Title 成牛ウイルス性下痢症の疫学および迅速診断に関する研究( 内容と審査の要旨(Summary) ) Author(s) 福田, 昌治 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 甲第372号 Issue Date 2012-09-18 Type 博士論文 Version none URL http://repository.lib.gifu-u.ac.jp/handle/123456789/47998 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏名(本(国)籍) 主指導学位学位福昌田治(埼玉県) 教員名岐阜大学の種類博士(獣医) 記番号獣医博甲第372号日平成24年9月18日学位授与年月教授恒光学位授与の要件学位規則第3条第1項該当研究科及び専攻連合獣医学研究科裕獣医学専攻研究指導を受けた大学岐阜大学学位成牛ウイルス性下痢症の疫学および迅速診断に関する論文題目研究､審査委貞論主査岐阜大学教授鈴木正嗣副査帯広畜産大学教授宮原和郎副査岩手大学教授原澤副査東京農工大学教授水谷副査岐阜大学教授杉山誠副査岐阜大学教授恒光裕副査藤田保健衛生大学教授谷口文の内容の要亮哲孝也喜旨成牛のウイルス性下痢症は高い頻度で集団発生するため,乳用牛の乳l-t減少など,大きな生産性阻苫要因となっている｡原因としてウシコロナウイルス(BCV)の他,ウシA推ロタウイルス(GAR),ウシB辟ロタウイルス(GBR),ウシC膵ロタウイルス(GCR),ウシトロウイルス(BlもⅤ)などが近年報告されているが,臨床現喝では成牛のウイルス性下痢症は BCV病を除いて殆ど知られていないことから,BCV病以外の疫学実態は不明な点が多い｡また,これらウイルスの多くは,増席細胞での増師が困難なため,検査を実施する場合には通甘,標的ウイルス毎のRTせCR法が用いられており∴多くのコストと労力を要する｡そこで, 本研究では,成牛ウイルス性下痢症の発生予防および.捌非法のi;-J;庶化にさJfするため,原因ウイルス毎の疫学的特徴の解析および低コストかつ迅辿な.診断法の聞発を行った｡第一･一声では,成牛下痢綻の疫学的q■即攻を明らかする目的で,全国都道冊j.し家缶保腱仇生所で2004年2月∼2009年6月に尖施した成牛下摘症の刷生鑑定J戎紬こついて,診晰名,発生時期などに関する情裡を収状し,解析した｡18県からj十200件の成牛下輌娠の発生情報が得られた｡診断内.沢は,BCV柄がほぼ半枚(49.5%)であり,その他,GBR舶用.0%,サルモネラ症7･0%,GAR病4.5%,GCR嫡2.5%,BTbV病2.0%,ウシウイルス性下痢ウイルス (BVDV)感埴症1.0%のML'iに認められた｡なお.BVDV感染症の症例放は2作で,いずれも -112- 牛伴内で1戯だけの■ji.L独発生であった｡他に有′昔なウイルスは碓㍊されなかった｡200件における各病帰休の検査実施率(失脚′卜牧)は,BCV88.0%(176作),サルモネラ69･5%(139 件),GAR60.5%(121件),BVDV58.0%(116件),GBR49･0%(98件)･GCR41･5% (83件),BTbV21.5%(43作)であった｡これを基に症例中位の陽性ヰ(検査リミ施件数中の槻性件牧の割合)を求めたところ･,BCV58.0%,サルモネラ10･1%,GAR9･1%,BVDV 2.6%,GBR16.3%,GCR6.0%,BToV9.3%であった｡発生時期では,ウイルス性の下油症サルはIl∼2月の無料g=こ半枚以上を占めた｡臨床症状では,血址がみられたのはBCV帆モネラ症およびBVDV感染症に限られた｡一方,血恍がみられない症例では下痢班の性状から原因を持足するのは凶難であった｡死亡例はBCV病の99件中5件(5･1%)およぴサルモネラ症の1J件中5件(35.7%)で認められた｡また,呼吸器症状はBCV嫡およびBTbV病でみられた｡乳用牛の産乳瑞減少は,診断内訳の上位6疾病でみられた｡以上の成結から, 成牛下痢症に偶適するウイルスとして,BCV.GAR,GBR,GCRおよびBTbVの5抑類が特に重要であり,BCVは成牛下痢症の約半数に関与していることが明らかとなった｡一方で GBR,GCR,およびBrIbVは検査実施率が低い現状であることが確認された｡第二章では,第一草で成牛下痢症の原因ウイルスであることが確認された5種ウイルス (BCV,GAR,GBR,GCRおよびBTbV)の低コストかつ迅速な検査法として,これらの同時検出が可能なワンステップのマルチプレックスKトPCR法の開発を試みた｡GBRはW7迫伝子,BCVおよびBTbVはヌクレオカブシド辿伝子をそれぞれ標的とする既報のRrPCR法のプライマーを使用した｡GARはVP6遺伝子を標的とする既報のRTIPCR法のフォワードプライマーと新たに設計したリバースプライマーを使用し,GCRはVP6遺伝子を排的として新たにプライマーを設計した｡ワンステップの市販RトpCRキットを用いて5稚プライマーペア混合下での反応条件を検討した結果,プライマー献度0.叫M,アニーリング温度52℃,サイクル数35回が,感度および特異性において姑も適した条件と考えられた｡各ウイルスから抽出したRNAを階段希釈して既報のRトPCR法と検出限界を比較した結果,GARとGCRではマルチプレックスRrpCR法がより高感度であった｡対象5椰ウイルス以外のウシRNAウイルス10帥および対象5帥ウイルス陰性成牛償便80検体を用いた相異性の検討において, 本法での非持異反応はみられなかった｡対乍とウイルスのいずれかに起因する下痢25症例の隅性.乾性60検体を用いて本法を尖施した紡果,25症例全てが陽性となり,診断上利用可能と考えられた｡5椰ウイルスを検出した喝合の1検体あたりの.椎葉コストは,マルチプレックスRトPCR法では従来法と比岐して約5分のlにi恥入･はれ,必要な輪作の肱 PCR反応時閃も5分の1に低減された｡これらの成約から,今回開発したマルチプレックスⅣトPCR法は感度および竹光性において問題は認められず,成牛ウイルス性下痢症の低コストで迅速な診断法として有効であると考えられた｡第三･t;†では∴紆二草で削発したマルチプレックスⅣトPCR法を理外症例に応用した｡まず, GBR,GCRおよびBTbVにI･lリして未検鷹である成牛下嫡症15症例の･唯班を使用した｡その結果,症例中位のウイルス隅性率は,BCV53.3%,GBR6.7%,GCR6.7%となり,第一章で価認された各ウイルスの槻性率とほぼ一致した｡また,2010年12月以附こう己生した成牛下痢症12症例の病性躍定に本法を応用したところ,BCVが16.7%,GCRが25.0%の症例で検出された｡以上の成拭から,成牛下病症の帰因ウイルスとして,BCVの他にGBRやGCRが -113- 軸鮒こ朋与していることが再碓認された｡また,成牛下痢症の病性鑑定にマルチプレックス RTぜCR法を利用することにより,下痢購辿ウイルスの検査を迅速に実施することが可咄になると判断した｡本研究により,成年下痢症におけるBCVなどのウイルス関与のプ雅や原因別の疫学的特徴を明らかにすることができた｡また,ウイルス性下痢症に関与するBCV,GAR,.GBR,GCR およびB恥Ⅴを同時検出可値なマルチプレックスRrPCR法を開発し,その有効性を碓認できた｡これらの成約は成牛のウイルス性下痢症の予防法榊発および診断技術の向上において有益な･ll用1であると考えられた｡審査結果の要旨成牛のウイルス性下痢症は,主に冬季において高頻度で集団発生して乳冊克少などの経済的被害を与えている｡原因としてウシコロナウイルス(BCV)の他に幾つかのウイルスが報告されているが,臨床現場ではBCV病以外は殆ど知られていないことから,原因朋査や原因別の疫学実態は不明な点が多い｡本研究では,成牛ウイルス性下痢症の発生予防および診断法の高度化に汚するため,成牛下痢症の原因別での疫学的特徴の解析ウイルス性下痢症の迅速な鑑別診断法の開発およびその方法による野外応用を実施している｡第一章では,成牛下痢症の原因および疫学的特徴を明らかにする目的で,2004年∼ 2009年に18県の家畜保健衛生所で実施した成牛下痢症の病性鑑定成績計200件の情報を収集して解析した｡症例単位の陽性率(検査実施件数中の陽性件数の割合)は,BCV 58.0%,ウシB群ロタウイルス(GBR)16.3%,サルモネラ10.1%,ウシトロウイルス (BTbV)9,3%,ウシA群ロタウイルス(GAR)9.1%,ウシC群ロタウイルス(GCR) 6.0%,ウシウイルス性下痢ウイルス2.6%であった｡また,これらの疫学的特徴を病原別に明らかにし,成牛のウイルス性下痢症の鑑別検査としてBCV,GAR,GBR,GCRおよびBToVの5種ウイルスが特に重要であることを示した｡第二葦では,第一章で成牛下痢症の原因ウイルスであることが確認された5稚ウイルス (BCV,GAR,GBR,GCRおよびBToV)の低コストで迅速な検査法として,これらの同時検出が可能なワンネテップのマルチプレックスRTIPCR法を開発した｡GARとGCRではマルチプレックスRTPCR法が既報の個別RIPCR法より高感度であった｡また,対象5 椰ウイルス以外のウシRNAウイルス10現ウイルス陰性糞便80検体を用いた特異性の検討において,非特異反応は全くみられなかった｡さらに,対象ウイルスのいずれかに起因する下痢25症例の防性糞便60検体を用いて本法を実施した結果,25症例全てで陽性となった｡これらの結果から,今回開発したマルチプレックスRrPCR法は,成牛ウイルス性下痢症の低コストで迅速な診断法として有効であると考えられた｡第三葦では,第二草で捌発したマルチプレックスRTLPCR法を野外症例に応用した｡最初に,GBR,GCRおよびBToVに関して未検査である成牛下痢症15症例の糞便を使用した｡その結兄,症例単位のウイルス防性率は,BCV53,3%,GBR6.7%,GCR6.7%となり, 第一草で確認された各ウイルスの陽性率とほぼ一致した｡次に,2010年12月以降に発生した成牛下剤症12症例の病性鑑定に本法を応用した結果,BCVが･16.7%,GCRが25.0% の症例で検出された｡以上の結果から,成牛下痢症の原因ウイルスとしてBCVの他にGBR -114- やGCRが頻弊に関与していることを再碓認し,また,成牛下痢症の病性鑑定にマルチプレックスRrPCR法を用いることにより下痢閲辿ウイルスの迅速検査が可能になると判断した｡以上成牛下痢症におけるBCVなどのウイルスの闘与実憶や原因別の疫学的特徴を明らかにするとともに,下痢関連5椰ウイルスを同時検出可値なマルチプレックスRrPCR法を開発し,その有効性を碓認した｡本研究で得られた知見は,成牛のウイルス性下痢症の発生予防および診断技術の向上において非常に有益な情報であると考えられた｡以上について,塞査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院辿合獣医学研究科の学位論文として十分イ阿倍があると認めた｡基礎となる学術論文目:Developmentandapplicationofone-StePmultiplexreversetranscriptionPCR 1)題 forsimultaneousdetectionof丘vediarrhealviruSeSinadultcattle 著者名:Fukuda,M.,Kuga,K.,Miyazaki,A.,Suzuki,T.,Tasei,K,Aita,T･,Mase,M･, Sugiyama,M･andTsunemitsu,H･学術雑誌名:ArchivesofⅥrology 巻･号･頁･発行年:157(6):1063-1069,2012 既発表学術論文目:GeneticanalysisoftheSlgeneof4/91typeinftctiousbronchitisviruSisolated 1)題 inJapan 著者名:Shimazaki,Y.,Watanabe,Y.,Harada,M.,Seki,Y･,Kuroda,Y･,Fukuda,M･, Honda,E.,Suzuki,S.andNakamura,S. 学術雑誌名:TheJournalofVbterinaryMedicalScience 巻･号･貫･発行年:71(5):583-588,2009 目:豚サーコウイルス2型および豚繁殖･呼吸障害症候群ウイルスに感染した肥育豚からのCT)ダ10乎OridiumparvumpiggenotypeⅢと 2)題著者 Cりダわ乎Orf血潜血ぶの検出名:油井武,芝原友宮河本麻理子,山品悟郎,吉田輝美,福田昌治,渡辺喜正,久保正接学術雑誌名:日本獣医師会雑誌巻･号･頁･発行年:63(1):6ト68,2010 目:Prevalenceofantibodiesagainsttransmissiblegastroenteritis 3)題 viruSandporcineresplratOryCOrOnaViruSamOngPlgSinsixreg10nSinJapa 著者名:Miyazaki,A.,Fukuda,M･,Kuga,K,Takagi,M･andTsunemitsu,H･学術雑誌名:TheJournalofVbterinaryMedicalScience 巻･号･頁･発行年:72(7):943-946,2010 目:形憶的観察,PCR法及びLC/MS分析による育成牛シキミ中毒の診断 4)越著者名:河津理子,福田昌治,土門尚ハ,茂木学術雑誌名:日本獣医師会雑誌巻･号･貫･発行年:64(10):79ト796,2011 -115- 守,門田裕一