ゲノム編集がひろげるサイエンス・ワンダーランド GeneArt® CRISPR Nuclease GeneArt® Precision TALs character design & illustration: ryuji nouguchi Invitrogen™ siRNA の実験もうまくいったし、次はこの遺伝子の機能を完璧に抑えたいな・・・。 CRISPRにお任せ ! 配列教えて。私がノックアウトしてくるから。ゲノム編集を使えば、特定の遺伝子のノックアウトが簡単にできるのじゃ。細胞でも生物でも。 02 クリスパー C RISPR って誰 ? ゲノム編集の仕組みは ? 正式名は、C RISPR/C as9 システム。指定されたゲノムの編集細胞の中でゲノム DNA が切断されると、修復機構が働いて再箇所を見つけ出すガイドRNA（ gRNA ）と、その場でゲノムを切結合します。この時、切断されたゲノムの末端は、高い頻度で欠断するハサミ（ Cas9ヌクレアーゼ）からできています。細胞や受損したり、変異しています。その結果、再結合してもアミノ酸を精卵に、プラスミドDNA で導入します。コードするDNA のフレームがシフトし、切断箇所の遺伝子が破壊（ノックアウト）されます。修復時に、切断付近の相同配列を含むプラスミドや一本鎖 DNA を一緒に導入しておくと、相同組換えが起きて、外来配列がゲノムに挿入（ノックイン）されます。ゲノム DNA G UA CG GC GC UA GC AA CG G A UUUU G AU UA U CG G GCA A A A A G UG A AU A UA A UA G UA U UA U GU C A G A A G G C U A G UC C G U U A UC A A ノックアウト Cas9 gRNA G C A U U UC G G U A UG C A U A UG A A U 切断 ■ NHEJ（非相同末端再結合）フレームシフトによるORF の消失 ■ HR（組同組み替え） donor DNA CG T A A A G CC A T A C G T A T A C T A C C G C A T T T C G G T A T G C A T A T G A NGG 標的配列ノックイン PAM やってみたい ! オールインワンベクターの GeneArt ® CRISPR Nuclease Vector Kit を使えば便利です。標的配列に相補的な gRNA を設計し、ベクターへクローニングして細胞へ導入。このベクターにはレポーター遺伝子の CD4 遺伝子か Orange Fluorescent Protein （ OFP ）遺伝子が含まれています。これらの細胞での発現を目印に、トランスフェクション効率の確認や、抗 CD4 抗体が結合した磁気ビーズやセルソーターで CRISPR/Cas9を発現した細胞を濃縮し、目的細胞をスピーディにクローニングできます。 tracrRNA CACCG U6 promoter CAAAA F1 origin pUC origin TK pA CD4またはOFP 2A GeneArt® CRISPR/ C a s 9 ベクターが導入された細胞はC D 4または OFPを発現します。 Pol III term CD4や OFP が Ampicillin CRISPR Nuclease Reporter Vector 目印 Pcmv Cas9（ with NLS1 and NLS2 ）セルソーターや磁気ビーズを利用して、 GeneArt ® CRISPR Nuclease ベクター CRISPR/Cas9 が発現している細胞を濃縮します。製品名サイズ製品番号価格 GeneArt ® CRISPR Nuclease: OFP Reporter Kit 10 反応 A21174 ¥189,000 GeneArt ® CRISPR Nuclease: CD4 Enrichment Kit 10 反応 A21175 ¥189,000 03 ゲノム編集って面白そうだな。でも CRISPRとTALENsってどう違うんだろう? TALENs 参上 ! CRISPRと違ってガイド役がタンパク質。ゲノムを切るときは、ペアで働くんだよ。ガイド役の TAL エフェクターを使えば、別の働きもできるんじゃぞ。くわしくは右のページじゃ。 04 タレン TALENsって誰 ? 正式名は TAL エフェクターヌクレアーゼ。ゲノムの標的配列に結合するTAL エフェクタータンパク質とハサミ役の FokⅠヌクレアーゼからできています。CRISPRと違って、このハサミはゲノムの切りたい場所を ForwardとReverse のペアで挟み込むことで始めて機能します。そのため高い特異性で二本鎖 DNA を切断します。ズームイン ! TAL エフェクタータンパク質の構造核移行シグナル転写活性化ドメイン（植物用） NLS Repeat domain AD N末 NUCLEAZSE C末 1 ← 15bp → 34 12 13 LTPEQVVAIASHDGGKQALWTVQRLLPVLCQAHG 結合する塩基を決定する2 つのアミノ酸分子量 120kDa のタンパク質の真ん中にはリピートメインがあり、1 つのリピートは 34 個のアミノ酸からできています。このうち 12 番目と13 番目のアミノ酸の組み合わせで結合するDNA の塩基が決まります。切断後のゲノム編集のしくみは、CRISPRと同じです（ P3 参照）やってみたい ! GeneArt ® PrecisionTALs 受託サービスがお勧めです。 TAL エフェクター（ TALE ）とFokⅠの融合タンパク質をコードするベクターを作成してお届けします。さらに、お好きな機能ドメインを選べます ! TAL エフェクターは FokⅠヌクレアーゼだけでなく、転写アクチベーター（ VP16,64 ）や転写リプレッサー（ KRAB ）とも融合できるので、標的遺伝子の発現を調節可能です。さらにTAL エフェクターの後ろにマルチクローニングサイト（ MCS ）を含むベクターを使えば、好きな機能ドメインを任意の場所へターゲティングできます。例えばヒストンアセチル化酵素や DNAメチル化酵素をゲノムの好きな場所に組み込み、いろいろな実験に挑戦できます。 FokⅠ att L2 切断 Kanamycin TAL エフェクターアクチベータ VP16,VP64 活性化 TAL FokⅠ Entry Vector pUC ori TAL エフェクター PROMOTER リプレッサー KRAB 不活化 att L1 18 repeatRVD PROMOTER TAL N-term V5 様々な機能 GeneArt ® Precision TALs ベクターの 1 例 Gateway ® エントリークローンで提供するので、任意のプロモーターが搭載された発現ベクターへ乗換えてすぐに使用できます。製品名価格製品名価格（ Fw & Rv ペア）※ 2 Truncated TAL FokⅠ ¥300,000 Native TAL VP64 Activator （ Fw & Rv ペア）※ 3 Native TAL FokⅠ ¥250,000 Native TAL Multi Cloning Site Native TAL VP16 Activator ¥300,000 ● 標的部位認識配列長 ※1 製品名 Truncated TAL Multi Cloning Site ¥350,000 ¥300,000 Modified KRAB Repressor ¥300,000 は全て 18または 24bp です。 ● 納期は一律 4 週間です。 ※ 1 5' 末端の「 T 」を除く配列認識長です。18または 24 塩基を選択することができます。 ※ 2 Truncated 型は動物細胞実験に推奨しています。 ※ 3 Native 型は植物など非動物細胞実験に推奨しています。 05 価格 ¥300,000 TALENs と CRISPR はどう使い分けるの ? オフターゲットのリスクが低いのは TALENs 。そして TAL エフェクターを様々なドメインと融合させれば応用実験も OK じゃ。多くのターゲットを片っ端から試したい場合には、クローニングが簡単な CRISPR に軍配があがるのじゃ。端が NGG で終わる「 PAM サイト」配列。制約が低いの CRISPR のガイド役はわずか 20 塩基の RNA 、しかも標的サイトは 3 ’ で迅速・簡単にクローニングでき、様々な実験に挑戦できます。しかし標的以外の場所を切断するオフターゲットリスクが TALENs よりも高い様です。一方 TALENs はペアで働くためオフターゲットのリスクが低く、TAL エフェクターは切断以外の機能ドメインとも融合できるのでゲノム編集の可能性が拡がります。標的配列の選択には、いくらかの制約はあるものの、 GeneArt ® Precision TALs のフリーデザインツールを使えば、デザインも簡単。クローニング作業も弊社にお任せください。変異がちゃんと入ったか、どうやったらわかるの ? まずはミスマッチ二本鎖 DNA の切断酵素で変異導入効率を確認するのじゃ。ゲノム編集の標的箇所付近の DNA を PCR で増幅し、再度アニールすると、塩基の挿入 / 欠失が起こった箇所ではヘテロ二本鎖ミスマッチが形成されます。このミスマッチを特異的に認識して切断する特別な酵素で処理し、その断片をゲル電気泳動して確認します。 GeneArt ® Genomic Cleavage Detection Kit を使えば、ゲノム DNA や PCR 産物の精製を省けるので、標的遺伝子の変異が簡単に検出できます。変異（塩基の挿入や欠失がおこった箇所）変性 & 再アニーリングミスマッチもっと詳しくノックインやノックアウトの成功を調べる方法はないかな ? ミスマッチ認識酵素が切断シーケンスで直接確認が確実じゃ。電気泳動ゲノム編集の標的箇所付近の DNA を PCR で増幅後、クローニングして大腸菌コロニーをピックアップ。それをシーケンスすれば、変異導入やそのパターンを直接確認できます。ゲノムワイ ① ② ドな発現パターンの変化やオフターゲットの評価には、次世代シーケンサが最適です。また多くの変異導入パターンの解析には、ライフテクノロジーズの I o n PGM TM システムでディープシーケンス ①変異なし ②変異ありがお勧めです。 06 ノックイン実験はどうするの ? 人工遺伝子合成を利用すれば、ドナープラスミド構築だって恐れるに足らずじゃ。ノックイン用のドナープラスミド DNA には、500-600bp の相同配列（ arm ）が必要です。GeneArt ® 人工遺伝子合成サービスや二本鎖 DNA 断片で納品するGeneArt ® Strings DNA Fragments サービスを利用すれば、配列情報だけで準備は簡単。また短い領域のゲノム編集だったら一本鎖オリゴ DNA がお勧めです。その場合、arm は 40-45bp 、全体は 100bp 程度で使います。二本鎖 DNA 切断 500bp ∼ 600bp 500bp ∼ 600bp 100bp 以内ゲノム編集の効率を上げる遺伝子 L arm 相同組換え R arm 良い方法はないかな ? Lipofectamine ® 3000 でトランスフェクション効率をあげれば、ゲノム編集の効率も向上じゃよ。 Lipofectamine ® 3000 は、独自の最新脂質ナノ粒子テクノロジーを利用し、これまで遺伝子導入が困難だった細胞でも、遺伝子導入やタンパク質発現効率を向上させます。TALENs や CRISPR によるゲノム編集の効率を向上させた実例は、NEXT4 月号（ No.24 ）をご覧ください。 www.lifetechnologies.com/nextforum SNP のゲノム編集は、どうやって確認するの ? TaqMan ® SNP Genotyping Assay にお任せあれ。標的 SNPに対して設計された TaqMan ® プローブを使えば、片アレルま基の変異は、カスタム設計の TaqMan ® プローブが対応可能。測定には StepOnePlus™ リアルタイムＰＣＲシステムなどを使います。 prode prode Forward primer 5 3 DNA template 3 [G/A] [C/T] Reverse primer 07 5 Relative fluorescent signal from allele 2 たは両アレルへの変異の導入効率を簡単に定量解析できます。2 ∼ 3 塩 Allelic Discrimination Plot Homozygous allele 2 Heterozygous No template control Homozygous allele 1 Relative fluorescent signal from allele 1 Welcome! Science Wonderland ゲノム編集を攻略して、サイエンス・ワンダーランドへ ! ゲノム編集へ興味がわいたら、ちょっと使ってみたくなったら、すぐに「ゲノム編集特設サイト」をチェック! 原理解説、実験ワークフロー、役立ちツールなど、ゲノム編集に役立つ情報満載です。最新情報は毎月メルマガでお知らせします。スタートはここから! ▶ www.lifetechnologies.com/GenomeEditors ワンダーランドの道案内：オンラインでゲノム編集を学ぼうゲノム編集の原理から配列設計のポイントなど、実験ワークフローに沿って、ゲノム編集の実験をわかりやすくご解説するオンラインセミナーです。これからまさにゲノム編集を始める方にお勧めです。 item 01 ［ゲノム編集セミナーコンテンツ］パート１ ▶ ターゲットサイトのデザイン方法（ CRISPR/Cas9, TALENs ）パート２ ▶ 変異導入の成功を評価する方法パート３ ▶ 相同性組換え用ノックインベクターの設計と、新しい遺伝子導入法で成功率をぐっと向上パート４ ▶ 標的サイトの変異導入パターンやオフターゲットの可能性を次世代シーケンサで評価するワンダーランドの歩き方：研究者のインタビュー & テクニカルレビュー item 02 ワンダーランド詳細情報：ゲノム編集技術別情報や関連製品をチェックオンラインマガジン NEXT には、ゲノム編集が拓く未来やゲノム編集に必要な作業や製品なこの技術を自在に使いこなす研究者インタビューが豊富どトータルワークフローを詳しく説です。わかりやすいテクニカルレビューも大人気。明した資料です。ゲノム編集がどのような研究に使われているか、幅広く情何をそろえればよいか具体的に知報を集めたい方にお勧めです。りたい方にお勧めです。 ● 記載価格は2014 年 10 月現在の価格です。消費税は含まれていません。● 価格は予告なしに変更する場合がありますのであらかじめご了承ください。● 最新の価格および在庫数は、弊社ホームペー販売店ジ右上の “製品価格と在庫の検索” でご確認いただけます。研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。 ● 記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。● 販売条件はこちらをご覧ください。→ www.lifetechnologies.com/TC For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. ©2014 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc., used under permission and license. character design & illustration: ryuji nouguchi art direction & design: masami furuta（opportune design） IVC036-B1410HS DOC088 ライフテクノロジーズジャパン株式会社本社：〒108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8 ／ Tel.03（ 6832 ）9300 ／ Fax.03（ 6832 ）9580 大阪：〒564-0052 大阪府吹田市広芝町 10-28 ／ Tel.06（ 6389 ）1201 ／ Fax.06（ 6389 ）1206 ウェブサイト: www.lifetechnologies.com item 03