FETAL TRISOMY 21, 18, 13

FETAL TRISOMY 21, 18, 13
NIPT
Non Invasive Prenatal Test
cell free fetal DNA in maternal blood
June 2014
FETAL TRISOMY 21, 18, 13
NIPT
Non Invasive Prenatal Test, cell free fetal DNA in maternal blood
Novembre 2014
Lamberto Camurri
Antonio Novelli
Schede tratte dalle lectures
OSPEDALE di Circolo e Fondazione Macchi, Varese. Test Genetici: cosa fare? Diagnosi Prenatale non Invasiva. Corso ECM. Varese 9 dicembre 2013.
CC VILLA SERENA Genova. Diagnostica Prenatale. Test su DNA fetale in sangue materno: tecnica, limiti, consulenza. Corso ECM. 24 Gennaio 2014.
CAM LABCO. Monza. NIPT. DNA fetale nel plasma materno: dai trials alla clinica. NIPT on field: esperienza sul campo. Corso ECM. Monza 31 Marzo
2014
SIGU Riunione scientifica congiunta: NIPT, potenzialità, limiti e proiezione futura. Round Table, Roma 1 Aprile 2014.
GYNEPRO Bologna. Giornate Medico Scientifiche. Identificazione non invasiva delle aneuploidie fetali nel sangue materno: metodiche a confronto. Corso
ECM. Bologna 16 Maggio 2014
RDI PADOVA. Prevenzione preconcezionale, diagnostica predittiva non invasiva e tutela per il futuro. Limena (PD) 29 maggio 2014
UNIVERSITA’ DI PARMA UOC Ostetricia e Ginecologia. Nuove prospettive nella Diagnosi Prenatale. NIPT, Non Invasive Prenatal Test. Corso ECM.
Parma 4 Giugno 2014
SCUOLA MEDICA OSPEDALIERA ROMA. XGS, NIPT, RT-PCR. Novità, orientamenti, percorsi diagnostici. Corso ECM, Roma 9-10 giugno 2014
UNIVERSITA’ DI PADOVA-DIMED . Corso Perfezionamento Nuove Tecnologie Medicina Molecolare 2013/2014. Padova 6 Novembre 2014
RDI Rete Diagnostica Italiana, Padova. Ospedale San Pietro Fatebenefratelli, Roma. Mendel Genetica Medica, Modena. Università Tor Vergata Genetica Medica, Roma.
Norton M, et al. ACOM meeting 2014, oral presentation
ccfDNA NIPTest. L’origine. Il DNA fetale presente nel
plasma materno proviene dalla placenta
Nel sangue materno in gravidanza sono presenti cellule fetali nucleate e DNA libero non
cellulare in sospensione nel plasma.
Il DNA libero non cellulare (cffDNA) proviene da cellule della placenta.
Il citotrofoblasto placentare si ancora alla decidua parietale.
Le arterie spirali della decidua irrorano le lacune fra decidua e placenta.
Il citotrofoblasto invade e tappezza le pareti delle arterie spirali e ne causa il rimodellamento.
Il ricambio delle cellule del trofoblasto che tappezzano le pareti delle arterie spirali per morte
cellulare o apoptosi (citochine - mediata) determina la frammentazione del DNA in
degenerazione.
I frammenti di DNA hanno dimensioni di circa 180 bp (paia di basi) e si sospendono nel
plasma arterioso.
La presenza di DNA del trofoblasto (feto) libero nel plasma (cffDNA) si riscontra a partire
dalla 5^ settimana di gravidanza, ma la quantità è sufficiente per i test a partire dalla 10^
settimana.
Anche la degenerazione degli epiteli materni libera frammenti di DNA sospesi nel plasma a
generare un miscuglio di DNA di madre e placenta-feto.
La cattura del DNA fetale
GENOME 3.2
BILLION bp
Il genoma umano è costituito da 3,2 miliardi di paia di basi.
Il cromosoma 21 da 50 milioni di paia di basi, 1,5% del totale. La ricerca del DNA fetale può
avvenire sequenziando i frammenti di tutto il genoma o selezionando solo i frammenti dei
cromosomi che interessano.
Un campione di sangue materno dopo la 10^ settimana di gravidanza contiene circa 65000
frammenti di DNA del cromosoma 21, ciascuno di 180 paia di basi.
La linea di sequenziamento è l’unità operativa del test.
Ogni linea di sequenziamento (sequencing lane) può leggere 100 Gbasi (100 milioni di blocchi/
reads) di basi DNA.
In una linea di sequenziamento devono stare un numero di campioni sufficiente da confrontarli fra
loro e prevedere la probabilità che ciascuno di essi sia disomico o trisomico.
Le tecniche di sequenziamento di ultima generazione (Next Generation Sequencing, XGS)
consentono di quantificare e analizzare i frammenti di DNA circolante.
Due tecniche:
MPSS sequenzia in modo massiccio tutto il genoma senza distinguere i comosomi di interesse.
DANSR sequenzia i frammenti di DNA selezionati per i cromosomi di interesse.
La cattura del DNA fetale: sequenziare il genoma
Per individuare una trisomia 21 sequenziando tutto il genoma occorre un numero di blocchi di
lettura di sequenze grande abbastanza da rivelare un aumento del 30% dei blocchi relativi al
Cromosoma 21.
Ogni linea di sequenziamento (sequencing lane) può leggere 100 Gbasi (100 milioni di blocchi/
reads) di basi DNA.
In una linea di sequenziamento devono stare un numero di campioni sufficiente da confrontarli fra
loro e prevedere la probabilità che ciascuno di essi sia disomico o trisomico.
25 million reads
MPSS, massive parallel shotgun sequencing (Verinata Verifi, Sequenom MaterniT21, BGI Nifty)
Analizza in modo indiscriminato tutti i cromosomi.
Per identificare una trisomia 21 servono 25 Gb (25 milioni di blocchi) di letture di sequenza in una
linea che ne legge 100 milioni. Se vengono analizzati blocchi più piccoli, 10 milioni o 17 milioni per
esempio, la dose di frammenti del campione trisomico non si distingue da quello disomico.
MPSS esegue non più di 4 o 5 test in contemporanea per linea.
L’analisi massiccia di tutti i cromosomi evidenzia le differenze di densità di basi GC che ostacolano
il risultato. Il campione con trisomia 21 può non essere identificato.
E’ necessario introdurre un Fattore di Normalizzazione (CNV) che consente di rendere confrontabili
i blocchi di lettura delle sequenze.
CNV
La cattura del DNA fetale: sequenziare solo i cromosomi 21,
18, 13 Per identificare una trisomia 21 (o 13 o 18) è possibile selezionare i frammenti di DNA dei
cromosomi, eliminando il resto del genoma.
Ogni linea di sequenziamento (sequencing lane) può leggere 100 Gbasi (100 milioni di blocchi/
reads) di basi DNA.
In una linea di sequenziamento devono stare un numero di campioni sufficiente da confrontarli
Fra loro e prevedere la probabilità che ciascuno di essi sia disomico o trisomico.
DANSR (Ariosa Harmony)
Esegue il sequenziamento (high multiplexed) selettivo dei frammenti di DNA (DANSR) solo dei
cromosomi 21, 18, 13.
La selezione dei frammenti avviene ibridando sonde fluorescenti a:
576 marcatori STR non polimorfi dei cromosomi (21, 18, 13) per la ricerca delle trisomie
192 marcatori STR polimorfi di cromosomi fra 1 e 12 per definire la frazione fetale di
ciascun campione.
Solo i frammenti agganciati alle sonde fluorescenti verranno sequenziati per il dosaggio e la
elaborazione.
1 million reads
Per identificare una trisomia 21 serve 1 milione di blocchi di sequenza.
Se vengono analizzati blocchi più piccoli, la dose di frammenti del campione trisomico non si
distingue da quello disomico.
DANSR esegue 96 test per linea di sequenziamento.
Sparks AB et al. AJOG 2012, 319e2
La quantità del DNA fetale: il test deve indicare la
frazione fetale del campione La frazione fetale minima di ciascun cromosoma per poter identificare una trisomia è il
4%. Con questa percentuale il rapporto di letture di sequenze fra un feto normale e uno
trisomico è 1,02, che è il rapporto minimo per identificare la trisomia.
MPSS (Verinata Verifi, Sequenom MaterniT21, BGI Nifty)
Questo metodo analizza in modo indiscriminato tutti i cromosomi, e al momento non
riporta i loci polimorfi dei singoli campioni necessari per definire la quantità di frazione
fetale.
L’esito/test report non riporta la frazione fetale.
DANSR (Ariosa Harmony)
Esegue il sequenziamento multiplo (high multiplexed) dei frammenti di DNA (DANSR).
Per definire la frazione fetale vengono usati 192 loci polimorfi (SNP di cromosomi
1-12) per la distinzione feto – madre.
Tale reazione avviene contemporaneamente al sequenziamento per i cromosomi 21, 18,
13.
L’esito/test report riporta la frazione fetale del campione.
Fetal Frac)on Expected ra)o for Trisomy 4% 1.02 10% 1.05 20% 1.10 40% 1.20 Calcolo del rischio di trisomie 21, 18, 13
Il test calcola il rapporto di verosimiglianza fra le probabilità che i campioni
contenuti in una linea di sequenza siano disomici o trisomici.
MPSS (Verinata Verifi, Sequenom MaterniT21, BGI Nifty)
Algoritmo per definire il valore soglia di rischio trisomia basato su: One sample set
Il calcolo su singolo campione è reso necessario dal ridotto numero di test per linea di sequenza.
1)  ipotesi binaria positivo-negativo con t-Student (z-score) e Likelyhood Odds Ratio (rapporto di
verosimiglianza).
2) fattore di normalizzazione di sequenza CNV.
3) Variazioni di corsa fra le varie linee di sequenziamento corrette con un algoritmo z-score.
4) Definizione di un valore soglia per la trisomia (valore di z-score fra 3 e 4)
L’algoritmo non considera la frazione fetale. Quindi con frazione fetale bassa i valori di score
+/- sono molto vicini, aumentando la possibilità di falso positivo e negativo.
DANSR – FORTE (Ariosa Harmony)
Algoritmo per definire il valore soglia di rischio trisomia basato su: Multiple sample set
Il calcolo su campioni multipli è reso possibile dalle piccole dimensioni del blocchi di lettura di
sequanza (1 milione di reads) che consente l’analisi in una linea di sequenza di 96 campioni che
vengono paragonati fra lori.
1) Ipotesi percentuale con Odds ratio (rapporto di verosimiglianza) fra modelli disomico/trisomico,
(curve normali di distribuzione)
2) Calcolo della frazione fetale
3) Montecarlo Simulation che inserisce anche età materna e epoca gestazionale nel calcolo
dell’algoritmo FORTE.
L’algoritmo considera la frazione fetale. Quindi i valori dello score con frazione fetale bassa
sono normalizzati consentendo una valutazione del rischio indipendente dalla quantità di DNA
fetale.
Sparks AB et al. AJOG 2012, 319e2
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA: companies
Gli agreements
internazionali sono
configurati sui tests delle
companies indicate e
sulla produzione
scientifica collegata ai
trials clinici che hanno
dimostrato i dati di
sensibilità e specificità
dei NIPT.
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNAcffDNA: studi di validazione e
discrepanze placentari. Il paragone CVS trophoblast vs. cffDNA negli studi di validazione 2011-2013
Mosaicismo confinato a CVS trophoblast : falsi negativi e falsi positivi
NIPT performance metaanalis in studi validazione (PubMed 2011-2013)
La sensibilità (detection) di un test è la capacità del test di identificare i soggetti che presentano la malattia
La specificità di un test è la capacità del test di identificare i soggetti sani
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA: studi di validazioneand e
discrepanze placentari. Mosaicismo confinato a CVS trophoblast : falsi negativi e falsi positivi
False negative
trophoblast
False positive
trophoblast-all
False positive
trophoblast
CPM>30%
Trisomy 21
0.2 ‰ (52000)
8 vs 1073 T21
1.1 ‰ (52000)
57 vs 1073 T21
0.8 ‰ (52000)
39 vs 1073 T21
Trisomy 18
0,1‰ (52000)
6 vs 376 T18
1.1 ‰ (52000)
54 vs 376 T18
0.6 ‰ (52000)
32 vs 376 T18
Trisomy 13
sporadic
1 vs 135 T13
2.5 ‰ (52000)
127 vs 135 T13
1.7 ‰ (52000)
84 vs 135 T13
Total false negative rate 0.08 ‰
Grati FR et al. Genetics in Medicine advance online publication 13 February 2014. doi:10.1038/gim.2014.3, modified
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA: falsi negativi
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA: falsi positivi
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA: performances in
popolazione generale
La sensibilità (detection) di un test è la capacità del test di identificare i soggetti che presentano la malattia
La specificità di un test è la capacità del test di identificare i soggetti sani
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA e test combinato:
confronto delle performances
Non-invasive EXamination of Trisomy (NEXT) Study: Directed Cell-Free DNA Analysis versus 1st Trimester Combined Screening for Trisomy 21 Risk Assessment in a Large Routine Pregnancy Population
NEXT
T21
FTS
Detection rate
Specificity
DR
FPR
HARMONY
Total 18955
FTS screen +
843
77.8%
100%
45
Harmony high
T21
28
28/36
36/36
36
T21
Analysis 15086
Euploid
815
9
Euploid
MA 30.7 (18-48)
FTS screen -
14243
15041
Eligible 18432
Fetal fract. 11.8%
T21
Gest. Age 10-14w
Euploid
Norton M, et al. ACOM meeting 2014, oral presentation
8
5.4%
0.06%
0
14235
815/15050
9/15050
15041
Harmony low
T21
Euploid
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA: performances
Aneuploidie cromosomi X e Y
Sex aneuploidy
Birth prevalence (with mosaics)
X0*
1 in 1,893 girls
XXX
1 in 947 girls
XXY
1 in 576 boys
XYY
1 in 851 boys
X0 female somatic rate
*Test performance Monosomy X1-4
● 
Detection rates 66-95% with wide confidence intervals
● 
False positive rates up to 1%
● 
Performance for mosaics unknown
CVS
False negative
trophoblast
False positive
trophoblast-all
False positive
Trophoblast
CPM>30%
Monosomy X
0.2 ‰ total
11 vs 148 MX.
5.5 ‰ total
278 vs 148 MX
4.0 ‰ total
198 vs 148 MX
1. Nielsen et al. Human Genetics 1991, 87: 81-83.
2. Thompson & Thompson Genetics in Medicine, Sixth Edition. Robert L. Nussbaum, Roderick McInnes, Willard Huntington.
Saunders, 2001.
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA: performances
Gravidanze gemellari/multiple
Twins/multiple
2 max
Valore di rischio distribuito
regular
No sex, no identificazione feto affetto
IVF
No sex, no identificazione feto affetto
Oocytes etero
No sex, no identificazione feto affetto
192 cases* Detection
Retro, 10/11; Prosp, 3/3 Trisomies
Specificity
100% no false positive
DNA fetal fraction
m 7,4% (12% single)
*Gil M et al 2013
Fetal Diagn Ther 10.1159
I test NIPT sono eseguibili in
gravidanze con due feti, sia da
fecondazione naturale che
assistita, anche con
ovodonazione.
La casistica è ridotta quindi la
performance del test non è
validata. Il rischio di falso
negativo dipende da due fattori:
La frazione fetale nelle
gravidanze twin è in media più
bassa che in quelle singole, il
che si lega anche alla
possibilità che vi sia un feto
predominante come sviluppo e
come contributo di DNA fetale
al test.
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA:
nuovo paradigma, le microdelezioni
I test NIPT su cffDNA sono in grado di cercare la presenza di microdelezioni. Le
companies hanno sperimentato la identificazione delle microdelezioni causanti le più
comuni sindromi da microdelezione. Al momento i test non sono supportati da trials di
validazione in vivo su pazienti gravide, la specificità è bassa con falsi positivi dovuti a
imprecisioni di sequenziamento. Nessuna Società Scientifica o College ha attivato
criteri di agreement.
Natera Panorama:
22q deletion syndrome (DiGeorge syndrome), 1p (1p36 deletion syndrome), 15q
(Prader-Willi/Angelman syndromes), 5p (Cri-du-chat syndrome)
Maternity21 plus. (PPV 60-90%)
22q deletion syndrome (DiGeorge syndrome), 5p (Cri-du-chat syndrome), 15q
(Prader-Willi/Angelman syndromes) 1p (1p36 deletion syndrome)
BGI Nifty:
2p33.1 deletion syndrome, 5p (Cri-du-chat syndrome, 1p (1p36 deletion syndrome)
Verinata Verifi:
22q deletion syndrome (DiGeorge syndrome), 5p (Cri-du-chat syndrome) 15q (PraderWilli/Angelman syndromes) 1p (1p36 deletion syndrome), 4p (Wolf Hirschhorn
syndrome)
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA:
1-2nd Trimester Screen Flow
U/S
with
NT
NIPT
• 
• 
• 
low risk NIPT
increased NT
abnormal US
10
11
HIGH RISK
12
CVS
• 
• 
• 
13
ANATOMY
U/S
LOW RISK
high risk NIPT
increased NT
abnormal US
14
15
• 
16
maternal choice
17
18
AMNIO
19
20
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA:
1-2nd Trimester Screen Flow
• 
• 
• 
10
• 
• 
high risk NIPT
increased NT
abnormal US
11
12
13
14
• 
high risk NIPT
abnormal US
15
16
17
18
CVS
Deletion/duplication
500,000 DNA bases
19
20
AMNIO
• 
• 
• 
• 
abnormal US
Deletion/duplication
15,000,000 DNA bases
Identificazione delle Trisomie Fetali con cffDNA:
Opzioni finali
So Mom..
..break the
News….
…but
informed….

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