あなたのクローニングにかかる手間と時間はもっと減らせるはずです ! In-Fusion クローニングのススメワケ 1 『なぜ In-Fusionクローニングは簡単・便利なのか？』その理由とは・・・ 2 他社同タイプキットとの比較 ― 目的クローンの割合／変異の入りにくさ ― 3 ユーザー様実施例のご紹介 4 「使ってよかった！」ユーザーズボイスのご紹介ウェブサイト http://www.takara-bio.co.jp 1 ワケ『なぜ In-Fusion クローニングは簡単・便利なのか？』その理由とは・・・ In-Fusion クローニングの特長 ✔ どんなベクターのどんな位置にもディレクショナルクローニングが可能 ✔ 短鎖から長鎖（50 bp∼15 kb）まで効率よくクローニングが可能 ✔ 一挙に複数 DNA 断片を挿入するマルチクローニングが可能 ✔ In-Fusion 反応はわずか 15 分で完了 In-Fusion を使用した簡単・便利なクローニングの概要＜In-Fusion クローニングのルール＞ベクター上の挿入したい位置の両側 15 塩基と相補的な配列が、目的遺伝子の各両末端にあればよい。 PCR でベクター＆目的遺伝子の調製を行えば、In-Fusion 反応にそのまま使える線状化ベクターと目的遺伝子が簡単に準備できます！ ① 線状化ベクターと目的遺伝子の準備ベクター ② 5×In-Fusion® HD Enzyme Premix & dH2O にベクターと目的遺伝子を加えて In-Fusion 反応 ③そのまま形質転換へ！お好きなベクターの挿入したい位置からぐるっとインバース PCR 線状化ベクター準備 OK 目的遺伝子目的遺伝子準備 OK ベクターの両末端と相補的な配列 15 塩基を付加したプライマーで目的遺伝子を PCR In-Fusion 反応はわずか 50℃、15 分※！ ※EcoDry タイプの場合は 37℃15 分＋50℃15 分です。！ PCR を使用した In-Fusion クローニングを行えば、制限酵素やライゲーションキットによる切り貼りが一切必要ありません。だから In-Fusion クローニングは簡単・便利なのです！ ◆ 耳より情報 ◆ In-Fusion 反応のプライマー設計は、無料オンライン設計ツールを使うと簡単にできます。 http://www.takara-bio.co.jp/infusion-tool/ までアクセス！ -1- In-Fusion クローニングのススメ Online Tools for In-Fusion 事実、PCR を使った In-Fusion クローニングで実験にかかる時間を約 1 日短縮できます！ PrimeSTAR® Max 他社 PCR 酵素 × 従来のクローニングキット In-Fusion HD PCR 増幅 PCR 増幅増幅確認増幅確認 1日目増幅産物精製 In-Fusion 反応制限酵素消化・精製トランスフォーメーションベクターの脱リン酸化インサート確認 1日目 2日目 2日目ライゲーション反応トランスフォーメーションインサート確認でも、不安も… 5 秒／kb の伸長能をもつ PrimeSTAR ® Max DNA Polymerase（製品コード R045A/B）は、 5 kb の PCR 増幅が約 60 分 ※1 で完了します。目的 DNA 断片の増幅はもちろん、PCR 増幅によるベクターの線状化にもおススメです。また、In-Fusion 酵素によるディレクショナルクローニングでは、目的 DNA 断片の制限酵素処理が不要なため、PCR 増幅した目的 DNA 断片とベクターとを混合し、In-Fusion 反応（15 分）を行うだけでベクターへの挿入が完了し、大腸菌へのトランスフォーメーションに進めます。※2 ® 3日目少ステップで約 1日短縮！ ※1：鋳型によっては1 分／kbの伸長反応が必要です。詳しくは説明書をご確認ください。 ※2：ベクターの線状化は制限酵素処理でも可能です。脱リン酸化は不要です。実験時間はおよその目安です。不安①：ベクターの調製に PCR を使ってエラーは大丈夫？不安②：長い配列や GC リッチ領域もちゃんと増やせるの？大丈夫です。高正確性と高反応性を兼ね備えた PCR 酵素「PrimeSTAR®」を使ってベクターや目的遺伝子の PCR 増幅を行えば、そんな心配は無用です。 ■ 推奨する PrimeSTAR® の特長 ※反応回数は50 µl 反応系での回数です。製品名特長容量（※） PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase ヒトゲノムDNAなら約 30 kbまで増幅 OK。 GCリッチ領域にも強く高い汎用性をもつ。 PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 最も高い正確性を誇り、高速反応が可能。ヒトゲノムDNAなら約 6 kbまで増幅 OK。製品コード価格（税別） R050A ¥37,000 R050B ¥105,000 100 回 R045A ¥31,500 400 回（A×4） R045B ¥101,000 250 U 1,000 U（A×4）【注】In-Fusion® HD Cloning Plus シリーズには、PrimeSTAR® Max に相当するクロンテック製高正確性 PCR 酵素「CloneAmp™ HiFi PCR Premix」がコンポーネントとして含まれています。（In-Fusion® の製品リストは最終ページを参照）ご存知ですか？その優れた特長からIn-Fusion® は世界中の研究室で広く利用されています ▪CRISPR システムにおいて、In-Fusion® HD Cloning Kit を用いて Cas9 発現ベクターを構築した例 CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Gilbert LA. (2013) Jul 18; 154(2):442-451 ▪ハイスループットで 4 分子解析を行うために、In-Fusion ® HD Cloning Kit を用いてプラスミドライブラリーを構築した例 High-throughput tetrad analysis. Ludlow CL. (2013) Jul; 10(7):671-675 ▪In-Fusion ® と PrimeSTAR ® を用いてプラスミドを構築した例 Mitotic cell rounding accelerates epithelial invagination. Kondo T. (2013) Feb 7; 494(7435):125-129 ★弊社ウェブカタログでこのほかにも「使用文献」をご紹介しています。 In-Fusion クローニングのススメ -2- 2 他社同タイプキットとの比較（1） ― 目的クローンの割合― 目的 In-Fusion® と A 社キットを比較して、どちらのキットが目的のクローンをきちんと得られるかを検証方法 H I で切断した pUC19 を使用した。・クローニングベクター：：それぞれ推奨のプロトコールに従った。・反応条件 A 社キットの反応時間は15∼60 分であるため、マルチクローニングの場合のみ 60 分の反応条件でも行った。：クロンテック社 Stellar ™ Competent Cells（製品コード 636763 等）を使用した。・形質転換・目的クローンの割合：「Vector ＋ Insert」で出現したコロニーから 26 個をピックアップしてシーケンスを行い、正しい配列のコロニー数から算出した。（1）マルチクローニングの場合 2.7 kb のベクターに、MBP（1.1 kb）、PROF12（0.7 kb）、AcGFP（0.7 kb）の 3 種類のインサート DNA を同時にクローニングするマルチクローニングを行った。結果 A 社キット In-Fusion® HD Cloning 反応条件 50℃、15 分 50℃、15 分 50℃、60 分 Vector ＋ Insert 89コロニー 111コロニー 392コロニー 1コロニー 39コロニー 78コロニー 100％（26 / 26） 19%（5 / 26） 73％（19 / 26） Negative Control（no insert）目的クローンの割合・In-Fusion® に比べ、A 社キットでは Negative Control のコロニー出現数が圧倒的に多かった。・50℃、15 分における反応において、目的クローンの割合は In-Fusion® では100% だったが、A 社キットは19% と低かった。（2）シングルクローニングの場合 2.7 kb のベクターに、1種類のフラグメント（MBP：1.1 kb）のシングルクローニングを行った。結果 In-Fusion® HD Cloning A 社キット反応条件 50℃、15 分 50℃、15 分 Vector ＋ Insert 635コロニー 401コロニー 1コロニー 39コロニー Negative Control（no insert）目的クローンの割合 100％（26 / 26） 96％（25 / 26）・シングルクローニングの場合も、In-Fusion® は目的クローンの割合が100% だった。・In-Fusion® に比べ、A 社キットでは Negative Control のコロニー出現数が多かった。！ -3- ここが大事！ In-Fusion® と A 社キットは同じような製品に見えますが、クローニングで大事な「目的クロ優っていました。無駄のない、効率的で正確なクローニングのために、In-Fusion® をお使いください！ In-Fusion クローニングのススメ 2 他社同タイプキットとの比較（2） ― 変異の入りにくさ― 目的 In-Fusion® と A 社キットを比較して、どちらのキットが連結する際に変異が入りにくいかを検証方法非常に正確性の高い PrimeSTAR ® シリーズの酵素を用いて PCR 増幅したベクターおよびインサートを、両キットのクローニング反応に使用した。・クローニングベクター：pUC19 を PrimeSTAR ® GXL DNA Polymeraseで PCR 増幅して線状化・インサート（5 kb）：PrimeSTAR ® Max DNA Polymeraseで PCR を行い増幅・反応条件：それぞれ推奨のプロトコールで行った（相同配列部分：15 bp、反応：50℃、15 分）・形質転換：クロンテック社 Stellar ™ Competent Cells を使用した。・変異の確認：それぞれ 96 個の形質転換体からプラスミドを調製してシーケンスを行い、変異が入った部分を確認した。結果 ■ 変異箇所を示した模式図 96 個のプラスミドのシーケンスを行い、変異が見られた箇所を模式的に示した。上側が In-Fusion ®、下側が A 社キットの変異箇所を表している。 In-Fusion® HD Cloning Kit 変異箇所：1ヵ所、1塩基 A C ベクターインサートのプライマー領域インサートインサートのプライマー領域ベクター T C C A C T C T C T G A G A G T T A G A G T A 社キット変異箇所：7ヵ所、11塩基プラスミド各 96 個のシーケンスを行ったところ、In-Fusion® は1ヵ所、１塩基しか変異がなかったのに対し、A 社キットは 7ヵ所、11塩基の変異が見られた。共通のベクター、インサートを用いてクローニングを行った結果であり、変異はベクターとインサートを結合する際に起こったものと推察される。In-Fusion ® の連結反応は変異が入りにくい反応であると考えられる。クローンの割合」、「バックグラウンドの低さ」、「変異の入りにくさ」のどれをとってもIn-Fusion® が In-Fusion クローニングのススメ -4- 3 ユーザー様実施例のご紹介 ■ 3 つのインサートを In-Fusion® Cloning Systemで同時にクローニング（B 社同タイプキットとの比較）【データご提供】京都府立大学大学院植物病理学研究室久保先生、深田様実施内容 In-Fusion® HD Cloning Kit および B 社同タイプキットを用いて 9,300 bp のベクターと1,000 bp、1,400 bp、 1,200 bp の 3 断片のインサートをクローニングし、合計12,900 bp のベクターの作製を試みた。コンピテントセルはいずれもクロンテック社 Stellar™ Competent Cells を用いた。 Vector Insert 9,300 bp 1,000 bp 1,400 bp 1,200 bp a b c F2 X a c X X b c b F1 b a R2 a X R1 F3 R3 コロニーPCR に用いたプライマーペア c 結果クローニングキットにIn-Fusion® HD Cloning Kit を用いた場合、40 個のコロニーが出現した。そのうち10 個のコロニーにおいてコロニーPCR を行った結果、全てのコロニーにおいてインサート 3 断片の正しい挿入が確認された。一方、B 社同タイプキットを用いた場合、1個のコロニーが出現し、コロニーPCR を行った結果、インサート 3 断片の正しい挿入が確認された。 In-Fusion® HD Cloning Kit M a 1 b c M a 1 b c a 2 b c a 3 b c コロニー数 40 個 B 社同タイプキットコロニー数 1個 M:λ- -5- In-Fusion クローニングのススメ d III digest a 4 b c a 5 b コロニー番号 c インサート断片名 4 「使ってよかった！」ユーザーズボイスのご紹介使ってよかった！「使ってよかった！」のユーザーズボイスすでに In-Fusion® をご使用中のユーザー様からお寄せいただいたのユーザーズボイスをご紹介します。まだお使いでない方は是非お試しいただき、「使ってよかった！」を体験してください。 ◆ T 大学 I 様 ◆ N 大学 N 様 Q1 実際に使ってみていかがでしたか？ Q1 実際に使ってみていかがでしたか？宣伝どおりで成功率が高かった。 Q2 まだ使われたことがない方に対して、一言お願いします。他社でも同等品があるが安定しているのでお薦め。添付されてきた PrimeSTAR MAX polymerase の特異性も高く、非常に高効率でクローニングが完了して素晴らしいの一言です。 Q2 まだ使われたことがない方に対して、一言お願いします。特別なベクターなどが必要なわけでもなく、プライマーを設計して PCR かけるだけでクローニングが簡単にできる。こんな便利な試薬は使わないと損です。うちのラボではもう制限酵素処理なんてしてません！ ◆ I 大学 K 様 ◆ T 大学 Y 様 Q1 実際に使ってみていかがでしたか？ Q1 実際に使ってみていかがでしたか？目的の遺伝子を PCR で増幅し、cloning enhancer 試薬を処理して In-fusion 反応を行うだけで、100% の確率で陽性コロニーを得ることが出来ました。面白い原理に基づいたクローニング方法だなと思っていたけど、実際使ってみて本当に高い確率でクローニングが出来、有用な手段だなと思いました。通常の制限酵素を使った方法では何か月もうまくいかなかったのが、この商品を使ったら一発で構築できました。やはり複数の配列を一度に連結できるのは In-Fusion の強みですね！ Q2 まだ使われたことがない方に対して、一言お願いします。 Q2 まだ使われたことがない方に対して、一言お願いします。制限酵素と ligase を用いたクローニングに比べて、プライマー作製分程度割高かもしれませんが、実験が 1回で完了するならコストパフォーマンスは高いと思います。特に大きな遺伝子の組込などに有用です。 1つの配列をベクターに入れるのも良いですが、複数の配列をベクターに入れたいときに是非オススメです ! ◆ T 大学 Y 様 ◆ T 大学 Y 様 Q1 実際に使ってみていかがでしたか？ Q1 実際に使ってみていかがでしたか？クローニングの実験って Case by caseでうまくいかないことが多いですが、本製品を使ってから安定性が高まりました！初めての時はとにかく驚きました。３つの断片をベクターに組み込んだり、変異、欠失を導入したり、それまで site-directed mutagenesis やオーバーラップ領域を使った PCR での遺伝子融合で苦労していた部分があっという間に解消しました。 Q2 まだ使われたことがない方に対して、一言お願いします。 Q2 まだ使われたことがない方に対して、一言お願いします。されたと思って！まずは、試してみて下さい。ベクター構築のための苦労が長かった人程、その凄さが実感できると思います。制限酵素による切断端を使ってライゲーション反応で遺伝子をつなげるプロセスがないので、制限酵素サイトに悩まされることも少なくなりますし、なにより若手実験者の失敗が激減します。スケールダウンも可能です（タカラさんすみません）。 ◆ N 大学 T 様 ◆ K 大学 I 様 Q1 実際に使ってみていかがでしたか？ Q1 実際に使ってみていかがでしたか？初めは、コツが分かるまで上手くいかないだろうと思っていましたが、説明書に記載されている通りにしただけで、2 断片のライゲーションのみならず、3 断片のライゲーションも一発で上手くいきました。これならルーチンに使えます。はやく使っておけば良かった。確かにうまくいった。技術の進歩にびっくり（ケチケチせずに、新しい kit を使った方が、寧ろ節約になる）。 Q2 まだ使われたことがない方に対して、一言お願いします。 Q2 まだ使われたことがない方に対して、一言お願いします。 DNA クローニングやベクター構築の時間や労力を大幅に減らすことができます。また、多用な用途に利用できます。おすすめです。もっと詳しいユーザーズボイスをウェブサイトでご覧ください！まず、使ってみましょう！ In-Fusion ユーザーズボイス検索 In-Fusion クローニングのススメ -6- ∼ In-Fusion クローニングのススメ ∼ 【 In-Fusion® 主要製品リスト＆付属品】キット付属品製品名 In-Fusion® HD Cloning Kit In-Fusion® HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer In-Fusion® HD Cloning Kit w/NucleoSpin® In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Kit ※ In-Fusion® HD Cloning Plus In-Fusion® HD Cloning Plus CE 容量製品コード価格（税別） 10回 639648 ¥23,000 50回 639649 ¥108,000 100回 639650 ¥185,000 10回 639633 ¥24,000 50回 639634 ¥111,000 100回 639635 ¥198,000 10回 639639 ¥26,000 50回 639640 ¥125,000 100回 639641 ¥215,000 8回 639689 ¥23,000 8 回×3 639690 ¥62,000 96回 639691 ¥187,000 10回 638909 ¥46,000 50回 638910 ¥165,000 100回 638911 ¥260,000 10回 638916 ¥44,000 50回 638917 ¥155,000 100回 638918 ¥250,000 Cloning Enhancer Steller CloneAmp 精製用 Competent HiFi PCR カラム NucleoSpin Cells Premix ― ― ― ― ● ― ― ― ― ● ― ― ― ― ― ― ― ● ● ● ● ― ● ● 備考既にタカラバイオの高正確性 PCR 酵素「PrimeSTARシリーズ」をお使いの方はこちらがおススメです。初めてIn-Fusionキットを使用される方、特にオールインワンキットをご要望の方はこちらをどうぞ！ ※ In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Kitは、凍結乾燥タイプ（室温、デシケーター内保存可能）の In-Fusion® HDキットです。マイクロチューブに分注済みのため直ちに使用することができます。 EcoDryTM の場合、反応時間は37℃ 15 分＋50℃ 15 分です。 In-Fusion® HD 付属品 Cloning Enhancer Stellar™ Competent Cells PCR 産物がシングルバンドの場合に増幅産物をそのまま In-Fusion 反応に用いるための前処理試薬。この処理により、PCR に使用したプライマーや鋳型プラスミド、dNTP の影響を受けずにIn-Fusion 酵素が最大のパフォーマンスを示すことができる。高い形質転換能を持つコンピテントセル。長鎖プラスミド DNA の形質転換においても高い効率が得られ、同様の遺伝子型を持つ他のコンピテントセルと比較してコロニー形成速度が速い。pUC 系プラスミドでの形質転換の際には、 β- ガラクトシダーゼのα- 相補性を利用し、 X-Gal 添加による組換え体の青／白選別を行うことができる。 NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up CloneAmp™ HiFi PCR Premix PCR 産物が複数バンドの場合にゲル精製を行うスピンカラム正確性が極めて高い PCR 酵素。In-Fusion クローニングにおいて、インサートDNAをPCR 増幅する場合に最適である。本製品は、In-Fusion® HD Cloning Plusシリーズに添付されている。・本パンフレットで紹介した製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。・タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。・本パンフレットでに記載された社名および製品名は、特に記載がなくても各社の商標または登録商標です。・ライセンス情報については弊社ウェブサイトにてご確認ください。・本パンフレットで記載の価格は2014 年 10月1日現在の希望小売価格です。価格に消費税は含まれておりません。東京支店関西支店 TEL 03-3271-8553 TEL 077-565-6969 FAX 03-3271-7282 FAX 077-565-6995 TaKaRa テクニカルサポートライン TEL 077-543-6116 FAX 077-543-1977 Website Facebook http://www.takara-bio.co.jp http://www.facebook.com/takarabio.jp 2014 年 10月作成 20K