クイックリファレンスガイド - Thermo Fisher Scientific

クイックリファレンスガイド
Invitrogen™ GeneArt™ CRISPR Search and Design Toolは、600,000を超えるプレデザインされたCRISPR
ガイドRNA
（gRNA）
配列の検索や当社独自のアルゴリズムを用いるde novo gRNAデザインのための無料ソ
ご購入いただけます。
フトです。ゲノム編集するための最適なgRNAデザインを選択いただき、
GeneArt CRISPR Search and Design Toolへのアクセス
1. GeneArt CRISPR Search and Design Toolにアクセスするために、
www.thermofisher.com/crisprdesign を表示させます。サポートされていないブラウザをお使いの場合、
下記のメッセージが表示されます。
1. ブラウザのサポートを有効にしてから、登録済みのユーザー名とパスワードでThermo Fisher Cloudにログ
インします。初めてのログインでは、確認のためにEメールアドレスをご入力いただきます。確認が完了する
と、お客様のEメールアドレス宛てに下図のような確認要求メールが送信されます。すぐにこの確認要求メー
ルが届かない場合はスパム（迷惑）メールボックスをご確認ください。次回以降、GeneArt CRISPR Search
and Design Toolにアクセスいただく際は、Thermo Fisher Cloudへのログインは不要となります。
2. ご登録済みのユーザー名とパスワードを使用して、お客様のアカウントにログインします。初めてご注文のお
客様は、
下記画面のCreate an accountからすぐにアカウントを作成できます。サインインすると、GeneArt
CRISPR Search and Design Toolサイトが表示されます。
GeneArt CRISPR Search and Design Toolの使用
このツールは、
600,000を超えるプレデザインされたCRISPR gRNA配列を検索するために使用されます。こ
れらの配列は、
遺伝子ノックアウト用に最適化されており、
各遺伝子の最初の3つの転写されたエクソンをター
ゲットとします。検索結果には、上位6つのPAM配列およびCRISPRターゲット配列、gRNA結合部位が含まれ
お客様のお好みの
るエクソンマップ、
および各CRISPR配列のオフターゲット配列が含まれます。本ツールは、
CRISPR-Cas9製品に応じたgRNAフォーマットをデザインします。プレデザインされたCRISPR gRNAの検索
は以下の手順で行います。
1. 検索ボックスに、最大10種類の遺伝子ID、遺伝子シンボル、またはRefSeqアクセッションナンバーをコンマ
で区切って入力します。下図の例では、検索用語として、MAPK7、CHKA、およびBRCA2を入力しています。
2. CRISPR-Cas9発現フォーマットのドロップダウンリストから、GeneArt™ CRISPR Nuclease Vectorまた
はGeneArt™ CRISPR Nuclease mRNAのいずれかを選択します。
• GeneArt CRISPR Nuclease Vector Kitは、ゲノム編集に必要なgRNAおよびCas9タンパク質を発現さ
せるためのベクターです。ベクターは、
レポーター遺伝子を含むため、導入された細胞の濃縮および導
入効率の確認も可能です。
– GeneArt™ CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kitは、
フローサイトメトリーによる蛍光ベース
の細胞ソーティングが可能です。
– GeneArt™ CRISPR Nuclease Vector with CD4 Enrichment Kitは、抗CD4抗体結合ビーズによる細
胞濃縮が可能です。
• GeneArt CRISPR Nuclease mRNAは、すぐに使用できる野生型 Cas9 mRNAです。
本Cas9mRNAは、
gRNAをコードするGeneArt™ CRISPR Strings™ DNAと共に用います。下記の2種類
のフォーマットがございます。
– U6プロモーターを含む GeneArt™ CRISPR U6 Strings™ DNAは、そのままCas9 mRNAとともに共
導入できます。
– T7プロモーターを含む GeneArt™ CRISPR T7 Strings™ DNAは、事前にin vitro転写を行いgRNAを
mRNAに転写して、Cas9 mRNAとともに共導入します
• 下図の例では、GeneArt CRISPR Nuclease mRNAが、in vitro転写用のGeneArt CRISPR T7 Strings
DNAとともに選択されており、gRNAおよびCas9をRNAフォーマットで細胞に導入されます。
3. Select a speciesのドロップダウンリストから、Homo sapiens またはMus musculus を選択します。
4. “Search”をクリックして、Homo sapiens用のプレデザインされたCRISPR gRNAのためのデータベース
を検索します。
GeneArt CRISPR Designerの使用
GeneArt CRISPR Designerにアクセスするためには、GeneArt CRISPR Search and Design Toolサイト
をクリックします。このツールを用いて、
目的の配列から、当社独自のデザインアルゴリ
の
“Custom Design”
ズムを用いて、de novo CRISPR gRNA配列をデザインします。プレデザインされたgRNA検索オプションと
同様に、検索結果には、上位6つのPAM配列およびCRISPRターゲット配列、gRNA結合部位が含まれるエク
ソンマップ、および各CRISPR配列のオフターゲット配列が含まれます。カスタムgRNA配列のデザインは以
下の手順で行います。
1. 遺伝子名と最大500 bpまでの塩基配列をFASTA形式で検索テキストボックスに入力します。以下に例を示
します。
2. CRISPR-Cas9発現フォーマットのドロップダウンリストから、GeneArt™ CRISPR Nuclease Vector
またはGeneArt™ CRISPR Nuclease mRNAのいずれかを選択します。GeneArt CRISPR Nuclease
mRNAを選択した場合は、GeneArt CRISPR Strings DNA用のお好みのプロモーターオプション(T7または
U6)を選択します。
3. Homo sapiens またはMus musculusのドロップダウンリストから生物種を選択します。
4. “Search”をクリックして、CRISPR gRNAのde novoデザインを開始させます。
検索結果
プレデザインされたgRNAの検索結果の例を以下に示します。
1. 左側の“Search Summary”の表の行をハイライト表示します。右側の情報がその遺伝子を含む結果に更
新されます。
• 最初の3つの転写されたエクソンをターゲットとする、プレデザインされたCRISPR配列が画面上部の遺
伝子表示に示されます。
• 各配列にカーソルを乗せると、遺伝子表示のどこに位置しているかがわかります。表中の各CRISPR配
列に矢印が表示されます。
• 上位6つのCRISPR配列が推奨配列（4つ）
とともに示されます。最適な結果を得るために少なくとも3種
類のガイド配列をスクリーニングすることをお薦めします。
• 予測されるオフターゲット結合部位が、ターゲット配列に対するミスマッチの数および位置が示されます。
2. “Binding Sites”の数をクリックし、オフターゲット結合部位とミスマッチを表示させます。
最初のCRISPR配列の結合部位は下の画面のように示されます。
3. “Search Summary”ページに戻り、ご希望の各gRNAデザインのボックスにチェックを入れ、
“Add to Project”をクリックします。
4. “Search Summary”表の他の行を選択し、gRNA配列の解析を繰り返します。
“View Project”をクリックし、ご希
5. 各遺伝子について全てのgRNAを確認し、プロジェクトに追加してから、
望の順番でサマリーを表示させます。
6. お客様のプロジェクトのサマリーが下図のように一画面に表示されます。画面左上部の“ Nuclease
mRNA”および“Nuclease Vector”のタブに注目してください。GeneArt CRISPR Nuclease Vectorシステ
ム用のgRNAデザインを検索した場合は、そのデザインは“Nuclease Vector”タブにリスト表示されます。
GeneArt CRISPR Nuclease mRNA用のgRNAデザインを検索した場合は、そのデザインが“Nuclease
mRNA”タブにリスト表示されます。
7. カートに追加する前に、gRNAデザインは入念に見直してください。いったんgRNA デザインをカートに追
加すると、編集し直すことはできません。様々なgRNAデザインを必要とする場合は、シンプルにプロジェク
トをカートから削除し、デザインを追加するためのウェブツール画面に戻ります。
“Add Items To Cart”
をクリックして注文を行います。
8. gRNA配列を確認し、
※ 日本ではこのサイトから推奨製品
（Recommended Products）
のご購入はできません。
ここではチェックを
入れずに、弊社販売店に別途ご注文をお願いいたします。
注意：ポップアップブロッカーが
“on”
に設定されているとLife Technologiesカートが開きません。ポップ
に解除してから、製品をショッピングカートに追加してください。
アップブロッカーを
“off”
研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続上での使用はできません。
記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。
標準販売条件はこちらをご覧ください。www.thermofisher.com/TC
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サーモフィッシャーサイエンティフィック
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