マウスES細胞培養過程におけるメタボロミクス 1) 細胞培養では，細胞の成長を観察しながら，適切な頻度で培地を交換することを要求されるが，研究者の経験則や単に培地のpH変化を指標にすることも多い。そこで，ヒトの血液や尿中の212成分の代謝物を一斉に測定できるガスクロマトグラフ質量分析計(GC-MS)によるメタボローム解析手法2) を応用し，培地中の成分を網羅的に測定し，変動を観察した。培養マウスES細胞（ST1株）培養液分取培養後拍動確認（心筋に分化）パターン2 細胞分化付近まで増加し，その後濃度変化が認められなかった成分一例パターン3 肝組織構築付近まで増加し、その後減少した成分パターン4 細胞分化付近まで減少し，その後濃度変化がなかった成分一例パターン5 細胞分化付近で急激に増加した成分パターン6 細胞培養中に濃度変化が認められなかった成分一例 50 μL 各n=3 ← IS 0.1mg/mL 2-イソプロピルリンゴ酸溶液 6 μL添加肝組織構築凍結乾燥培地組成 Iscove s Modiﬁed Dulbecco s Medium（IMDM）＋15% Fetal Bovine Serum ＋Non-Essential Amino Acids（終濃度：1 μM）＋Sodium Pyruvate（終濃度：10 μM）＋2-Mercaptoethanol（終濃度：7 nL/mL）約16時間 ← 20mg/mL メトキシアミンのピリジン溶液 40 μL添加胚様体 PBS 細胞の成長と共に増加した成分一例攪拌 Dishに播種し分化誘導 Mineral Oil パターン1 ← 水添加，10倍希釈ハンギングドロップ法にて胚様体を形成培地解析結果分析方法各成分の特異的な定量イオンのピーク面積を，ISのピーク面積でノーマライズした。培地試料中から34成分が検出された。濃度変化を6パターンに分類できた。なお，灰色のグラフは，再現性がなかった成分である。メトオキシム化環鎖互変異性をもつグルコースなど糖類のアルデヒド基をメトオキシム化し，環状の糖類を鎖状にすることで感度向上 30℃ 90分間振とう ← MSTFA 20 μL添加 TMS誘導体化水酸基，カルボキシル基，アミノ基などプロトン性の反応基をトリメチルシリル化することで揮発性向上マウスES細胞培養5日目（心筋に分化）遠心分離 16,000rpm 10分間上清採取 50 µL GC-MS分析回収した胚様体 37℃ 30分間振とう 1 µL注入培養18日目（肝組織構築）新鮮培地，培養開始3∼19日目まで2日毎に交換した培地を採取し，測定まで凍結保存した。分析結果 GC-MS分析で，沸点及び極性の差により，アミノ酸，有機酸，糖，脂肪酸，糖アルコール，核酸，リン酸エステル類などのメトオキシム化及びTMS誘導体化物が分離・検出された。 Pyruvic acidMO-TMS↓ Alanine-2 TMS ↑ Phosphoric acid-3TMS ↓ Glycerol-3 TMS ↑ IS Glutamine-3T MS ↓ Aspartic acid-3TMS ↓ Serine-3 TMS ↓ Citric acid-4TMS ↑ 新鮮培地培養7日目培養19日目 Fig. 培地試料のGC-MS分析結果 TIC パターン1∼5の成分については，細胞の成長過程と相関のある濃度変化が認められた。培養過程に伴う代謝産物，培地成分及びそれら分解物の濃度変化を把握することは，最適な培地交換の定量的指標となり得ると考えられる。 1) 第13回日本再生医療学会総会一般演題にて発表発表者㈱島津テクノリサーチ藤原賢，松原英理子，石部恵子，辻野一茂，南出善幸，工藤忍，東京工業大学玉井美保，田川陽一 2)【引用文献】Nishiumi S, Shinohara M, Ikeda A, et al. Serum metabolomics as a novel diagnostic approach for pancreatic cancer. Metabolomics (2010) 6, 518-528