled pore Surface adsorbed helix SDSL-EPR Come ottenere vincoli basati su determinazioni di distanze per l’elaborazione di modelli molecolari strutturali: Site Directed Spin Labeling Dipolar Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy (SDSL - EPR) Resonance Energy Transfer (FRET) DSDSL ed EPR Interazione dipolo-dipolo tra DUE SPIN LABELS: Interazione Dipolare D=f(1/r3) • allargamento degli spettri EPR • dall’analisi spettrale si risale alla misura della DISTANZA Energia di interazione tra dipoli magnetici µ1 e µ2 posti a distanza r: r r r r r r µ 0  µ1 ⋅ µ 2 3(µ1 ⋅ r )(µ 2 ⋅ r )  − U dipolar =   5 4π  r 3 r  proporzionale a (1-3 cos2θ) dove θ è l’angolo tra il vettore interspin e il campo magnetico esterno B g β µ0  sˆ1sˆ2 3( sˆ1r )( sˆ2 r )  ˆ H SS =  3 −  5 4π  r r  2 θ r 2 3 gβ (3 cos 2 θ − 1) ∆Bdip (r ,θ ) = 2r 3 ∆ B dip ( r , θ ) Studio del movimento di domini proteici indotto dall’entrata del substarto nella lisozima T4L Allargamento spettrale dovuto all’interazione dipolare. Misure a temperatura ambiente Hubbel et al. 2000, Nature struct.Biol,7,735