Title Studies on the Roles of the Phosphatidy1-inositol-3 Kinase/Akt/Mammalian Target of Rapamycin(PI3K/Akt/mTOR)Pathway in Newly Derived Canine Hemangiosarcoma Cell Lines and Spontaneous Canine Hemangiosarcomas( 内容と審査の要旨(Summary) ) Author(s) 村井, 厚子 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 甲第378号 Issue Date 2013-03-13 Type 博士論文 Version none URL http://repository.lib.gifu-u.ac.jp/handle/123456789/48004 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。村氏名(本(国)籍) 主指導教員名井厚子(愛知県) 学位の種類博士(獣医) 学位記番号獣医博甲第378号日平成25年3月13日学位授与年月柳教授岐阜大学井学位授与の要件学位規則第3条第1項該当研究科及び専攻連合獣医学研究科徳磨 the Phosphatidyl-inosito卜3 獣医学専攻岐阜大学研究指導を受けた大学学位論文題目 Studies the on Roles of Target Kinase/Akt/Mammalian (PI3K/Akt/mTOR)Pathwayin Hemangiosarcoma of Rapamycin Newly Derived CellLines Canine Spontaneous and Canine HemanglOSarCOmaS (新規樹立犬血管肉腫細胞株と自然発生犬血管肉腫におけるphosphatidyl-inositol-3kinase/Akt/tnammalian target of rapamycin(PI3K/Akt/mTOR)経路の役割に関する研究) 審査委員論主査岐阜大学教授丸尾幸副査帯広畜産大学教授首林与志安副査岩手大学教授御領政副査東京農工大学教授渋谷副査岐阜大学教授桝井文の内容の要嗣信淳徳磨旨犬血管肉腫(HSA)は血管内皮細胞(EC)由来の悪性腫瘍で,侵襲性が高く,容易に転移する｡その治療法は有効な方法が確立されていないことから,本研究ではHSAのシグナル伝達分子をターゲットとした新たな治療法の開発を目的とした｡まず,HSA細胞株を樹立し性状解析を行い,次いで,この細胞株における phosphatidyl-inositol-3 kinase/Akt/mmmaliant訂getOfrapamyCin(PI3K/Akt/mTOR)経路の細胞増殖への関与を調べた｡さらに,犬の自然発生血管系腫瘍におけるAk〟mTOR/eukaryotic tranSlationinitiation fhctor4E(eIF4E)-bindingproteinl(4E-BPl)経路の活性について検討した｡第一章では,既に樹立された肝臓,右心房および牌臓由来のHSA異種移植腫瘍株から, 7株の形態学的に異なるHSA細胞株を樹立し,これら全細胞株が犬ECの性質を有することを確認した｡次いで,ECに対する増殖因子,あるいは血清の細胞増殖に対する効果を -135- WSTしl法で検討したところ,1株で増殖因子あるいは血清下で,増殖促進が認められ,3 株では血清下のみで増殖促進が,残る3株では増殖因子あるいは血清下のいずれでも増殖促進効果は認められなかった｡そこで,血清刺激によるMAPK/Erk経路とPI3K/Akt/mTOR 経路の活性化についてウエスタンプロット法で検索したところ,血清刺激により増殖促進が認められた3株を含む4株で,P44/42ErkThr202/Tyr204のリン酸化が増加したことから, 血清刺激による増殖促進にはMAPK/Erk経路が関与している可能性が示唆された｡一方, AktSer473,mTORcomplexl(mTORCl)Ser2448とその下流の4E-BPlは,6株で血清刺激に反応せず,恒常的なリン酸化を示したことから,HSA細胞株ではmTORC2/Akt/4E-BPl経路が恒常的に活性化していることが示唆された｡第二章では,PI3K/Akt/mTOR経路の治療ターゲットとしての有用性を検討するために, 同経路に対する分子標的阻害剤を用いた実験を行った｡すなわち,HSA細胞株に,PI3K 阻害剤のLY294002を加えたところ,全ての細胞株で容量依存性に細胞増殖が抑制され, PI3KJAkthnTOR経路のタンパクのリン酸化も低下した｡一一方,mTORCl阻害剤のrapamyCin を加えると全株でmTORCISer2448のリン酸化が低下したが,細胞増殖は3株のみで抑制された｡これらの細胞株では,4E-BPlのリン酸化が低下しており,そのうち2株ではAktSer473 のリン酸化も低下していた｡R叩amyCinによって増殖が抑制されない株では,4E-BPISer65 のリン酸化には変化はなく,AbSer473のリン酸化は1株で増加しており,その他の株では変化しなかった｡これらのことから,HSA細胞株の細胞増殖は,mTORClに依存しない, mTORC2/AME-BPl経路によって制御されている可能性が示唆された｡第三章では,外科的に切除したHSA37例,犬血管腫(HA)27例,肉芽組織4例,正常 ′皮膚4例について,リン酸化Ab(p-Akt)Thr30$ぉよびSer473,P-mTORCISer2448,P-4E-BPI Thr37〟6,eIF4Eに対する免疫染色を行い,自然発生犬血管系腫瘍におけるAkt/mTOR/4E_BPl 経路の活性を調べた｡その結果,約80%のHSAで,P-AktSer473ぉよびThr308,P-4E-BPI Thr37〟6,eIF4Eの中等度から高度の発現が認められた｡これはHAに比べて有意に高い割合だった｡一方,HSAでは35%のみでp-mTORCISer2448の弱から中等度の発現が認められた｡これらのことから,自然発生HSA ではmTORClとは別に制御された, mTORC2/AktAE-BPl経路が活性化していることが示唆された｡以上,本研究で樹立したHSA細胞株と自然発生のHSAでは,mTORClに依存しない mTORC2/AktAE-BPl経路が活性化しており,治療のターゲットとして有用である可能性が示唆された｡しかし,細胞株と自然発生腫瘍の間にはmTORCISer2448のリン酸化の状態に差異も認められた｡自然発生腫瘍には,腫瘍以外の血球や問質の細胞も含まれており,･この局所環境の存在が違いに関与している可能性が示唆された｡今回の研究は,f乃Vf加と加 Ⅴわ0の実験系の利点および欠点を明確にし,HSAの新規治療を確立するための有用な情報を提供するものと考えられた｡ -136- 審査結果の要旨犬血管肉腫(HSA)は血管内皮細胞(EC)由来の悪性腫瘍で,悪性度が高く,容易に転移するため,その治療法の確立が求められている｡また,HSAではEC増殖因子とその受容体の過剰発現が報告されているが,これらの刺激によるシグナル伝達機構の詳細は明らかでない｡申請者はHSAにおけるシグナル伝達分子をターゲットとした治療法の確立に向け,まず,樹立したHSA細胞株の性状解析を行い,次いで,その細胞株における phosphatidyl-inositol-3kinase/AkthnammaliantargetOfrapamyCin(PI3K/AkthnTOR)経路の細胞増殖への関与を検討,さらに,大の自然発生血管系腫瘍におけるAkt/mTOR/eukaryotic translationinitiationfactor4E(eIF4E)-bindingproteinl(4E-BPl)経路の活性について調べた｡第一章では,既に樹立された肝臓,右心房および牌臓由来のHSA異種移植腫瘍株3株から細胞を分離,培養し,60代以上継代後,7株の形態学的に異なるHSA細胞株を樹立した｡全細胞株に犬ECの性質を確認し,ECに対する増殖因子とその受容体のmRNAの発現は細胞株によって様々であった｡次いで,ECに対する増殖因子,あるいは血清の細胞増殖に対する効果をWSTJl法で検討したところ,1株で増殖因子あるいは血清下での増殖促進, 3株で血清下のみの増殖促進が認められたが,残る3株では増殖因子あるいは血清下のいずれでも増殖促進効果は啓められなかった｡また,血清刺激によるMAPK/Erk経路と PI3E/Ak〟mTOR経路の活性化についてウエスタンプロット法で検索したところ,血清刺激により増殖促進が認められた3株を含む4株で,p44/42ErkTbr20ユ/ヤr204のリン酸化が増加したことから,血清刺激による増殖促進にはMAPKJErk経路が関与している可能性が示唆された｡一方,AktSer473,mTORcomplexl(mTORCl)Ser244$とその下流の4E-BPIThr37/46, Thr70,Ser65は,6株で血清刺激に反応せず,恒常的なリン酸化を示していた｡mTORC2は AktSer473を活性化させるため,HSA細胞株ではmTORC2/Akt/4E-BPl経路が恒常的に活性化している可能性を明らかにした｡第二章では,PI3K/Akt/mTOR経路の治療ターゲットとしての有用性を調べるため,この経路に対する分子標的阻害剤を用いた実験を行った｡HSA細胞株に,PI3K阻害剤である Ⅰ∬294002 を添加したところ,全ての細胞株で容量依存性に細胞増殖が抑制され, PI3K/Akt/mTOR経路におけるタンパクのリン酸化も低下した｡さらに,mTORCl阻害剤の rapamyCinを加えると全株でmTORCISer244$のリン酸化が低下したが,細脾増殖は3株のみで抑制された｡これらの細胞株では,4E-BPIThr37/36,Thr70,Ser65のリン酸化が低下しており,そのうち2株ではAktSer473のリン酸化も低下していた｡Rapamycinによって増殖が抑制されない株では,4E-BPIThr37/46とThr70のリン酸化は低下したが,Ser65のリン酸化には変化はなかった｡以上のことから,HSA細胞株の細胞増殖は,mTORClに依存しない, mTORC2/Ak〟4E-BPl経路によって制御されている可能性を明らかにした｡第三章では,自然発生犬血管系腫瘍におけるAkt/mTOR/4E-BPl経路の活性を調べた｡外科切除されたHSA37例,犬血管腫(HA)27例,肉芽組織4例および正常皮膚4例について,リン勧化Ab(p-Akt)Thr308ぉよびSer473,p-mTORCISer2448,P-4E-BPIThr37/46,eIF4E に対する免疫染色を行ったところ,P-AbSer473ぉよびThr308,p-4E-BPIThr37A6,eIF4Eでは中等度∼高度の発現が約80%の･HSAで,P-mTORCISer2448では軽度から中等度の発現が35%のHSAのみで認められた｡これらの結果から,自然発生HSAでは,mTORClとは別に制御されたmTORC2/Akt/4E-BPl経路が活性化している可能性を明らかにした｡本申請者の研究成果は,わlVf加と加γル0の実験系の利点および欠点を明確にし,HSA の治療への有用な基礎的情報を提供するものと考えられた｡以上について,審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論文として十分価値があると認めた｡ -137- 基礎となる学術論文目:ConstitutivephosphorylationofthemTORC2/Akt/4E-BPIpathwayinnewly 1)題 derivedcaninehemanglOSarCOmaCe111ines 著者名‥Murai,A.,Asa,SA.,Kodama,A.,Hirata,A.,%nai,T.andSakai,H. 学術雑誌名:BMCVeterinaryResearch 巻･号･頁･発行年月:8:128,2012 目‥ImmunohistochemicalanalysisoftheAkt/mTOR′4E-BPIsignallingpathwayin 2)題 CaninehaemanglOmaSandhaemanglOSarCOmaS 著者名‥Murai,A･,Asa,SA.,Kodama,A.,Sakai,H.,Hirata,A.andⅥnai,T. 学術雑誌名‥JotmalofComparativePathology 巻･号･頁･発行年月:147(4):430-440,2012 既発表学術論文目: 1)題 EstablislmentofcaninehemanglOSarCOmaXenOgra負modelsexpresslng endothelialgrowthfactors,theirreceptors,andang10geneSis-aSSOCiated homeoboxgenes 著者名‥Kodama,A･,Sakai,H･,Matsuura,S･,Murakami,M.,Murai,A.,Mori,T.,MaruO, K･,Kimura,T.,Masegi,T.andⅥmai,T. 学術雑誌名:BMCCanCer 巻･号･頁･発行年月:9:363,2009 2)題著目:Glomerular1ipidosisaccompaniedbyrenaltubularoxalosisinwildand 者 laboratory-rearedJapaneserockptmiganS(上agqpusmutusj甲Onicus) 名:Murai,A.,Murakami,M.,Sakai,H.,Shimizu,H.,Murata,K.andⅥmai,T. 学術雑誌名:AvianDiseases 巻･号･貢･発行年月:55(4):709-713,2011 目‥Expressionofplatelet-derivedgrowth血ctoranditsreceptorsinspontaneOus 3)題 CaninehemanglOSarCOmaandcutaneOushemanglOma 著者名:Asa,SA.,Murai,A.,Murakami,M.,Hoshino,Y,Mori,T.,MaruO,K.,Khater,A., El-Sawak,A.,el-Aziz,EA.,Ⅵmai,TlandSakai,H. 学術雑誌名:HistoIogyandHistopathlogy 巻･号･頁･発行年月:27(5):601-607,2012 目‥GH-ProducingmammarytumOrSintwodogswithacromegaly 4)題著者名:Murai,A.,Nishii,N.,Morita,T.andⅦki,M. 学術雑誌名:TheJournalof%terinaryMedicalScience 巻･号･頁･発行年月:74(6):77l-774,2012 目‥OccurrenceofThelaziaCallipaedbandTbxocaracatiinanimportedEuropean 5)題著者 lynx(阜ynxb)nX)inJapan 名-:El-Dakhly,K.,Hadid,SAE.,Shimizu,H.,El-Nahass,ES.,Murai,A.,Sakai,H. andⅥmai,T. 学術雑誌名:JoumalofZooandWildlifeMedicine 巻･号･貫･発行年月:43(3):632-635,2012 ー138- 目:Pathologicalftaturesof叫ノCObacteriumkansasiiinftctioninblackbeardedsakis 6)題 (C肋甲OJe∫∫αJα乃α∫) 著者名:Murai,A.,Murakami,T.,Inoue,M･,Ueda,H･,Shiihara,S･,Kimura,J･,Hirata,A･, Sakai,H.andYanai,T. 学術雑誌名:JournalofComparativePathology 巻･号･頁･発行年月:147(4):566-569,2012 ー139-