資料 - 山形大学医学部

2015.7.22 メディカルサイエンス推進研究所技術セミナー
ゲノム編集技術が与える
医学へのインパクト
―遺伝子改変マウス作製への応用を中心に―
メディカルサイエンス推進研究所
遺伝子実験センター
中 島
修
1
ゲノム編集はPCR以来のゲームチェンジャー
(game changer:世論の動向を大きく変える出来事)
2
20 | NATURE | VOL 522 | 4 JUNE 2015
20 | NATURE | VOL 522 | 4 JUNE 2015
3
20 | NATURE | VOL 522 | 4 JUNE 2015
4
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1.
2.
3.
4.
ゲノム編集の原理
ゲノム編集の歴史と展望
マウス受精卵でのゲノム編集
ゲノム編集の遺伝子改変マウス作製への応
用
5. 山形大学医学部遺伝子実験センターでのこ
れまでのゲノム編集による遺伝子改変マウ
スの作製の実際
6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受
託作製の手順
5
ゲノム編集技術とは?
ゲノム編集(Genome Editing)とは、人工ヌクレ
アーゼのZinc Finger Nucleases(ZFNs)や
Transcription Activator-Like Effector Nucleases
(TALENs)、CRISPR/Casシステムを用いてゲノム上
の標的遺伝子の破壊やレポーター遺伝子のノッ
クインなどを可能にする技術である。(Joung and
Sander, Nat Rev Mol Cell Biol, 2012; Barrangou,
Nat Biotechnol, 2012)。
ゲノム編集コンソーシアムHPより
http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/genome_editing/index.html6
ゲノム編集で利用される人工ヌクレアーゼ
人工ヌクレアーゼ(ZFNやTALEN)は、DNAに特異的に結
合するドメインと、制限酵素FokIのDNA切断ドメインを連
結させたキメラタンパク質である。2つの人工ヌクレアー
ゼが近接する標的配列に結合するとDNA切断ドメイン
が2量体となりDNAを切断する。
ZFN,TALEN
ゲノム編集コンソーシアムHPより
http://www.mls.sci.hiroshima7
u.ac.jp/smg/genome_editing/index.html
特異的に認識できる配列をデザインするには、何種類かのDNA結合ドメインを適切に組み
合わせた融合タンパク質をつくる必要があり、初心者は手を出しにくい系である
CRISPR/Casシステムとは?
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindro
mic Repeat; クリスパー) には多くのプロトスペーサー
配列が含まれており、この配列はウィルス(ファージ)
ゲノムなどの種々の外来DNAと相同性がある。このプ
ロトスペーサー配列をもったRNAがCAS(Crispr
associated, an RNA-guided DNA endonuclease
associated with the CRISPR)に結合して、プラスミドや
ファージといった外来DNAを識別するプローブとなって、
CRISPR/Casが外来DNAのみを切断させるため、細菌の
獲得免疫として機能している。
8
細菌ゲノム内CRISPRが存在
CRISPRが転写され、
pre-crRNAが出来る
pre-crRNAとtracrRNA
がCas9に結合し、さら
にRNaseIIIが結合する
RNaseIIIがpre-crRNAを切断
して、crRNA:tracrRNA:Cas9
複合体を形成させる
http://www.addgene.org/crispr/reference/history/
9
http://www.addgene.org/crispr/reference/history/
PAM配列が3’側に存
在するProtospacer配
列が標的DNAとなる。
Protospacer配列がcrRNA
と相補対を形成し、Cas9ヌ
クレアーゼが標的配列上
位で、二本鎖切断(DSB)を
行う
A programmable dual-RNA-guided
DNA endonuclease in adaptive
bacterial immunity. Jinek M,
Chylinski K, Fonfara I, Hauer M,
Doudna JA, Charpentier E. Science.
2012 Aug 17;337(6096):816-21.
DSB
10
非相同末端連結
nonhomologous endjoiningによる二本
鎖切断の修復
偶発的な二本鎖切断
切断部位の末端をヌクレア
ーゼにより加工
DNAリガーゼにより末端
を連結
二本鎖切断は修復されるが、
修復部位でヌクレオチドの欠
失が生じる
Figure 6-27 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)
二本鎖切断
相同組換えによる
二本鎖切断の修復
DNAが複製された直後に
始まる
←複製された2つの二本
鎖が互いにまだ、近くに
あるため
相同なDNA二重らせん
ヌクレアーゼによる5’末端の消化
鎖の侵入
相同組換えは、様々な
DNA損傷に利用できる汎
用的な修復機構
←無傷の相同染色体があ
れば、可能
←同一染色体は染色体複
製のたびにつくられる
分岐点
DNA合成と分岐点の移動
分岐点の移動とDNA合成の進行
DNA連結
Figure 6-29 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010)
二本鎖DNA切断は精確に修復される(欠失はない)
細胞の中で起こったDNA二本鎖切断の2通りの修復
(NHEJ)
二本鎖DNA切断(DSB)
ヌクレアーゼによ
り5’末端の一部が
消化され削られる
(HR)
相同なDNAが存在する場合のみ起こる
二本鎖DNA切断(DSB)
ヌクレアーゼにより5’末端
の一部が消化され削られる
相同染色体(DNA)を
鋳型にして修復される
相同染色体
小さい欠失等が生じる
京都大HPより
相同染色体を使って欠失を起こさず修復
13
Non Homologous End Joining Repair
http://www.addgene.org/crispr/guide/
14
Homology Directed Recombinant Repair
Single or double
strand Donor DNA
http://www.addgene.org/crispr/guide/
15
1本鎖ガイドRNA(sgRNA)による
CRISPR/CAS9システムの開発
細菌のCRISPR/CASシステムではcrRNAと
tracrRNAの二種のRNAがCas9の遺伝子座へ
のターゲティングには必要であるが、1本に
つなげたキメラRNA(sgRNA)をデザインして、
sgRNAとCas9の2者複合体でヌクレアーゼ活
性を発揮させることが可能になった
sgRNA
Science Vol. 337 pp. 820 (2012)
16
CRISPR/CAS9システム用オールインワンベクターpX330
U6:全身性U6プロモーター。U6遺伝
子はスプライソソームを構成する5
つの核内低分子リボ核タンパク質
(snRNP)の一つ
CBh:全身性トリβアクチンハイブリッ
ドプロモーター
標的遺伝子座に対するガイドシークエンス20bpをク
ローニングすると、目的のsgRNAとCas9 mRNAを同時に
発現させることが可能な、哺乳類細胞での発現ベク
ターとなる。これを細胞の中に入れれば、二本鎖切断
が起こせる
http://www.addgene.org/
17
CRISPR/CASによるゲノム編集とは
ゲノムの任意の遺伝子座で、遺伝子破壊と任意の
変異の導入(編集)を行う技術
CRISPR/CASにより生じた二本鎖切断に対して
1.非相同末端連結 Non Homologous End Joining (NHEJ)による修復が
起こる場合
⇒当該遺伝子で欠失が生じ、exon上で起こった場合はフレームシフト変
異となる可能性が高いため、遺伝子破壊ができる。
2.人工的に任意の変異を導入した相同遺伝子断片(ドナーDNA)を修
復時に同時に存在させた時に、相同組換え修復 Homologous
Recombinant Repair (HRR)による修復が起こる場合
⇒当該遺伝子には、ドナーDNAに由来する変異が導入される(編集され
る)
18
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4.
ゲノム編集の原理
ゲノム編集の歴史と展望
マウス受精卵でのゲノム編集
ゲノム編集の遺伝子改変マウス作製への応
用
5. 山形大学医学部遺伝子実験センターでのこ
れまでのゲノム編集による遺伝子改変マウ
スの作製の実際
6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受
託作製の手順
19
Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino,
K., Amemura, M. & Nakata, A. J.
Bacteriol. 169,5429–5433 (1987).
20 | NATURE | VOL 522 | 4 JUNE 2015
20
Jinek, M. et
al. Science 337,
816–821 (2012).
20 | NATURE | VOL 522 | 4 JUNE 2015
21
点変異や短い配列の挿入を起
こす場合は1本鎖DNAでも可能
欠失が多いが小さな置換など
も起こりうる
点変異導入や元々ない配
列の挿入が可能
22
タカラバイオHPより
CRISPR/Cas9の応用
転写制御
染色体レベルで
の遺伝子改変
ヌクレアーゼ活性を持たないDead Cas
エピゲノム修飾
イメージング
23
https://en.wiki
pedia.org/wiki/
Epigenome_edi
ting
24
20 | NATURE | VOL 522 | 4 JUNE 2015
25
“CRISPR Gene drive”
Oye, K. A. et
al. Science 345,
626–628 (2014).
26
20 | NATURE | VOL 522 | 4 JUNE 2015
27
ヒト胚(ただし、前核が3つある異常受精卵)に対する
CRISPR/Cas9を介したゲノム編集
28
29
ヒト幹細胞での
ゲノム編集によ
るHIVに対する
遺伝子治療
CCR5 found on the
surface of white
blood cells acts as a coreceptor for
HIV entry to the host
cells.
Cell Cycle Ahead of Print DOI: 10.1080/15384101.2015.1046791
筋ジストロフィ患者由来iPSに対する
ゲノム編集による遺伝子治療
Stem Cell Reports Vol. 4 ,143–154, January 13, 2015
Stem Cell Reports Vol. 4 , 143–154, 2015
ゲノム編集によるヒト胚に対する遺伝子治療の論点
• 精確さ inaccurate editing and off-target(二本鎖切断が起
こる目的外遺伝子座) mutations
• Monogenic disease such as Huntington’s disease
• 胚に対するゲノム編集は現実的に困難
• IVF embryos using preimplantation genetic diagnosis (PGD)
• PGDによる胚の選別による代替可能なケースが多い
• ホモ接合体の胚(例:同一遺伝子変異の聾者同士の胚)
の場合はPGD代替不可
• Reducing the risk of common diseases like APOE ε4 variant
(Alzheimer’s disease and cardiovascular disease), PCSK9
(myocardial infraction)
From Eric S. Lander. "Brave New Genome." N. Engl. J. Med. Published online 2015 June 3
33
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4.
ゲノム編集の原理
ゲノム編集の歴史と展望
マウス受精卵でのゲノム編集
ゲノム編集の遺伝子改変マウス作製への応用
5. 山形大学医学部遺伝子実験センターでのこれ
までのゲノム編集による遺伝子改変マウスの
作製の実際
6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受託
作製の手順
34
マウス受精卵でのゲノム編集の報告
Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.35
A
ES細胞での5重遺
伝子破壊クローン
の作成
B
マウス受精卵で
の二重遺伝子破
壊マウスの作製
マウス受精卵で
の二重相同組み
換え体の作製
Cell. 2013 May 9;
153(4): 910–918.
36
Ten-eleven translocation family members
Tet1, Tet2, Tet3での標的配列
エキソン内にある制限
酵素サイトを切断する
デザイン
Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.
37
一組のCRISPR/CAS9 mRNAのマウス受精卵細胞質への
マイクロインジェクションにより変異遺伝子座(切断・非相同
末端連結による欠失)のホモ接合体が高確率で作出
70~90%の産子はホモ接合体
Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.
38
制限酵素サイトが
無くなるので、検出
される断片が長くな
る
バンドが1本なので
ホモが多い
実際に出来る変異遺伝子座は数bp~数十bpの欠失が多いが、挿入の場合もある
39
二種のCRISPR/CAS9 mRNAのマウス受精卵前核への
マイクロインジェクションによる
二重遺伝子破壊マウスの作出
Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.
40
二種のCRISPR/CAS9
mRNA・1本鎖ドナー
DNAのマウス受精卵
前核へのマイクロイン
ジェクションによる
二重2塩基変異導入マ
ウスの作出
Cell. 2013 May 9; 153(4): 910–918.
相同組換えと欠失のヘテロ
相同組換えのホモ
相同組換えと欠失のヘテロ
相同組換えと欠失のヘテロ
41
大阪大学微生物病研究所
伊川正人先生のプロトコール
http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/CRISPRデザイン法20131219.pdf
42
http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/CRISPRデザイン法20131219.pdf
43
Single Strand Annealing
http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/CRISPRデザイン法20131219.pdf
44
http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/CRISPRデザイン法20131219.pdf
45
CRISPR/Cas9プラスミドベクターの
C57BL/6Jマウス受精卵への導入
CRISPR/Cas9 vector
U6
target gRNA CBh
Flag-NLS-hSpCas9-NLS
pA
pX330
Donor oligo
環状のCRISPR/Cas9 vectorとdonor oligo DNAを導入
問題点:ベクターのゲノム挿入が起こりうる。RNAインジェクションではこの点は回避
できる。
筑波大学基礎医学系 高橋智教授 H26山形大学大学院講義資料より一部改変
NHEJ:
非相同末端連結
HR:
相同組換え修復
熊本大HPより
CRISPR/CASによる個体でのゲノム編集の利点
• 汎用性が高く、簡便で低コスト(↔ ZFN・TALEN , ES細
胞)
• 受精卵が得られればどんな生物種でも可能(実施例:
ラット、ウサギ、豚、ゼブラフィッシュ、アクソロートル、
サル)
• もちろん、マウス系統もC57BL/6に限らない
• 遺伝子改変マウスが比較的短期間で作出可能
• 多重遺伝子破壊が簡便にできる
• 1回の実験でホモ変異体の作出が期待できる(交配
不要)
• 単純遺伝子破壊のみならず、ドナーDNA次第で様々
な遺伝子改変が可能
48
Off-target問題
• Few studies using whole genome analysis
already showed that the mutation rates induced
with Cas9 endonucleases are not systematically
higher than spontaneous (non-induced) natural
mutations
• Off-target remains ultimately much less critical
for mice as for human genome engineering, as it
is easily diluted out amongst generations
Delerue and Ittner, Clon Transgen 2015, 4:1
http://dx.doi.org/10.4172/2168-9849.1000135
49
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ゲノム編集の原理
ゲノム編集の歴史と展望
マウス受精卵でのゲノム編集
ゲノム編集の遺伝子改変マウス作製への応
用
5. 山形大学医学部遺伝子実験センターでのこ
れまでのゲノム編集による遺伝子改変マウ
スの作製の実際
6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受
託作製の手順
50
筋ジストロフィーマウス受精卵に対する
CRISPR/Cas9を介したゲノム編集による
産子における筋ジストロフィ―発症予防
Science 5 SEPTEMBER 2014 • VOL 345, 1184-1188
51
Science 5 SEPTEMBER 2014 • VOL 345, 1184-1188
52
Science 5 SEPTEMBER 2014 • VOL 345, 1184-1188
53
ゲノム編集マウスでのジストロフィンタンパク質発現の回復
54
ゲノム編集マウスでの血清クレアチンキナーゼの低
下と前足握力の回復
Science 5 SEPTEMBER 2014 • VOL 345, 1184-1188
55
成体遺伝性チロシン血症マウスに対する
sgRNA/Cas9mRNA/donor DNA尾静注による治療
(肝機能の回復)
fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)
Fah: フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ遺伝子
Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):551-3.
56
成体遺伝性チロシン血症マウスに対する
sgRNA/Cas9mRNA/donor DNA尾静注による治療
(肝機能の回復)
Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):551-3.
57
Rosa locus(すべての組織で発現)へのCas9 Knock-inマウスの確立と
がん抑制遺伝子を標的とするsgRNAのウィルスベクターによる導入
Cell 159, 440–455, October 9, 2014
58
Rosa26領域
Rosa26領域にβガラクトシダーゼ遺伝子が挿入されたマウス
の系統は全身すべての細胞がX-gal染色陽性となるため,移
植実験のコントロールとしてきわめて有用であった.さらにβ
ガラクトシダーゼ遺伝子を他のマーカー遺伝子と置換しても
全身にマーカーを発現されることが可能で,レポーターコン
ストラクトの挿入に頻用されている
すなわち、どの組織でも発現するということは、組織特異的
なエピジェネティックな抑制制御を受けない遺伝子座といえ
https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/keyword/474.html
る。
Schematic of the Cre-dependent Cas9 Rosa26 targeting vector
Creにより、この領域が欠失するとCas9が発現する
Cell 159, 440–455, October 9, 2014
59
In Vivo Genome Editing in the Brain of CreDependent Cas9 Mice
Cell 159, 440–455, October 9, 2014
60
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ゲノム編集の原理
ゲノム編集の歴史と展望
マウス受精卵でのゲノム編集
ゲノム編集の遺伝子改変マウス作製への応
用
5. 山形大学医学部遺伝子実験センターでのこ
れまでのゲノム編集による遺伝子改変マウ
スの作製の実際
6. 山形大学医学部遺伝子実験センターでの受
託作製の手順
61
遺伝子実験センターでは組換え実験を省略するため
crRNA/tracrRNA/Cas9のシステムを利用
( crRNA/tracrRNA/Cas9 mRNAをco-injection)
42nt
個別の実験で
デザインする
75nt
共通で使える
sgRNA 101nt
1本につなげたキメラRNA(sgRNA)をオリゴハウスでRNA合成するには
長すぎるため、組換え実験が必要となる Science Vol. 337 pp. 820 (2012) 62
遺伝子実験センターでのゲノム編集
マウス受託作製の手順
1. 依頼者:ガイドRNA(crRNA)の配列のデザイン
2. 依頼者:オリゴRNA/ドナーDNAの注文
3. センター:ガイドRNA(crRNA)を介したDNA切断活
性のin vitroでの確認
4. センター:マウス受精卵前核へのCRISPR/CAS9
mRNA, ss donorDNAの導入
5. 依頼者:ゲノム解析による変異個体の確認
63
1.1 ガイドRNA(crRNA)の配列のデザイン
• 標的配列は、PAM配列(NGG)の上流(5’側)に、
20ntを設定する
• DSBはPAM上流3bpで起こる(図)
• ガイドRNAの配列決定にはOff-Target(目的外の遺
伝子座)での切断の可能性の排除とPAM配列の検
索のため、 http://crispr.dbcls.jp/ などで配列候補
を検索する
20nt 標的配列
PAM
切断個所(PAMより3nt上流)
5’-TGTATGAGACCACNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNAGG-3’
3’-ACATACTCTCCTGNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNTCC-5’
64
http://crispr.dbcls.jp/
65
66
67
1.2 ガイドRNA(crRNA)の配列のデザイン
• crRNA配列は検索した20nt(PAM配列は除く)の3’側に
GuuuuaGAgcuaugcuguuuUGを付加した42nt RNA(図)とな
る。
• ただし、点変異を導入する場合、切断個所は点変異導入
箇所により近い方が好ましいため、候補が限られる。
• tracrRNAはセンター側で用意したものを実験に用いる。
crRNA配列 42nt RNA
5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXGuuuuaGAgcuaugcuguuuUG
PAM配列を除いた20ntを22ntにつなげる
tracrRNA 75nt RNA
5’-aaacagcauagcAAGUuaaaaUaaggcuaguccguuaucaacUUGAAaaaGUGgcaccgaGucggu
gcUUUuuuU
68
69
70
71
72
2. オリゴRNA/DNAの注文
• 1.でデザインしたcrRNA(42mer)を依頼者が注文する。
• ドナーDNAを利用する場合、変異導入塩基の両側45ntずつの相同
領域を含む1本鎖オリゴDNA(~90mer)を設計し(図)、センターでの
切断活性試験の結果をみてから注文する。
(切断活性が無い場合はcrRNAデザインを変更した方が良い場合があ
るため)
• 現時点で、crRNA(HPLC精製グレード)は株式会社ジーンデザイン
URL: http://www.genedesign.co.jp/で、ドナーDNA(PAGE精製グ
レード)はIDT URL https://sg.idtdna.com/site (日本代理店MBL)で
合成されたもので実験可能なことを確認している。実績があれば、
オリゴハウスはどこでも可
1本鎖ドナーDNA 45nt+Mutation+45nt
5’-XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX M
XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX
loxPなど短い配列(40~50nt)を挿入する場合、相同領域として、前後に>60ntずつ繋
73
げる
Int5
(-)
Int3
• 依頼者は、2.のcrRNAと増幅し
た標的遺伝子座のPCR産物を
遺伝子実験センターに送付す
る
• 遺伝子実験センターにおいて、
これらに、CAS9タンパク質,
tracrRNAを加え、37℃でイン
キュベート後、電気泳動により
二本鎖切断反応がin vitroで起
こることを確認する(図)
• 切断が確認されない場合は、
crRNAの塩基配列の再検討を
行う。
Int3/int5
3. ガイドRNA(crRNA)を介したDNA切断活性のin vitroでの
確認
19.3kb
7.7kb
6.2kb
4.3kb
3.5kb
2.7kb
1.9kb
0.9kb
0.4kb
4. マウス受精卵前核へのCRISPR/CASベクターの導入
• 依頼者から送られたcrRNA,ドナーDNAに、tracrRNA, Cas9 mRNAを
加えた混合液を、遺伝子実験センターにおいて、C57BL/6受精卵前
核へ導入する。
• C57BL/6以外の受精卵で行う場合は要相談
伊川 正人 領域融合レビュー, 3, e008 (2014)より
5. ゲノム解析による変異個体の確認
• 産子の尾を依頼者に送付する。
• ゲノムDNAを抽出し、PCRによる標的遺伝子領域の増幅後、制限酵素処理や塩
基配列解析、電気泳動などにより、標的遺伝子座での変異を、依頼者が確認す
75
る。変異のある個体を、遺伝子実験センターから依頼者へ譲渡する。
マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法
エレクトロポーレーションによる受精卵への遺伝子導入
Scientific Reports | 5:11315 | DOI: 10.1038/srep11315
76
マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法
エレクトロポーレーションによる受精卵への遺伝子導入
77
Scientific Reports | 5:11315 | DOI: 10.1038/srep11315
マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法
卵管でのエレクトロポーレーションによる遺伝子導入
Scientific Reports | 5:11406 | DOI: 10.1038/srep11406
78
マイクロインジェクションを介さないゲノム編集マウス作製法
卵管でのエレクトロポーレーションによる遺伝子導入
Scientific Reports | 5:11406 | DOI: 10.1038/srep11406
79
80
ゲノム編集受託作製負担金は1系統40万円(ただし、学内
は35万円)を予定して、学内規則を策定しました
81