食の安全と安心フォーラムシリーズ第10回ノロウイルスの最新研究とその防御対策 2015/2/25 ノロウイルス感染における臨床症状、潜伏期間及び発症率(食中毒事例) 食の安全と安心フォーラムシリーズ第10回ノロウイルスの最新研究とその防御対策ノロウイルスに関する最新知見日時：平成27年2月7日（土）場所：東京大学農学部キャンパス弥生講堂一条ホール主催：NPO食の安全と安心を科学する会(SFSS) 国立医薬品食品衛生研究所野田衛出典食品安全委員会ホームページ(「食品中のノロウイルス」リスクプロファイル）小児の感染性胃腸炎とノロウイルス集団発生の月別報告数発生状況 (2002/03～2010/11シーズンの平均) 不明ヒト‐ヒト伝搬(疑いを含む) 食品媒介(疑いを含む) 感染性胃腸炎 •乳幼児、小児の子供が中心 •冬季を中心に一年中発生 •無症状感染者もいるノロウイルス感染者（数百万人) 定点当たり患者数事件数（平均） ■ ■ ■ ― ノロウイルス感染症の発生状況発生動向調査等に基づく小児のノロウイルスによる感染性胃腸炎推定患者数（135万人) 飲食店ノロウイルス食中毒患者数(約1万人) その他旅館販売店仕出屋事業場出典感染性胃腸炎患者数は、発生動向調査を基に集計。集団発生報告数は集団発生病原体票のデータ(山下和予博士提供)を集計食中毒事件の病因物質別の発生割合事件数学校製造所家庭病院ノロウイルスの感染経路患者数 2012年 24% 2003年～ 2012年の平均 49% 出典:厚生労働省食中毒統計を基に集計野田衛 1 食の安全と安心フォーラムシリーズ第10回ノロウイルスの最新研究とその防御対策 2015/2/25 市販カキの月別ノロウイルス汚染状況今日の内容陽性率 600 500 60 陽 50 性 40 率平 400 均 300 値 200 （ 30 ％ 20 ）加熱調理用 • ノロウイルスの生き残り戦略と二枚貝 • 食中毒の原因究明等における新技術 • ヒトノロウイルスが培養できた？？定量値の平均 10 100 0 0 12月前 12月後 1月前 1月後 2月前生食用 60 2月前 12月前 12月後 1月前 1月後 2月前（平 400 均 300 値 200 30 ） 10 100 0 0 12月前 12月後 1月前 1月後 GI 2月前 GII 野田ら 2003年（2002/03年採取検体）ノロウイルスの生き残り戦略（東京都、平成7年～平成10年) • 点変異 • 遺伝子組み換えホッキ貝アカ貝ムール貝ナミ貝カキホタテタイラ貝シジミ 20 18 16 14 12 10 8 6 ％ 4 2 0 1月後 600 500 陽 50 性 40 率％ 20 市販流通二枚貝からのノロウルス検出状況 12月前 12月後 1月前ノロウイルスは二枚貝に共通したリスク十分に加熱すれば、安全性に問題はない東京都健康安全研究センターノロウイルスの分類ノロウイルス科 • 冬期に流行：小児の散発性感染性胃腸炎、高齢者施設等での集団感染、食中毒の主要原因 • 直径35‐40nmの金平糖状（エンベロープなし） • 遺伝子：約7,600bのプラス鎖1本差RNA カリシウイルス科属ノロウイルス属種ノーウォークウイルス遺伝子群 GⅠ ヒト遺伝子型 GⅠ/1～GⅠ/14 サポベシラゴネボ 1属1種 GⅡ ヒト GⅣ ヒト GⅡ/1～GⅡ/19 GⅢ ウシ GⅤ マウス (国立感染症研究所HP) 流行の主流はGⅡ ORF1 VPg 野田衛 NTPase VPg Protease Polymerase ORF2 ORF3 polyA Capsid (VP1) Capsid (VP2) 変異型(GⅡ/4) 変異株、亜型等たくさんの種類がいる変異しやすい GⅡ/4 2006b 2006/07シーズンに大流行 GⅡ/4 2012 2012/13シーズンに大流行 2 食の安全と安心フォーラムシリーズ第10回ノロウイルスの最新研究とその防御対策 2015/2/25 ノロウイルス食中事件の発生状況流行期別のノロウイルス遺伝子型 35000 600 30852 513 30000 500 438 25000 399 400 365 318 300 286 262 279 15835 10809 10781 11055 254 11033 10885 8086 100 20000 293 274 13436 200 19771 15000 事件数患者数 9750 10000 5000 0 0 大流行した2006/07、2012/13シーズンはGII/4変異株が出現 2006/07、2012/13シーズンはNoVが大流行 13 出典:厚生労働省食中毒統計を基に集計国立感染症研究所病原微生物検出情報のデータを基に集計（2014年8月19日現在) ノロウイルス遺伝子型GII/4に対する抗体保有状況 (愛知県、2006年) ノロウイルスの構造構造蛋白質(カプシド) 遺伝子(RNA) ノロウイルスの電子顕微鏡像 (広島市衛生研究所提供) 3～5歳以上の年齢層では、約50～90%が抗体を保有 (感染の既往がある) ノロウイルスの模式図直径：35～40nm(nm:10億分の1m) Kobayashi S, et al:MI, 53, 356‐359(2009) ノロウイルスの生き残り戦略 • 点変異 • 遺伝子組み換え形を変え、免疫から逃避し、感染しやすくなる野田衛 3 食の安全と安心フォーラムシリーズ第10回ノロウイルスの最新研究とその防御対策 2015/2/25 ノロウイルス(類似ウイルス)の増え方 1 侵入 6 放出 (Entry) (Release) ノロウイルス宿主細胞（人の腸管上皮細胞） 5 成熟 (Maturation) ORF1 VPg NTPase 4 RNA複製 (RNA replication) VPg Protease Polymerase 2 脱殻 (Uncoating) Capsid (VP2) ORF2,3 ORF1 核 ORF2,3 ORF1 ORF2,3 19 後期 Capsid (VP1) ORF2,3 ORF1 初期 ORF3 polyA sub-genomic RNA ORF1 3 翻訳 (Translation) ORF2 ノロウイルスの生活環 ORF2,3 ORF1 ORF2,3 ORF1 ORF2,3 ORF2,3 組織血液型(HGBA)抗原糖鎖合成経路ノロウイルスは腸管上皮細胞に発現する組織血液型(HBGA)抗原に結合する。分泌型のB型非分泌型分泌型のA型、O型ノーウォーク/68 ウイルスの場合組織血液型(HBGA)抗原 A型、B型、O型（H型）ルイスa、ルイスｂなど（LeX抗原) 白土東子他、ウイルス、 57,181-190(2007) 2型はβ1-4結合（2型糖鎖) （FUT3,4,5,6,9) （FUT1,2) FUT1：赤血球 FUT2：唾液に分泌、腸管細胞等で発現 O型のこと（LeY抗原) 分泌型：腸管上皮細胞、唾液などに ABH抗原が発現する。日本人の約 86％、欧米人の約80％。非分泌型：腸管上皮細胞、唾液などにABH抗原が発現しない。日本人の約14％、欧米人の約20％。野田衛 4 食の安全と安心フォーラムシリーズ第10回ノロウイルスの最新研究とその防御対策 2015/2/25 ノロウイルスが認識するHBGA抗原遺伝子型株名 H1/H2 A B Le-a Le-b Le-X GI/1 NV68 + + - - + - + GI/2 C59 + + - + - nd nd GI/10 Boxer - - - - + - + カキ消化管における組織血液型抗原の存在 NVのカキ中腸腺への特異的結合 Le-y GII/1 Hawaii - - - - - - - GII/2 BUDS SMV - + - + + - - nd nd GII/3 PiV Mexco - + + + + - + + - - GII/4 VA387 Grimsby 104 + + + + + + + + + - + + + nd nd + nd nd GII/5 MOH - + + - - - - GII/7 VA207 + - - + - + + GII/14 OIF - - - + - - - 1. 2. 3. Norwalk virus-specific binding to oyster digestive tissues (Guyader et al, 2006) Norovirus binds to blood group A-like antigens in oyster gastrointestinal cells (Tian et al, 2006) Norovirus recognizes histo-blood group antigens on gastrointestinal cells of clams, mussels, and oysters: a possible mechanism of bioaccumulation (Tian et al, 2007) 供試VLP 種類発現 HBGA カキ A,H1 ハマグリ、アサリ (Clam) A ムラサキイガイ (Mussel) A GII/4 (rVA387) GI/1 (rNV) GII/5 (rMOH) GII/7 (rVA207) + - + + + - + + + 文献3より白土東子他、ウイルス、57,181-190(2007)、一部改変ノロウイルスとネコカリシウイルスを用いた浄化実験インフルエンザウイルスとノロウイルスの生き残り戦略ヒト-ヒト感染の継続による抗原変異遺伝子再集合による新型出現同時感染による遺伝子組み換えノロウイルスネコカリシウイルス植木洋らＡＥＭ，73,5698-5701,2007 今日の内容 • ノロウイルスの生き残り戦略と二枚貝 • 食中毒の原因究明等における新技術 • ヒトノロウイルスが培養できた？？原因食品や汚染経路を究明 ↓ 食品の汚染防止対策を講じる ↓ 食中毒の予防法が確立し、患者が減少厚生労働省HPより野田衛 5 食の安全と安心フォーラムシリーズ第10回ノロウイルスの最新研究とその防御対策原因食品別ノロウイルス食中毒事件数 2015/2/25 食品へのノロウイルスの汚染経路（過去の事例） 2002/03～2010/11シーズンカキ以外の貝類（シジミ、アサリ、ハマ刺身グリ、ホタテなど) 0% 1% 寿司 4% カキ 11% サラダ 1% 餅、菓子（おはぎ、ケーキなど） 1% パン、サンドイッチ 0% その他・不明・記載無 41% 水（井戸水、地下水など） 0% 食事特定 41% 原因食品不明事例が82% 多彩な食品汚染経路がある IASR32(2011) （食中毒統計を集計 2011年11月1日現在) 原因食品や汚染経路を究明 ↓ 食品の汚染防止対策を講じる ↓ 食中毒の予防法が確立し、患者が減少課題 • 食品からウイルスを見つけることが困難 • 見つけたウイルスは原因？ • 見つけたウイルスは生きている？課題 • 食品からウイルスを見つけることが困難 • 見つけたウイルスは原因？ • 見つけたウイルスは生きている？どんな食品からもウイルスを検出する技術の開発パンソルビン・トラップ法（パントラ法）の特徴課題 • • • • 野田衛食品に依存せず、同一手技で検査可能多検体処理が可能低速遠心機があれば検査可能必要な試薬パンソルビン(市販、自家調整) 抗血清またはガンマグロブリン(市販研究用) • 食品からウイルスを見つけることが困難 • 見つけたウイルスは原因？ • 見つけたウイルスは生きている？同じウイルスを見つける技術 6 食の安全と安心フォーラムシリーズ第10回ノロウイルスの最新研究とその防御対策 2015/2/25 カキ事例で検出遺伝子型が多様になる理由 A カキダイレクトシーケンスによる塩基配列解析 B 複数の遺伝子型が含まれている場合は配列を決定することが困難な場合があるウイルスの核酸RNAを精製中腸腺の取り出し，ウイルス濃縮・ウイルス精製逆転写反応 nested PCR 検体中の遺伝子の陽性判定リアル・タイムPCR 検体中の遺伝子コピー数の判定食中毒事例等ではPCR産物をシーケンス解析・ダイレクトシーケンス・クローニング後にシーケンスたくさん含まれる型結合しやすい型免疫がない型 ↑が示すように複数のクローンが存在している可能性が高い次世代シーケンサーを用いたNoV遺伝子検出検査の流れ課題 • 食品からウイルスを見つけることが困難 • 見つけたウイルスは原因？ • 見つけたウイルスは生きている？感染性ウイルスを検出する技術中腸腺の取り出し，ウイルス濃縮・ウイルス精製ウイルスの核酸RNAを精製逆転写反応 nested PCR リアル・タイムPCR 検体中の遺伝子の陽性判定検体中の遺伝子コピー数の判定 PCR産物をクローニングすることなく網羅的にシーケンス微生物の培養感染性推定遺伝子検査法の開発鑑別方法鑑別対照細菌人工培地 RNase 培養細胞ウイルス蛋白の変性・破壊インフルエンザウイルスプロテインＧカラム処理パンソルビン処理抗体の被覆の有無 RNase処理加熱、乾燥、消毒剤広島市安佐動物公園HPより遺伝子の損傷・切断紫外線、太陽光 Oligo(d)Tによる逆転写約2,500b ‐AAAAAAAA ノロウイルス人とチンパンジーのみ野田衛 33% TTTTTTT 7 食の安全と安心フォーラムシリーズ第10回ノロウイルスの最新研究とその防御対策今日の内容 2015/2/25 DOI: 10.1126/science.1257147 Science 346, 755 (2014) 7 NOVEMBER 2014 ・ VOL 346 ISSUE 6210 755 • ノロウイルスの生き残り戦略と二枚貝 • 食中毒の原因究明等における新技術 • ヒトノロウイルスが培養できた？？ http://first.lifesciencedb.jp/archives/9498 HuNoVの増殖に関する知見ノロウイルス BJAB細胞で検索謝辞下記の研究班等の研究分担者、研究協力者の先生に深謝します。 • ヒトのノロウイルスはB細胞に由来する培養細胞に感染する • 腸内細菌はノロウイルスの感染を促進する厚生労働科学研究費補助金食品の安全性確保推進研究事業平成22～24年度「食品中の病原ウイルスのリスク管理に関する研究」班平成25～26年度「食品中の病原ウイルスの検出法に関する研究」班内閣府食品安全委員会食品健康影響評価技術研究平成24～25年度「食品のウイルス汚染のリスク評価のための遺伝子検査法の開発と応用に関する研究」班 Norovirus Surveillance Group of Japan 佐々木貴正先生、春名美香先生（農林水産省消費安全局）広島市衛生研究所・生物科学部ウイルス担当野田衛 8