Cytometric Bead Arrayとは ・ 蛍 光 強 度 の 違 う 数 種 類 の Beadsを使用し、フローサイトメター を用いて溶液中の蛋白質濃度を測定する方法 ・測定対象はサイトカインやイムノグロブリンなど ・多項目を同時に測定可能 ・ サ ン プ ル 調 製 は 、ELISAと同様のサンドイッチ法 CBA KITの種類 ・ヒトTh1/Th2サイトカイン CBAキット IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF-α IFN-γ ・ヒトTh1/Th2サイトカイン CBAキットⅡ IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-α IFN-γ ・ヒトInflammation CBAキット IL-1β IL-6 IL-8 IL-10 TNF-α IL-12p70 ・マウスTh1/Th2サイトカイン CBAキット IL-2 IL-4 IL-5 IFN-γ TNF-α ・マウスImmunoglobulin Isotyping CBAキット マウスκ,λ IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgA IgM IgE 利点（ELISAとの比較） ・１Test当り、1 測 定 項 目 約 300回 の ア ッ セ イ に 相 当 す る ・サンプル量が １／６（１サンプルでｻｲﾄｶｲﾝ６種類測定） ・測定時間が短く（約５時間）、６種類の測定結果が得られる ・測定範囲が ２０−５，０００ pg／ ｍＬと広範囲 作業効率の改善と低コスト化 1 Human Th1/Th2 cytokine CBA Kit (BD-550749) ・培 養 上 清 、 血 清 、 血 漿 中 の ６ 種 類 の ﾋﾄｻｲﾄｶｲﾝ （IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α , IFN-γ ) の 濃 度 をFCMを 用 い て同 時 に 測定できるキット 測定原理 原理(1) • 測定原理はELISAと同様の抗原抗体反応 • ELISAでは （吸光度測定） Capture抗体： 96穴プレートにコートし、 Detection抗体-B/SA-Enzymeで発色 • CBAでは （蛍光強度測定） Capture抗体： ビーズにコート（６種類） Detection抗体-蛍光色素でFCM解析 2 原理(2) ELISA CBA 基質 蛍 光 色 素 標 識 Detection抗 体 SA-HRP Y サイトカイン 蛍光強度測定 （FCM） PE Ｙ Detection antibody (ビオチン標識抗体) 抗体 Ｙ Ｙ Ｙ 発色 Capture antibody Y 抗原 吸光度測定 サイトカイン ビーズ 96 well microplate サ イ ト カ イ ン 抗 体 ( C a p t u r e 抗体 ) を コートしたビーズ 原理(3) Captureビ ー ズ の 蛍 光 強 度 (FL3) IL-2 > IL-4 > IL-5 >IL10 > TNF-α > IFN-γ Y PE PE IL-10 Y Y Y Y PE FL2： cytokine 濃 度 ビーズ IL-5 Y PE Y PE Y Y Y Y IFN- γY TNF-α PE Y PE Y Y Y IL-4 Y 抗原 Ｙ 抗体 Ｙ Ｙ Ｙ IL-2 Y Cytokine capture beads と PE-conjugated detection antibodyで cytokineを サンドイッチ FL3: 6種 の 蛍 光 強 度 （ ｻ ｲ ﾄ ｶ ｲ ﾝ の 種 類 ） FCM表 示 FL2-H/FL3-H Dot Plot IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF-α IFN-γ サイトカインの 種 類 はFL3-H 3 FCM表 示 FL2-H/FL3-H Dot Plot IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF-α サイトカインの IFN-γ 種 類 はFL3-H 濃 度 はFL2-H Cytokine 濃 度 キット内容 Kit Contents ( Store the following items at 4° C) • • A1 : Mouse IL-2 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml A2 : Mouse IL-4 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml • • • A3 : Mouse IL-5 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml A4 : Mouse IL-10 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml A5 : Mouse TNF-α Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml • • • A6 : Mouse IFN-γ Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml B : Mouse Th1/Th2 PE Detection Reagent: 1 vial, 4 ml C : Mouse Th1/Th2 Cytokine Standards: 2 vials, 0.2 ml lyophilized • • • D : Cytometer Setup Beads: 1 vial, 1.5 ml E1 : PE Positive Control Detector: 1 vial, 0.5 ml E2 : FITC Positive Control Detector: 1 vial, 0.5 ml • • F : Wash Buffer: 1 bottle, 130 ml G : Assay Diluent: 1 bottle, 30 ml 注) PE : Phycoerythrin, FITC : Fluorescein Isothiocyanate 4 Kit Contents (A) Capture Beads Human cytokine capture beads (A1-A6) • A1. Mouse IL-2 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml • A2. Mouse IL-4 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml • A3. Mouse IL-5 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml • A4. Mouse IL-10 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml • A5. Mouse TNF-α Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml • A6. Mouse IFN-γ Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml • 70-test / each specific capture beads • 4℃ 保 存 、 凍 結 不 可 • ５ 種 類 混 合 し 、 50 µl/testで 使 用 • 使用前に攪拌すること FL3-H brightest ＹＹＹ 6種 類 の ビ ー ズ Kit Contents (B) Detection antibody Human Th1/Th2 PE Detection Reagent: 1 vial, 4 ml • • PE-conjugated anti-human IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α , IFN-γ 70-test/vial,使 用 量 ：50 µl/test, 4℃ 保 存 、 凍 結 不 可 (C)Standard Human Th1/Th2 Cytokine Standards: 2 vials, 0.2 ml lyophilized • • Assay diluent 0.2mlに 溶 解 10X bulk standard (50ng/ml) (Top standard 5000pg/mlの 10倍 濃 度 液 ) 溶 解 後 は 4℃ 保 存 で 12時 間 以 内 に 使 用 Kit Contents (D) Instruments setup beads D. Cytometer Setup Beads: 1 vial, 1.5 ml 装 置 の 初 期 設 定 用 (PMT voltages & compensation) 30-test /vial 使 用 量 ：50 µ l/test 4℃ 保 存 、 凍 結 不 可 注）PMT : Photomultiplier （光電子倍増管） 5 Kit Contents (E) Instruments setup reagents E1. PE Positive Control Detector: 1 vial, 0.5 ml • PE-conjugated antibody control • 装 置 の 初 期 設 定 用 (compensation) • Cytometer setup beadsと 共 に 使 用 • 10-test/vial,使 用 量 ：50 µl/test, 4℃ 保 存 、 凍 結 不 可 E2. FITC Positive Control Detector: 1 vial, 0.5 ml • FITC-conjugated antibody control • 装 置 の 初 期 設 定 用 (compensation) • Cytometer setup beadsと 共 に 使 用 • 10-test/vial,使 用 量 ：50 µl/test, 4℃ 保 存 、 凍 結 不 可 Kit Contents (G,F) Buffer reagents G. Wash Buffer: 1 bottle, 130 ml • • Standards お よ び test sample の 希 釈 に 使 用 4℃ 保 存 F. Assay Diluent: 1 bottle, 30 ml • • • 蛋 白 質 、 界 面 活 性 剤 を 含 む PBS (phosphate buffered saline) ビーズの洗浄、再懸濁に使用 4℃ 保 存 その他必要品 • FCM (CellQuest, FACSComp) • Falcon tube (12 x 75 mm) • BD CBA Software (Macintosh computer, Microsoft Excel) • MAC（ G3以上） • BD CaliBRITETM3 beads 6 CBA に よ る ｻ ｲ ﾄ ｶ ｲ ﾝ 測 定 法 の 流 れ ① 測 定 ｻ ﾝ ﾌ ﾟ ﾙ と FCM測 定 条 件 設 定 用 b e a d s の 準 備 測定ｻﾝﾌﾟﾙの調製（希釈等） Capture beads混 合 液 ＋ 測 定 ｻ ﾝ ﾌ ﾟ ﾙ ＋ PE標 識 検 出 用 抗 体 の 反 応 FCMの Setup beads の 調 製 ② FCM機 器 設 定 と サ イ ト カ イ ン 測 定 CaliBRITE3 beadsに よ る 機 器 設 定 FACSCompを 使 用 上 記 Setup beads A,B,Cに よ る 機 器 の 条 件 設 定 CBA software の 機 器 設 定 Templateを 使 用 サイトカイン量の測定 データ解析 Acquisition Template を 使 用 ﾃﾞｰﾀ解析用ｿﾌﾄｳｪｱを使用 測定法概略 C a p t u r e b e a d s混 合 液 ( 5 0µl ) S T N ま た は 検 体 (50 µl ) PE 標 識 検 出 用 抗 体 (50 µl ) FCM Setup beadsの 調 製 Tube A : setup beads 50µ l Tube B : setup beads 50µl 遮光下、室温３時間反応 + FITC- Positive Control Detector 5 0µl Tube C : setup beads 50µ l ビ ー ズ を wash buffer 1mlで 洗 浄 200g x 5 min.遠 心 Supernatant を 注 意 深 く aspirate wash buffer 300µ lで 再 懸 濁 + PE- Positive Control Detector 5 0µl 遮 光 下 、 室 温 30分 反 応 後 wash bufferで 500µ lに 調 製 FCMに て 測 定 Acquisition template example 7 Analysis of sample data BD CBA Softwareを用 い てdataを 解 析 す る 1. FACS file data を BD CBA Softwareに transfer 2. Standard と Sampleの 2つ の フ ォ ル ダ ー を 作 成 3. FACS file data を そ れ ぞ れ の フ ォ ル ダ ー に 移 す 4. Software を 用 い て dataを 解 析 す る 測定性能 Assay Range 20 - 5,000 pg/ml Sensitivity Assay Sensitivity cytokine Median Fluorescence Mean ± S.D. IL-2 3.3 ± 0.2 IL=4 2.3 ± 0.2 IL-5 2.6 ± 0.2 IL-10 2.4 ± 0.2 T N F -α 2.0 ± 0.2 IFN- γ 2.1 ± 0.3 Sensitivity (pg/ml) 2.6 2.6 2.4 2.8 2.8 7.1 注：background MFI(N=20)の mean+2SDを示す濃度 （4- parameter curve より求めた） 8 Precision Intra-assay Precision cytokine IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF-α IFN-γ N=10 実測値(pg/ml) Mean ± SD 71 ± 1 534 ± 23 2160 ± 74 85 ± 3 592 ± 25 2488 ± 108 78 ± 2 587 ± 29 2456 ± 150 82 ± 2 592 ± 15 2486 ± 86 81 ± 2 592 ± 22 2504 ± 126 78 ± 3 528 ± 21 2194 ± 65 C.V. (%) 2 4 3 4 4 4 3 5 6 2 2 3 3 4 5 4 4 3 cytokine IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 Inter-assay Precision 実測値(pg/ml) C.V. Mean ± SD (%) 77 ± 7 9 627 ± 29 5 2509 ± 247 10 74 ± 5 7 601 ± 40 7 2553 ± 147 6 80 ± 4 5 615 ± 39 6 2560 ± 165 6 81 ± 631 ± 2556 ± TNF-α 79 ± 627 ± 2564 ± IFN-γ 69 ± 610 ± 2518 ± N=8 (duplicate x 4 ) 5 45 189 4 31 131 6 40 139 6 7 7 5 5 5 9 7 6 Recovery Linearity 9 Specificity 文献例 • Heparin Induces Differntiation of CD1a+ Dendritic Cells from Monocytes:Phenotypic and Functional Characterization Chang-Qing Xia and Kuo-Jang Kao J Immunology 2002; 168:1131-1138 • Human NKT Cells Mediate Antitumor Cytotoxicity Directly by Recognizing.Target Cell CD1d with Bound Ligand or Indirectly by Producing IL-2 to Active NK Cells Leonid S. Metelitsa, Olga V.Naidenko, Anita Kant, Hong-Wei Wu, Matthew J.Loza,Bice Perussia, Mitchell Kronenberg, and Robert C.Seeger J Immunology 2001; 167:3114-3122 Simultaneous measurement of six cytokines in a single sample of human tears using microparticle-based flow cytometry : allergics vs.non-allergics, E.B.Cook et al, Journal of Immunological Methods, 254, 109-118,2001 • ありがとうございました 10
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