伸展力誘導性 ATP が骨芽細胞の細胞外マトリックスタンパク遺伝子発現に及ぼす影響日本大学大学院歯学研究科歯学専攻仮谷 (指導：清水典佳教授，鈴木太良直人 1 教授，田邉奈津子准教授) 要旨歯槽骨に加わる適度な矯正力は，骨芽細胞によるプロスタグランジン (PG) E2 産生を増加させ，そのオートクリン作用によって骨形成が促進すると報告されている。メカニカルストレスが負荷された骨芽細胞は，アデノシン 3-リン酸 (ATP) を産生し，P2X7 受容体を介して PGE2 およびリゾホスファチジン酸産生を誘導して骨形成を促進する。そこで，本研究では，そのメカニズムを解明するために，骨芽細胞への伸展力 (TF) 負荷で誘導される ATP が PGE2 産生に及ぼす影響を，P2X7 受容体の選択的アンタゴニスト A438079 を用いて検討した。また，PGE2 がオートクリンに作用して細胞外マトリックスタンパクの発現に及ぼす影響を，COX-2 選択的阻害剤である NS398 を用いて検討した。 PGE2 産生，COX-2，I 型コラーゲン，bone sialoprotein (BSP)，osteopontin (OPN) および osteocalcin (OCN) の発現は，6% TF 負荷によって有意に増加した。TF 負荷で増加した PGE2 産生と COX-2 発現は，A438079 添加によって有意に減少した。また，TF 負荷で増加した COX-2，BSP，OPN および OCN 発現は，NS398 添加によって有意に減少したが，I 型コラーゲン発現にはその影響は認められなかった。 2 以上のことから，骨芽細胞への TF 負荷によって誘導された ATP は，P2X7 受容体を介する PGE2 産生と COX-2 発現を増加させ，PGE2 のオートクリン作用によって，非コラーゲン性タンパク発現を増加させることが示唆された。ランニングタイトル：TF 誘導性 ATP の ECMPs 発現への関与キーワード：伸展力，ATP，P2X7 受容体，PGE2，ECMPs，骨形成 3 緒言骨リモデリングは，ホルモン，サイトカインあるいはメカニカルストレスのような外的因子によって調節されている。また，成人における骨量は，破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のバランスによって維持されている。骨へのメカニカルストレスがない状況下では骨形成が減少することから，メカニカルストレスは，骨量を調節する主要な因子の一つと考えられており，適度なメカニカルストレスが負荷されることによって，骨リモデリングが起こることが知られている 1)。ヌクレオチドの一つであるアデノシン 3-リン酸 (ATP) は，骨芽細胞へのメカニカルストレス負荷に応じて産生される主要なメディエーターである 2,3)。伸展，剪断応力，培地交換あるいは浸透圧等によるメカニカルストレスは，様々な細胞において，ATP 産生を誘導する 4-8)。さらに，メカニカルストレス負荷によって産生された ATP は，細胞内 Ca2+ 濃度の上昇を介して Ca2+ 依存性エキソサイトーシスに関わる 9)。これらのストレス応答性分子としての細胞外 ATP の作用，メカニカルストレスによって誘導される ATP の産生は，細胞障害を伴わないことが報告されている 10)。 P2 受容体は，骨芽細胞および破骨細胞で発現し，イオンチャネル型受容体で 4 ある P2X ファミリーおよび G タンパク共役型受容体である P2Y ファミリーの 2 つのグループに分けられる 11) 。メカニカルストレスや炎症によって放出された ATP は，骨リモデリングに対して，オートクリン/パラクリン作用を介して機能する 5,12,13) 発現し。また，骨芽細胞では P2X 受容体および P2Y 受容体の両方が 2,14) ，マウス頭蓋冠細胞の P2X7 受容体は剪断応力によって活性化される 5)。さらに，骨芽細胞上の P2X7 受容体チャネルの開口が，メカニカルストレス負荷による骨形成に影響を及ぼすことも明らかにされている 15)。 P2X7 ノックアウトマウスでは，長骨の長さに変化はなく，膜内骨化が減少することが報告されている 16)。これらの報告は，P2X7 受容体が，メカニカルストレス応答性を有することで骨形成に関与することを示唆している。さらに， P2X7 受容体のアゴニストである 3' -O- (4-benzoyl) benzoyl ATP (BzATP) は，骨芽細胞のリゾホスファチジン酸 (LPA) と PGE2 産生を誘導し，骨形成を促進することが報告されている 17)。歯科矯正治療時における歯の移動によって生じる歯周組織中の細胞外マトリックス (ECM) の再構築には，歯肉，歯根膜および歯槽骨それぞれのリモデリングが重要な役割を担っている 18) 。しかしながら，骨芽細胞への伸展力 (TF) 負荷によって誘導される ATP が PGE2 産生に及ぼす影響，産生された PGE2 が細胞外マトリックスタンパク (ECMPs) 発現に及ぼす影響については不明な点が 5 多い。そこで本研究では，そのメカニズムを解明するために，骨芽細胞への TF 負荷で誘導される ATP が PGE2 産生に及ぼす影響を，P2X7 受容体の選択的アンタゴニスト A438079 を用いて検討した。また，PGE2 がオートクリンに作用して ECMPs 発現に及ぼす影響を，COX-2 選択的阻害剤である NS398 を用いて検討した。 6 材料および方法 1．細胞培養本研究には，骨芽細胞として MC3T3-E1 細胞 (理研バイオリソースセンター，茨城) を用いた。MC3T3-E1 細胞の培養は，10% ウシ胎児血清 (FBS; HyClone Laboratories，Logan，UT，USA) と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA) を含む -minimal essential medium ( -MEM; Gibco BRL，Rockville，MD，USA) を培養液として用いて，37 ºC，5% CO2 存在下で行った。培養液は 3 日毎に交換した。 2．TF 負荷 Flexercell Strain Unit (FX-3000，Flexcell Corp.，Hillsborough，NC，USA) を用いて MC3T3-E1 細胞に TF を負荷した 19)。MC3T3-E1 細胞を， flexible-bottomed 6-well plates (Flexcell Corp.，Hillsborough，NC，USA) に 2×104 cells/cm2 となるように播種し，Flexercell Strain Unit に設置後，陰圧を負荷して plate 底面を下方に伸展させた。TF は放射状および円周方向に均等であり 20) ，その強度は 6% TF すなわち plate 底面の表面積を 6%増加させる強度を使用し，6 cycles/min (5 sec strain，5 sec relaxation) で細胞に 3 hours/day の TF を負荷した 19)。コ 7 ントロールは，同一条件で flexible-bottomed 6-well plates に播種し，TF の負荷を加えないものとした。なお，P2X7 受容体アンタゴニストとして用いた A438079 の濃度は 10 μM 21,22) とし，COX-2 選択的阻害剤 NS398 の濃度は 0.5 μM とした 23,24)。 3．Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 細胞に TF 負荷後，FBS を含まない培地でさらに 24 時間培養し，培養上清を ELISA の試料とした。PGE2 産生量は，市販の ELISA kit (R&D systems， Minneapolis，MN，USA) を用いて定量した。 4．Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) 細胞を flexible-bottomed 6-well plates に播種し，14 日間培養を行った。培養 3，7 および 14 日目の細胞から RNeasy Mini Kit (QIAGEN，Hilden，Germany) を用いて全 RNA を抽出した。RNA 量は NanoDrop 1000 (ND-1000; Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA) を用いて測定した。Prime Script RT reagent kit (Takara Bio，滋賀) で mRNA から complementary DNA (cDNA) を作成し， SYBR-Green I を用いたインターカレンター法で，real-time PCR を行った。第 1 表に使用した上・下流のプライマー配列を示す。遺伝子の増幅は Smart Cycler 8 (Cepheid，Sunnyvale，CA，USA) を用い，SYBER Premix Ex Taq (Takara Bio，滋賀) に cDNA を加え 95 ºC，10 秒間加熱した後，95 ºC で 5 秒間の denaturation， 60 ºC で 20 秒間の annealing/extension を 1 サイクルとして 40 サイクルを行った。結果の解析は Smart Cycler Software version 2 を用いて行った。あらかじめ作成した検量線をもとに遺伝子の増幅量を求め，グリセルアルデヒド 3-リン酸脱水素酵素 (GAPDH) の増幅量で補正した値を mRNA 発現量とした 25)。 5．統計学的分析実験はいずれも 3 回繰返し，結果は平均値と標準誤差で表した。3 群以上の比較は two-way ANOVA を行った後，Bonferroni による多重比較を行った。なお，危険率 5% 未満を有意差とした。 9 結果 1．TF が P2X7 受容体を介した PGE2 産生に及ぼす影響骨芽細胞への 6% TF 負荷が，P2X7 受容体を介した PGE2 産生に及ぼす影響について検討した (第 1 図)。培養 3，7 および 14 日目の PGE2 産生量は，6% TF 負荷によって，コントロールと比べてそれぞれ 2.6，1.8 および 1.6 倍有意に増加した。TF 負荷によって増加した培養 3 日目の PGE2 産生量は，P2X7 受容体の選択的アンタゴニストである A438079 添加によって有意に減少したが，培養 7 および 14 日目には有意な減少は認められなかった。 2．TF が P2X7 受容体を介した COX-2 遺伝子発現に及ぼす影響 6% TF 負荷が P2X7 受容体を介した COX-2 の遺伝子発現に及ぼす影響を検討した (第 2 図)。培養 3，7 および 14 日目の COX-2 の遺伝子発現は，6% TF 負荷によって，コントロールと比べてそれぞれ 2.6，2.1 および 2.2 倍有意に増加した。TF 負荷によって増加した培養 3 日目の COX-2 発現は，A438079 添加によって有意に減少したが，培養 7 および 14 日目には有意な減少は認められなかった。 10 3．TF による COX-2 遺伝子発現への NS398 の影響 6% TF 負荷による COX-2 の遺伝子発現への NS398 の影響を検討した (第 3 図)。培養 3，7 および 14 日目に 6% TF 負荷によって増加した COX-2 の遺伝子発現は，NS398 添加によって有意に減少した。 4．TF および NS398 が ECMPs 遺伝子発現に及ぼす影響 6% TF 負荷および NS398 が ECMPs の遺伝子発現に及ぼす影響を検討した (第 4 図)。培養 3 および 7 日目の I 型コラーゲンの遺伝子発現は，6% TF 負荷によって，コントロールと比べてそれぞれ 2.0 および 1.7 倍有意に増加したが，培養 14 日目の I 型コラーゲン発現には，TF 負荷の影響は認められなかった。TF 負荷によって増加した培養 3 および 7 日目の I 型コラーゲン発現には，NS398 添加の影響は認められなかった (第 4 図 a)。培養 7 および 14 日目の bone sialoprotein (BSP) の遺伝子発現は，6% TF 負荷によって，コントロールと比べてそれぞれ 4.8 および 3.3 倍有意に増加したが，培養 3 日目の BSP 発現には，TF 負荷の影響は認められなかった。TF 負荷によって増加した培養 7 および 14 日目の BSP 発現は，NS398 添加によって有意に 11 減少した (第 4 図 b)。培養 3，7 および 14 日目の osteopontin (OPN) の遺伝子発現は，6% TF 負荷によって，コントロールと比べてそれぞれ 2.3，2.8 および 1.5 倍有意に増加した。TF 負荷によって増加した培養 7 日目の OPN 発現は，NS398 添加によって有意に減少したが，培養 3 および 14 日目の OPN 発現には，NS398 添加による有意な減少は認められなかった (第 4 図 c)。培養 14 日目の osteocalcin (OCN) の遺伝子発現は，6% TF 負荷によって，コントロールと比べて 1.7 倍有意に増加したが，培養 3 および 7 日目の OCN 発現には，TF 負荷の影響は認められなかった。TF 負荷によって増加した培養 14 日目の OCN 発現は，NS398 添加によって有意に減少した (第 4 図 d)。 12 考察矯正治療時のメカニカルストレスによって圧迫側では骨吸収が起こり，牽引側では骨形成が起こる 26,27) 。圧迫力は，骨芽細胞の PGE2 産生を介して骨芽細胞の分化を促進する 28) のみでなく，破骨細胞の分化を促進する炎症性サイトカインやメディエーターを誘導することも報告されている 27) 。しかしながら，牽引側における骨形成に対する PGE2 の役割については未だ不明な点が多い。 ATP は，骨芽細胞から恒常的または誘導的に産生される 5,29)。Komarova ら 30) は，in vitro においてラット頭蓋冠細胞が産生し細胞外に放出する ATP 産生が骨形成を促進すること，培養 10-14 日目における ECM 中の ATP 濃度が約 5 倍に増加することで，骨芽細胞の分化が促進されることを報告した。 ATP および P2X7 受容体のアゴニストである BzATP は，Na+，K+ および Ca2+ を透過する P2X7 受容体のチャネルの開口を誘導する。この P2X7 受容体の活性化は，細胞内 Ca2+ 濃度の上昇および細胞膜の脱分極を誘導する 31) 。さらに， BzATP は，ホスホリパーゼ D およびホスホリパーゼ A2 (PLA2) の活性化を介して LPA の産生を誘導すること，また，COX-2 は，LPA 受容体とともに，骨芽細胞における P2X7 受容体を介した骨形成に関与することが報告されている 17) 。これらの背景から，著者は，1) TF が骨芽細胞に負荷されることによって，細胞 13 外へ ATP が放出され，骨芽細胞の P2X7 受容体が活性化される，2) 活性化された P2X7 受容体を介して PGE2 産生が促進される，さらに，3) 産生促進された PGE2 がオートクリン作用によって ECMPs の遺伝子発現に影響を及ぼすのではないか，という仮説に基づいて，本研究を企図した。具体的には，骨芽細胞様細胞である MC3T3-E1 細胞に TF 負荷し，産生誘導された ATP が P2X7 受容体を介して PGE2 産生に及ぼす影響を調べ，さらに，産生された PGE2 が ECMPs の遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。その結果，3 hours/day の TF 負荷は， MC3T3-E1 細胞の PGE2 産生を促進し，P2X7 受容体競合的アンタゴニスト A438079 21,22) は，TF 負荷による影響を有意に抑制した。Genetos ら 5) は， MC3T3-E1 細胞へのメカニカルストレス負荷によって誘導された ATP は， PGE2 産生を誘導すると報告している。一方，P2X7 ノックアウトマウスの骨芽細胞では，メカニカルストレス負荷によって誘導された PGE2 産生量は，wild-type マウスに比べて減少していたと報告されている 32) 。これらの報告は，メカニカルストレス負荷によって細胞外に放出された ATP は，P2X7 受容体を活性化し， PGE2 産生を促進することを示唆している。 PGE2 は，細胞膜リン脂質（主にホスファチジルコリン）から PLA2 の作用で遊離して生合成されるアラキドン酸からなる生理活性物質エイコサノイドの一つである。COX-2 は，アラキドン酸を PGE2 に変換させる酵素であり，メカニ 14 カルストレスや炎症によってその発現は誘導される 33) 。さらに，骨芽細胞に加わる適度な矯正力は，骨芽細胞による PGE2 産生を増加させ，そのオートクリン作用によって骨形成を促進したと報告されている 34)。本研究では，6% TF 負荷が，骨芽細胞による COX-2 発現を促進し，PGE2 産生を増加させた。さらに， A438079 は，6% TF 負荷によって増加した PGE2 産生および COX-2 発現を減少させた。これらの結果から，TF 負荷によって誘導された ATP は P2X7 受容体を活性化し， COX-2 発現の増加を介して PGE2 産生を促進することが示唆された。また，本研究で使用した COX-2 選択的阻害剤 NS398 は，COX-2 の酵素活性を阻害するだけでなく，転写活性も抑制すると報告されており 23,24)，本研究結果では，NS398 はすべての培養日数において，6% TF 負荷による COX-2 の遺伝子発現の増加を減少させた。 I 型コラーゲンは，骨の ECM における主要な有機成分であり，石灰化において，ヒドロキシアパタイト結晶核形成のための足場になると考えられている。一方，非コラーゲン性タンパクは，ヒドキシアパタイト結晶の形成および成長の調節において重要な役割を担う 35) 。骨における主要な非コラーゲン性タンパクとして，BSP，OPN および OCN が知られている 36)。BSP は，高度にリン酸化およびグリコシル化されたシアロタンパクである。ECM 中に分泌された BSP は，ヒドロキシアパタイト結晶核形成を介して骨の初期石灰化に関与する 15 37) 。 OPN は，高度にリン酸化したリンタンパク質で，骨の石灰化 ECM における主要な構成成分である 38)。また，OPN は，生体防御および組織修復などにおいて，骨形成および骨リモデリングに間接的に作用する 39)。OCN は，骨芽細胞において特異的に発現する  -カルボキシグルタミン酸含有タンパクであり，Ca2+ と結合することで過剰な石灰化を抑制する 40)。本研究では，6% TF 負荷が I 型コラーゲンの発現を促進させる一方，NS398 が非コラーゲン性タンパクの発現を抑制することが明らかとなった。また，TF 負荷によって産生された PGE2 は，培養初期においては P2X7 受容体依存的に産生され，産生された PGE2 は，オートクリン因子として作用することが示唆された。これらの結果から，TF 負荷によって増加する PGE2 が，骨芽細胞の非コラーゲン性タンパク発現を増加させ，石灰化の環境づくりに関与する可能性が考えられた。したがって，骨芽細胞への 6% TF 負荷によって誘導された ATP は，培養初期において，P2X7 受容体を介する PGE2 産生と COX-2 発現を増加させ， PGE2 のオートクリン作用によって非コラーゲン性タンパク発現を増加させることが示唆された。なお，本研究結果では，I 型コラーゲンの発現が TF 負荷により産生された PGE2 の影響を受けなかったこと，培養後期において TF 負荷による PGE2 産生が A438079 によって抑制されなかったことなどから，骨芽細胞のコラーゲン代 16 謝における TF 負荷の P2X7 受容体を介した LPA および PGE2 の相互作用については，今後の検討が必要である。 17 結論骨芽細胞への TF 負荷で誘導される ATP が PGE2 産生に及ぼす影響および産生された PGE2 が ECMPs の遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。その結果，以下に示す結果および結論を得た。 1．培養 3，7 および 14 日目の PGE2 産生量は，6% TF 負荷によって有意に増加し，3 日目の PGE2 産生量は，P2X7 受容体の選択的アンタゴニスト A438079 添加によって有意に減少した。 2．培養 3，7 および 14 日目の COX-2 の遺伝子発現は，6% TF 負荷によって有意に増加し，3 日目の COX-2 発現は，A438079 添加によって有意に減少した。さらに，3，7 および 14 日目の COX-2 発現は，NS398 添加によって有意に減少した。 3．培養 3 および 7 日目の I 型コラーゲンの遺伝子発現は，6% TF 負荷によって有意に増加した。しかし，TF 負荷によって増加した 3 および 7 日目の I 型コラーゲン発現には，NS398 添加の影響は認められなかった。 4. 培養 7 および 14 日目の BSP の遺伝子発現は，6% TF 負荷によって有意に増加し，7 および 14 日目の BSP 発現は，NS398 添加によって有意に減少した。 5. 培養 3，7 および 14 日目の OPN の遺伝子発現は，6% TF 負荷によって有意に増加し，7 日目の OPN 発現は NS398 添加によって有意に減少したが，3 およ 18 び 14 日目の OPN 発現にはその影響が認められなかった。 6. 培養 14 日目の OCN の遺伝子発現は，6% TF 負荷によって有意に増加し，14 日目の OCN 発現は，NS398 添加によって有意に減少した。以上のことから，骨芽細胞への 6% TF 負荷によって誘導された ATP は，培養初期において，P2X7 受容体を介する PGE2 産生と COX-2 発現を増加させ，さらに PGE2 のオートクリン作用によって非コラーゲン性タンパク発現を増加させて骨形成を促進することが示唆された。 19 謝辞本研究遂行に当たり，格別たるご指導ご鞭撻を賜りました日本大学歯学部矯正学講座の清水典佳教授に謹んで心より感謝申し上げます。また，本研究を通じ多大なるご協力とご助言を賜りました本学部生化学講座の鈴木直人教授および田邉奈津子准教授，衛生学講座の前野正夫教授および川戸貴行准教授を始め，矯正学講座，生化学講座および衛生学講座の皆様に深く感謝致します。本研究は，平成 23 年度大学院歯学研究科研究費 (学生分，仮谷太良)，平成 24 年度大学院歯学研究科研究費 (学生分，仮谷太良) および平成 25 年度大学院歯学研究科研究費 (学生分，仮谷太良) によってなされた。 20 引用文献 1) Robling AG, Castillo AB, Turner CH (2006) Biomechanical and molecular regulation of bone remodeling. Annu Rev Biomed Eng 8, 455-498. 2) Dixon SJ, Sims SM (2000) P2 purinergic receptors on osteoblasts and osteoclasts: Potential targets for drug development. Drug Dev Res 49, 187-200. 3) Robling AG, Bellido T, Turner CH (2006) Mechanical stimulation in vivo reduces osteocyte expression of sclerostin. J Musculoskelet Neuronal Interact 6, 354. 4) Romanello M, Pani B, Bicego M, D'Andrea P (2001) Mechanically induced ATP release from human osteoblastic cells. Biochem Biophys Res Commun 289, 1275-1281. 5) Genetos DC, Geist DJ, Liu D, Donahue HJ, Duncan RL (2005) Fluid shear-induced ATP secretion mediates prostaglandin release in MC3T3-E1 osteoblasts. J Bone Miner Res 20, 41-49. 6) Riddle RC, Taylor AF, Rogers JR, Donahue HJ (2007) ATP release 21 mediates fluid flow-induced proliferation of human bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res 22, 589-600. 7) Anderson HC (1989) Mechanism of mineral formation in bone. Lab Invest 60, 320-330. 8) Praetorius HA, Spring KR (2001) Bending the MDCK cell primary cilium increases intracellular calcium. J Membr Biol 184, 71-79. 9) Boudreault F, Grygorczyk R (2004) Cell swelling-induced ATP release is tightly dependent on intracellular calcium elevations. J Physiol 561, 499-513. 10) Praetorius HA, Leipziger J (2009) ATP release from non-excitable cells. Purinergic Signal 5, 433-446. 11) Burnstock G (2007) Physiology and pathophysiology of purinergic neurotransmission. Physiol Rev 87, 659-797. 12) Hoebertz A, Arnett TR, Burnstock G (2003) Regulation of bone resorption and formation by purines and pyrimidines. Trends Pharmacol Sci 24, 290-297. 13) Jorgensen NR, Henriksen Z, Sorensen OH, Eriksen EF, Civitelli R, Steinberg TH (2002) Intercellular calcium signaling occurs between 22 human osteoblasts and osteoclasts and requires activation of osteoclast P2X7 receptors. J Biol Chem 277, 7574-7580. 14) Hoebertz A, Townsend-Nicholson A, Glass R, Burnstock G, Arnett TR (2000) Expression of P2 receptors in bone and cultured bone cells. Bone 27, 503-510. 15) Grol MW, Panupinthu N, Korcok J, Sims SM, Dixon SJ (2009) Expression, signaling, and function of P2X7 receptors in bone. Purinergic Signal 5, 205-221. 16) Ke HZ, Qi H, Weidema AF, Zhang Q, Panupinthu N, Crawford DT, Grasser WA, Paralkar VM, Li M, Audoly LP, Gabel CA, Jee WS, Dixon SJ, Sims SM, Thompson DD (2003) Deletion of the P2X7 nucleotide receptor reveals its regulatory roles in bone formation and resorption. Mol Endocrinol 17, 1356-1367. 17) Panupinthu N, Rogers JT, Zhao L, Solano-Flores LP, Possmayer F, Sims SM, Dixon SJ (2008) P2X7 receptors on osteoblasts couple to production of lysophosphatidic acid: a signaling axis promoting osteogenesis. J Cell Biol 181, 859-871. 18) Krishnan V, Davidovitch Z (2006) Cellular, molecular, and tissue-level 23 reactions to orthodontic force. Am J Orthod Dentofacial Orthop 129, 469 e461-432. 19) Shimizu N, Yamaguchi M, Goseki T, Shibata Y, Takiguchi H, Iwasawa T, Abiko Y (1995) Inhibition of prostaglandin E2 and interleukin 1-β production by low-power laser irradiation in stretched human periodontal ligament cells. J Dent Res 74, 1382-1388. 20) Vande Geest JP, Di Martino ES, Vorp DA (2004) An analysis of the complete strain field within Flexercell membranes. J Biomech 37, 1923-1928. 21) Donnelly-Roberts D, McGaraughty S, Shieh CC, Honore P, Jarvis MF (2008) Painful purinergic receptors. J Pharmacol Exp Ther 324, 409-415. 22) McGaraughty S, Chu KL, Namovic MT, Donnelly-Roberts DL, Harris RR, Zhang XF, Shieh CC, Wismer CT, Zhu CZ, Gauvin DM, Fabiyi AC, Honore P, Gregg RJ, Kort ME, Nelson DW, Carroll WA, Marsh K, Faltynek CR, Jarvis MF (2007) P2X7-related modulation of pathological nociception in rats. Neuroscience 146, 1817-1828. 23) Ghosh M, Wang H, Ai Y, Romeo E, Luyendyk JP, Peters JM, Mackman 24 N, Dey SK, Hla T (2007) COX-2 suppresses tissue factor expression via endocannabinoid-directed PPARδ activation. J Exp Med 204, 2053-2061. 24) Amirghahari N, Harrison L, Smith M, Rong X, Naumann I, Ampil F, Shi R, Glass J, Nathan CO (2003) NS398 radiosensitizes an HNSCC cell line by possibly inhibiting radiation-induced expression of COX-2. Int J Radiat Oncol Biol Phys 57, 1405-1412. 25) Kuwabara A, Tanabe N, Kawato T, Tanaka H, Nakai K, Iinuma T, Oki H, Motohashi M, Maeno M (2011) Interleukin-17A induces extracellular matrix protein expression in osteoblastic ROS17/2.8 cells. J Hard Tissue Biol 20, 247-257. 26) King GJ, Latta L, Rutenberg J, Ossi A, Keeling SD (1997) Alveolar bone turnover and tooth movement in male rats after removal of orthodontic appliances. Am J Orthod Dentofacial Orthop 111, 266-275. 27) Sanuki R, Mitsui N, Suzuki N, Koyama Y, Yamaguchi A, Isokawa K, Shimizu N, Maeno M (2007) Effect of compressive force on the production of prostaglandin E2 and its receptors in osteoblastic Saos-2 cells. Connect Tissue Res 48, 246-253. 25 28) Mitsui N, Suzuki N, Maeno M, Yanagisawa M, Koyama Y, Otsuka K, Shimizu N (2006) Optimal compressive force induces bone formation via increasing bone morphogenetic proteins production and decreasing their antagonists production by Saos-2 cells. Life Sci 78, 2697-2706. 29) Gartland A, Buckley KA, Hipskind RA, Bowler WB, Gallagher JA (2003) P2 receptors in bone-modulation of osteoclast formation and activity via P2X7 activation. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 13, 237-242. 30) Komarova SV, Ataullakhanov FI, Globus RK (2000) Bioenergetics and mitochondrial transmembrane potential during differentiation of cultured osteoblasts. Am J Physiol Cell Physiol 279, C1220-1229. 31) Pelegrin P, Surprenant A (2006) Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1β release by the ATP-gated P2X7 receptor. EMBO J 25, 5071-5082. 32) Li J, Liu D, Ke HZ, Duncan RL, Turner CH (2005) The P2X7 nucleotide receptor mediates skeletal mechanotransduction. J Biol Chem 280, 42952-42959. 33) Kurumbail RG, Stevens AM, Gierse JK, McDonald JJ, Stegeman RA, 26 Pak JY, Gildehaus D, Miyashiro JM, Penning TD, Seibert K, Isakson PC, Stallings WC (1996) Structural basis for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by anti-inflammatory agents. Nature 384, 644-648. 34) Mitsui N, Suzuki N, Maeno M, Mayahara K, Yanagisawa M, Otsuka K, Shimizu N (2005) Optimal compressive force induces bone formation via increasing bone sialoprotein and prostaglandin E2 production appropriately. Life Sci 77, 3168-3182. 35) Boskey AL (1992) Mineral-matrix interactions in bone and cartilage. Clin Orthop Relat Res 281, 244-274. 36) Sodek J, Zhang Q, Goldberg HA, Domenicucci C, Kasugai S, Wrana JL (1991) Non-collagenous substrate-induced bone bioactivity. proteins In: and Davies, their J.E role (ed), in The Bone-biomaterial Interface. University of Toronto Press, Toronto, 97-110. 37) Hunter GK, Goldberg HA (1993) Nucleation of hydroxyapatite by bone sialoprotein. Proc Natl Acad Sci USA 90, 8562-8565. 38) Oldberg A, Franzen A, Heinegard D (1986) Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an 27 Arg-Gly-Asp cell-binding sequence. Proc Natl Acad Sci USA 83, 8819-8823. 39) Sodek J, Ganss B, McKee MD (2000) Osteopontin. Crit Rev Oral Biol Med 11, 279-303. 40) Boivin G, Morel G, Lian JB, Anthoine-Terrier C, Dubois PM, Meunier PJ (1990) Localization of endogenous osteocalcin in neonatal rat bone and its absence in articular cartilage: effect of warfarin treatment. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol 417, 505-512. 28 第 1 表プライマーの配列 29 第 1 図 TF が P2X7 受容体を介した PGE2 産生に及ぼす影響 ** p ˂ 0.01 vs control, ++ p ˂ 0.01 vs 6% TF 30 第 2 図 TF が P2X7 受容体を介した COX-2 遺伝子発現に及ぼす影響 * p ˂ 0.05 vs control, ** p ˂ 0.01 vs control, ++ p ˂ 0.01 vs 6% TF 31 第 3 図 TF による COX-2 遺伝子発現への NS398 の影響 ** p ˂ 0.01 vs control, + p ˂ 0.05 vs 6% TF, ++ p ˂ 0.01 vs 6% TF 32 第 4 図 TF および NS398 が ECMPs 遺伝子発現に及ぼす影響 ** p ˂ 0.01 vs control, + p ˂ 0.05 vs 6% TF, ++ p ˂ 0.01 vs 6% TF 33