一体型ATP測定試薬キットと小型ルミノメーターを用いた農耕地土壌の微生物バイオマスの推定誌名日本土壌肥料學雜誌 = Journal of the science of soil and manure, Japan ISSN 00290610 著者青山, 正和巻/号 82巻4号掲載ページ p. 305-308 発行年月 2011年8月農林水産省農林水産技術会議事務局筑波事務所 Tsukuba Office, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat 305 炭素量との関係を検討し，ノート ATP量から徴生物バイオマス炭素最への換算係数を求める必要がある. そこで本研究では， ATP量から徴生物バイオマス炭素一体型 ATP測定試薬キットと小型ルミノメー最へ換算するための係数を決定することを目的として，ターを用いた農耕地土壌の微生物ノ〈イオマスの壌タイプならびに土地利用(水田，畑，果樹園)の具なる推定* 114点の農耕地土壌を採取し，クロロホルムくん蒸一抽出法で土壌微生物バイオマス炭素最を測定するとともに一体型試薬キットと小型ノレミノメーターを用いて土壌の青山正和 ATPを測定し，両者の関係を検討した. 2 . 材料と方法キーワード ATP ，微生物バイオマス，ノレミノメーター，畑土壌，水国土壌 1)土壌試料 14点の土壌試料を採取し，実験青森県内の農耕地から 1 に供した.内訳は，非黒ボク土畑土壌 47点(水田転換畑土壌 5点およびリンゴ閤土壌 3点を含む)，非黒ボク土水田土壌 24点，黒ボク土畑土壌 35点および黒ボク土水田土壌 8点である.非黒ボク土は主にグライ土，灰色低地土， 1.はじめに近年，土壌診断のための土壌分析は，農業生産現場に近掲色低地土に分類される沖積土壌であり，畑土壌の一部はい施設でも行われており，土壌改良に役立っている. しか掲色森林土を含んでいる.また，黒ボク土は岩木山起源のし土壌診断の項目は化学性に関するものが主であり，土黒ボク土ならびに十和田・八Ej3田起源の黒ボク土からなる. 壌生物性の診断はほとんど行われていない.土壌生物性を 007年と 2008年の 7月から 1 1月までの期間に畑土壌は 2 評価する場合，最初に必要となる情報は土壌徴生物量であ 008年と 2009年の 1 0 表層 10cmを採取し水田土壌は 2 る.土壌徴生物量は，一般に徴生物バイオマスとして評価月から 1 1月までの期間に落水後の作土層から採取した. され，主にクロロホルムくん蒸法，基質誘導呼吸法やアデ採取した土壌は，湿潤状態のまま 2mmのふるいを通してノシン 5 ' 一三リン酸 (ATP) 法が用いられている. しか実験に用いた.土壌の一部は，ふるいを通した後に風乾し，しながら，これらの徴生物バイオマス部定法は研究のため化学分析に用いた. に開発されたものであり，農協や普及センタ一等の農業生産現場に近い施設で行うことは困難である.前報(青山， 2 ) 化学分析風乾土について， pH( H z O ) ならびに全炭素量と全窒 2 0 0 5 ) において，著者は食品関連施設等における清浄度 . 5水懸褐液素量を測定した. pH(HzO) は常法通り 1:2 検査の目的で比較的安価で市販されている ATP測定用の一体型試薬キットと専用の小型/レミノメーターを用いてについてガラス電極法で測定し，全炭素量と全窒素量は NC-アナライザー(住友化学 SumigraphNC-90A) で分黒ボク土の ATP測定を行い析した. ATP出定値とクロロホルムくん蒸一抽出法による微生物バイオマス炭素量との関係を調べたところ，両者の間には高い正の相関関係が存在することを報告した.ただしこの結果は黒ボク土，しか 3 ) 前培養各土壌の乾土 60g相にとり，の湿潤土を 200mLビーカー 25Cで 7日間前培養した後，クロロホルムくん 0 も地域的にはかなり限定された土壌について得られたもの蒸一抽出法による微生物バイオマス炭素の測定ならびにであり，水田土壌を対象としていなかった. したがって， ATPの測定に供した.前培養は各土壌について 3反復で ATP測定用の一体型試薬キットと小型/レミノメーターを行い，反復ごとにバイオマス炭素と ATPを l連で測定し用いた農耕地土壌の徴生物ノくイオマス推定法を確立するたた.なお，前培養に際して，前報(青山， 2 0 0 5 ) では最大めには，多くの土壌について ATP量と微生物バイオマス容水量の 60%水分に調節したが，本研究で、は簡便化のため，土壌水分の調節は行わなかった. 4 ) 微生物バイオマス炭素量の測定 MasakazuAOYAMA:E s t i m a t i o no fm i c r o b i a lb i o m a s si na r a b l e s o i l su s i n gana l li noneATPa s s a yk i tandah a n d yl u m i n o m e t e r ネ本研究の主要部分は，平成 2 0年度科学技術振興機構重点地域研究開発推進プログラム・シーズ発掘試験「低コストで簡便迅速な土壌微生物診断法の開発j の一部として実施した.また，本研究の一部は 2 0 0 9年 9月の日本土壌肥料学会京都大会で発表した. 0 3 6 8 5 6 1 弘前市文京町 3 ) 弘前大学農学生命科学部 ( C o r r ε s p o n d i n gAuthor:青山正和 2 0 1 1年 2月四日受付・ 2 0 1 1年 5月 2 4臼受理 2巻第 4号 p .305~308 ( 2 0 1 1 ) 日本土壌肥料学雑誌第 8 0 0 5 ) と同じく， Vancee ta l .( 19 8 7 )の前報(青山， 2 クロロホルムくん蒸一抽出法に基づ、いて行った. 5 ) ATPの抽出土壌からの ATP抽出には，広く使われているトリクロロ酢酸 (TCA) ーリン酸ーパラコートの混液を用いる nkinsonandOades ，1 9 7 9 ) では毒性が強く取り方法(Je 0 0 5 ) と同じ扱いが難しいと考えたため，前報(青山， 2 く，ジメチルスルフォキシド (DMSO) とリン酸三ナトリウムによる抽出法 ( B a ie ta l .，1 9 8 8 ) を用いた.前培養日本土壌肥料学雑誌第 8 2巻第 4号 306 ( 2 0 1 1 ) した乾土1.0 0g相当量の湿潤土を 100mLビーカーに秤取 3. 結果と考察 10mLの DMSOを加えてスターラーで 2分間撹狩し .OlMリン酸三ナトリウム、溶液を加えてた後， 40mLの O 2分間撹持した.さらに超音波パス(アズワン US-1，出力5 5W) 中で 2分間鵡音波処理を行った後，あらかじめ 0.005MMg-EDTAを含む O .OlM グリシン溶液 ( p H 7 . 5 ) 10mLを入れた試験管に懸掲液 1mLをただちに加えて十分に混合し，希釈懸濁液を調製した.以下の ATP測定に供試土壌の pH (HzO )は3 . 9 7 . 1の範閤にあり，土壌し，有機物含量の指標となる全炭素量も 4 . 2 8 8 . 8 gk g -1の範囲にあった.非黒ボク土の畑地と水田ならびに黒ボクの畑地と水自に分けて頻度分布をみた場合にも，それぞれ広い範囲をカバーしていた(表 1).なお， pH ( 狂20) の土壌別の平均値±標準偏援は，非黒ボク土・畑地で 5 . 5 4 く，拭き取り試験用の一体型試薬キットであるキッコーマ 0 . 2 7，黒ボク土・畑地で 5 . 6 9土 0 . 5 1，黒ボク土・水田で 5 . 5 8とこ0 . 2 9であり， 5 . 6土 l 1 .9 gkg-1，全炭素量のそれは，非黒ボク土・畑地で 2 非黒ボク土・水田で 2 9 . 7ごと 6 . 1 gk g l，黒ボク土・畑地で 1 4 9 . 6: ! :1 8 . 6 gk g -，黒ポク土・水田で 6 0 . 8: ! :1 7. 4 gk g -1 ン社製ノレシパックワイドと専用の小型ノレミノメーター(東であった. はこの希釈懸濁液を用いた. 6 ) ATPの測定 0 0 5 ) と同じ上記の希釈懸濁液について，前報(青山， 2 軍 DKKAF-20) を用いて ATPを測定した.測定に際し : ! :0 . 7 8，非黒ボクゴ二・水田で 5 . 1 7とごこれらの土壌について，一体型試薬キットと小型/レミノて，ルシパックワイド本体から綿棒ホルダーを引き抜いたメーターを用いて ATP最を測定し，後，抽出試薬のーとの隔膜上に希釈懸濁液 100μLを注入し法で測定した徴生物バイオマス炭素量との関係を検討したた.つぎに，綿棒ホルダーを本体に蔑して強く押し込み，ところ，荷者の間には正の相関関係が認められた.ただクロロホノレムくん蒸 2枚の隔膜を破って測定チューブまで挿入した.その直後し畑土壌と水田土壌とでは傾向が大きく異なっており，に，本体を数回強く降りおろし測定チューブ内で土壌懸水自転換畑土壌は水田土壌と同じ傾向にあった.水田転換濁液，抽出液および発光試薬を十分に混合した後，小型ノレ畑土壌を株いた畑土壌について ATP量 ( X ) と徴生物ノ〈ミノメーターに装着しスタートボタンを押して相対発光イオマス炭素量 ( Y ) との関係を原点を通る一次回帰式に ( R e l a t i v eL i g h tU n i t;RLU) を測定した. RLUは， I 司一試料について連続して 5 1 0回測定し，最大値を記録した.それとは別に，上述の希釈懸渇液 1mLに対して ATP 標準溶液(10 0pg~tVl) 1 0 0μLを加えた液を調製しこの1 1 0uLに対して上記と同様に RLUを測定した.さらに，ブランクとして抽出試薬のみの RLUの測定を行った. ATP量は，下記の式により算出した. 当てはめると(鴎 1 A )，Y=117Xという関係式が得られた ( r = = 0 . 8 6料*).なお，この中にはりンゴ圏土壌も合まれている.これに対して，水田土壌と水田転換畑土壌の場合には(密1B)，非黒ボク土，黒ボク土を問わず， Y = = 2 0 2 X という関係式が得られた ( r = 0 . 6 7料*)• これらの関係式における傾きは，徴生物バイオマス炭素と ATPの比(バイオマス炭素 /ATP比)に相当するが，この数値に土壌の化学性が影響しているかどうかを検討す C= ( N B ) / ( M N )X 1 0 -3 るため， μ g )， Bはブラン Cは希釈抽出液 100μL中の ATP量 ( ， U Nは ATP標準液無添加の場合の RLU ， Mはクの RL ATP標準液を添加した場合の RLUである.なお， B a ie t a l .( 19 8 8 ) と羽a r t e n s( 2 0 01)の研究において ATPの回収率はほぼ 100%であったとされていることから，乾土あたりの ATP量の算出にあたっては，回収率を考慮しなかっ pHと全炭素量によって土壌を細区分して個々の土壌のバイオマス炭素/ATP比を計算しそれらの平均値に有意差があるかどうかを検定した(表 2 ) . 水田および水田転換畑の黒ボク土については，細区分しなかった. 畑土壌と水田土壌および、水田転換畑土壌との聞には，統計的に有意な差が検出されたが， pHと全炭素量は有意な影響を及ぼしていないことが認められた.なお，バイオマス炭素 /ATP比を儒別に計算した場合には，回帰式から得た. られたバイオマス炭素/ATP比よりやや高い値が得られ託20) と全炭素設の頻度分布表 1 供試土壌 pH( pH( H20) 土壌く 4 . 0 4 . 5 5 . 0 5 . 0 5 . 5 5 . 0 6 . 5 6 . 5 7 . 0 . 0 4 . 5 4 . 5 6 . 0 6 非巣ボク土・畑地 1 4 2 1 0 1 0 1 1 8 黒ボク土・対日地 O 2 9 1 7 1 5 1 非黒ボク土・水田 O O O 5 1 7 2 O 泉ボク土・水田 O O 5 2 l O O 土壌 1 O O O 全炭素設 (gkg→) 2 0 1 5 く非黒ボク土・!畑地黒ボク土・畑地 J o o l 累ボクニヒ・水田黒ボクゴ二・水田 >7 . 0 l l O 2 0 3 0 2 0 4 1 1 3 0 4 0 7 6 1 1 O O 4 0 5 0 2 9 1 3 5 0 6 0 3 4 6 0 7 0 7 0 8 0 8 0 9 0 O O 4 6 O O O O l O l O 2 2 青山:一体型 A TP測定試薬キットと小型ノレミノメーターを用いた農耕地土壌の微生物ノくイオマスの推定 5 0 0 2 5 0 0 ( A ) 、， @ 二400 307 bj) ( B ) 2 0 0 0 震護3∞ 1 5 0 0 z r < 2 0 0 1 0 0 0 T y=117x r= 0 . 8 6 付* e 〆暴1 0 0 剥豊臣 2 3 4 y=2 0 2x r =0.67*** 5 0 0 5 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 A T P( m gk g -1) 関 1 水回転換畑土壌な除いた畑土壌 ( A ) ならびに水田土壌と水回転換焔土壌 (B) における A T P最と微生物バイオマス最の関係 O非祭ボクニと:矧l 土壌 ; e泉ボク土畑土壌;ム非黒ボク土水国土壌; 印非黒ボクニ!こ水回転換~関土壌;企黒ボク土水回. * **0.1%水準で有意表 2 土地利用，土壌タイプ， p Hと全炭素主主とバイオマス炭素/A T P比水回転換畑を除いた畑地 l 水田および水田転換J1J 黒ボク土非黒ボク土黒ボク土非然ボクオ二 20 E旦(H ) 〈 5 . 0 5 . 0 6 . 0 く 5 . 0 >6 . 0 5 . 0 6 . 0 く 5 . 0 >6 . 0 >5 . 0 >5 . 0 2 0土 8a 1 2 4土 8a 1 0a 1 1 7土 11a 1 こ1 1a 2 1 1 2土 1 1 2土 14a 1 4 0と 2 4土 28b 3 9とこ2 0b 2 こ1 5b 2 5 6と ( 1 0 ) ( 1 7 ) ( 3 ) ( 2 2 ) ( 8 ) ( 8 ) ( 15 ) ( 10 ) ( 21 ) 全炭素設 (gkg-1) 〈 2 0 20-30 >3 0 <4 0 4 0…6 0 >6 0 <3 0 〉 3 0 >4 0 1 0 3 5 4土 1 と8a 1 2 3土 1 0a 1 2 8土 8a 1 2 3とこ1 3a 1 3 1とこ1 0a 1 2 8とご1 0a 2 3 4とこ1 7b 2 6b 2 2 4とこ2 8b ( 1 5 ) ( 1 4 ) ( 1 7 ) ( 10 ) ( 1 1 ) ( 13 ) ( 1 1 ) ( 15 ) ( 8 ) 王子均領土標準誤差.表中のアルファベットは引lkey法による多重比較検定の結果を示し向記号は 5%水準で有意義がないことを示す.カッコ内の数字は試料数. ATP量から微生物バイオマス炭素量を推定するにいる.これを mgkg-1乾土で表した微生物バイオマス炭素は，囲 l 帰式から得られた備を換算係数として用いる方が汎 ( Y ) と ATP量 ( X ) で示すと， Y=190Xとなる.たたが，用性は高いと考えられる. したがって，畑土壌では A TP 測定値を 1 1 7倍，水田土壌と水自転換熔土壌で、は 2 0 2倍することにより徴生物バイオマス炭素最に換算で、きる. 前報(青山， 2 0 0 5 ) において， 7点の黒ボク土畑土壌お TP測定植の多くは，だし彼らが用いた A 酸トリクロロ酢 ( T C A )，リン酸およびパラコートを用いた抽出によって得ーられたものである.一方， M a r t e n s( 2 0 01)は，本研究で採用したと向じ DMSO-リン酸三ナトリウムによ ATPを抽出しているが，バイオマス炭素 / よび未耕地土壌について本研究と閉じ一体型試薬キットり土壌からと小型ノレミノメーターで測定した A TP量とクロロホルム ATP 比は 208~217 であると報告している. くん蒸法で測定した微生物バイオマス炭素量との関係は，と比べると，本研究の畑土壌について得ーられた Y=128Xで表されることを報告した. この関係は，本研究で畑土壌について得られた Y =117Xという関係に近いも 0 0 5 ) では前培養時に土壌水分ので、あった.前報(青山， 2 数値はかなり低い. ATP測定は，ルシフェリンールシフエラーゼ反応、によるを最大容水量の 60%に調節したのに対して，本研究では発光に基づいているが，さらにアデノシン 5 ' ーーリン酸これらの報告 1 1 7という一体型試薬キットであるルシパックワイドを用いた前培養特に水分調節を行わなかった.それにも関わらず， ( A M P ) を ATPに変換する酵素であるピルベート・オル ATP量と徴生物バイオマス炭素量との関係は大きくは変ソフォスフェート・ジキナーゼを加えることによって，ルわらなかったことから，前培養時の土壌水分の調節は必須シフェリンールシフエラーゼ、反応で生じた AMPを蒋び ATPに変換して発光強度を高めている(キッコーマン， 2 0 01 ) . このため，本法で求めた A TP測定値は A抗 Pもではないと考えられた. 土壌の徴生物バイオマス炭素量と ATP量との間の関係については，多くの検討が行われてきている. C o n t i ne t 含めた値となり，実際より高く見積もられている可能性が a l .( 2 0 01 ) は，それまで得られていた多数のデータを取ある. このことが，これまで、行われてきた研究と比べてバりまとめて，土壌の徴生物バイオマス炭素量と ATP量と TP比が低い原田であると推定される. イオマス炭素/A ATP(~mol g-l乾土) =0 . 0 1 4x徴生物バイオ水田土壌と水回転換畑土壌に関しては，バイオマス炭素 μgg-l乾土)の関係が成り立つことを報告してマス炭素 ( /ATP比は 2 0 2と，畑土壌と比べてかなり高い植を示しの簡には，日本土壌肥料学雑誌、第 8 2巻第 4号 308 ( 2 0 11 ) た. lnubushie ta l .( 19 9 1 ) は，土壌を湛水条件下と好気ため，現場に近い施設で土壌生物性の診断に用いるには，条件下で培養して ATP量と微生物バイオマスの変化を追前培養を含めた前処理および抽出法のさらなる検討が必要跡し，楳水条件下ではいずれの値も減少するが，徴生物バであると考える. イオマスより ATP量の減少が著しいことを報告している. 謝辞:本研究を行うにあたり，実験を担当された西このことは，湛 7 ] (条件下ではバイオマス炭素 /ATP比が塚由季子さん，林上昇することを意味している.本研究で使用した水田土壌，いたします. 沙樹さんならびに山田智珠さんに感謝水回転換畑土壌のいずれも採取時には湛水状態、で、はなかっ文献たが，湛水条件を経ることもしくは水分過多の状態が土壌の徴生物バイオマスと ATPの関係に影響を及ぼしている可能性が示唆される. Shibaharaandlnubushi( 1995) は，湛水前の水田土壌について TCAーリン酸で、抽出した ATP 量を測定しクロロホルムくん蒸一抽出法で測定した徴生物バイオマス炭素量との関係を検討している.彼らの結果からバイオマス炭素/ATP比を求めると， 232となり， Contine ta l .( 2 0 01 ) が畑土壌に関して得た 190より大きな値となった. このように，水田土壌では畑土壌と比べてバイオマス炭素/ATP比が高くなることが認められており，本研ー究での結果と一致している. 以上のように， DMSO- リン轍三ナトリウム抽出後に清浄度検査用の一体型 ATP測定試薬キットとノト型ノレミノメーターを使うことによって，土壌徴生物バイオマス炭素量が推定可能であることが示された.ただし，畑土壌と水田転換畑土壌を含めた水田土壌とでは ATP測定値から徴生物バイオマス炭素量への換算係数は異なり，前者では ATP測定{直を 117倍，後者では 202倍することによって徴生物バイオマス炭素量に換算で、きることが判明した.本法は，清浄度検査用の一体型試薬キットと小型ノレミノメーターを用いているので，測定操作自体は簡易に行うことができるが，抽出にはスターラーと超音波パスを用いている青山正和 2 0 0 5 .小型ルミノメーターを用いた ATP測定による黒ボク土の微生物バイオ 7 スの推定.土と徴生物， 59，4 1-4 4 . B a i，Q .， . Y Zel 1e s，， . LS c h e u n e r t，， . I andK o r t e，F .1 9 8 8 .A s i m p l e e f f 巴c t i v eproceduref o rt h ed e t e r m i n a t i o no f adenosine h e m o s t h e ' l e ， 17， 2 4 6 1 2 4 7 0 . t r i p h o s p h a t e i n s o i l s .C M.， Todd， A . ， andB r o o k e s， P .C .2001 .TheATPc o n c e n t r a t i o n C o n t i n， i nt h es o i lm i c r o b i a lb i o m a s s .S o i lB i o . lβi o c h e m .， 33， 7 0 1 7 0 4 . K . ，B r o o k e s， P .， . ca n d J e n k i n s o n， D .S .1 9 91 .S o i lm i c r o b i a l I n u b u s h i， b i m a s sC，N andn i n h y d r i n Ni na e r o b i canda n a e r o b i cs o i l s 巴f u m i g a t i o n e x t a c t i o n .S o i lB i o . lB i o c h e m .，2 3， m e a s u r e dbyt h 7 3 7 7 4 1 . .S .，andOades， ] .M.1 9 7 9 .A methodf o rm e a s u r i n g J e n k i n s o n，D . lS o i l B i o . lB i o c h e m .， 1 1， 1 9 3 1 9 9 . a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e i n s o i キッコーマン 2 0 0 1 . ルシパックワイド j取扱説明書， p . l-4，キッコーマン(株)，東京. M a r t e n s， R .2 0 01 .E s t i m a t i o no fATPi ns o i l :e x t r a c t i o nm e t h o d sand o i lB i o . lB i o c h e m .，33， 973c a l c u l a t i o no fe x t r a c t i o ne f f i c i e n c y .S 9 8 2 . S h i b a h a r a，， . F andI n u b u s h i，K .1 9 9 5 .M e a s u r . 巴m e n t so fm i c r ・ o b i a l b i o m a s sCandN i npaddys o i l sbyt h ef u m i g a t i o n e x t r ・ a c t i o n m e t h o d .S o i lS c i .P l 仰，t N u t ， . ' l4 1， 6 8 168 9 E .， . DB r o o k e s， P .， . ca n d J e n k i n s o n， D .S .1 9 8 7 .Ane x t r a c t i o n V a n c e， methodf o rm e a s u r i n gs o i lm i c r o b i a lb i o m a s sC .S o i lB i o . lB i o c l z e m .， 19， 7 0 3 7 0 7 . r