〔実 44 頁〕公表特許公報（Ａ） (19)日本国特許庁（ＪＰ） (12) (11)特許出願公表番号特表2015-519051 （Ｐ２０１５−５１９０５１Ａ） (43)公表日平成27年7月9日(2015.7.9) (51)Int.Cl. ＦＩテーマコード(参考) Ｃ１２Ｎ 15/09 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ２Ｂ０３０Ｃ１２Ｑ 1/68 (2006.01) Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ２Ｂ１５０Ａ０１Ｈ 5/00 (2006.01) Ａ０１Ｈ 5/00 Ａ４Ｂ０２４Ａ０１Ｈ 1/00 (2006.01) Ａ０１Ｈ 1/00 Ａ４Ｂ０６３Ｃ１２Ｎ 5/10 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 5/00 １０３審査請求未請求４Ｂ０６５予備審査請求有 (21)出願番号特願2015-511667(P2015-511667) (86)(22)出願日平成25年5月8日(2013.5.8) モンサント (85)翻訳文提出日平成27年1月6日(2015.1.6) アメリカ合衆国 (86)国際出願番号 PCT/US2013/040173 ス (87)国際公開番号 WO2013/169923 (87)国際公開日平成25年11月14日(2013.11.14) (31)優先権主張番号 61/644,368 (32)優先日平成24年5月8日(2012.5.8) (33)優先権主張国米国(US) （全60頁）最終頁に続く (71)出願人 501231613 テクノロジーミズーリ州ノースリンドバーグエルエルシーセントルイブールバード８００ (74)代理人 100081422 弁理士田中光雄 (74)代理人 100084146 弁理士山崎宏 (74)代理人 100122301 弁理士冨田憲史 (72)発明者ウェン・シー・バーンズアメリカ合衆国６３１６７ミズーリ州セントルイス、ノース・リンドバーグ・ブールバード８００番最終頁に続く (54)【発明の名称】トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１ (57)【要約】本発明は、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１、ならびにイベントＭＯＮ８７４１１を含む植物、植物細胞、種子、植物部分、およびコモディティー製品を提供する。本発明は、イベントＭＯＮ８７４１１に特異的なポリヌクレオチド、ならびにイベントＭＯＮ８７４１１に特異的なポリヌクレオチドを含む植物、植物細胞、種子、植物部分、およびコモディティー製品も提供する。本発明はイベントＭＯＮ８７４１１に関係する方法も提供する。 ( 2 ) JP 1 2015-519051 A 2015.7.9 2 【特許請求の範囲】料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１【請求項１】またはそこに含まれるコンストラクトとハイブリダイズトウモロコシＤＮＡを含有する試料中に検出することがするＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さのポできる組換えＤＮＡ分子であって、該分子のヌクレオチリヌクレオチドセグメントを含むＤＮＡ分子であって、ド配列は、該プローブが、配列番号１に示すトウモロコシイベント（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号ＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれるコンストラクト４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８に特徴的である１つ以上の接合部セグメントに、該条件、配列番号９、配列番号１０、配列番号２１、および配下で特異的にハイブリダイズし、該ハイブリダイゼーシ列番号２５からなる群より選択されるか、またはョン条件下での該ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーシ（ｂ）（ａ）に完全に相補的なヌクレオチド配列であり 10 ョンの検出が、該試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ、８７４１１当該ＤＮＡ分子の存在が、該試料中のトウモロコシイベトに特徴的である、ＤＮＡ分子。ントＭＯＮ８７４１１【請求項７】ＤＮＡに特徴的である、組換えＤＮＡＤＮＡまたはそこに含まれるコンストラクＤＮＡ分子。第１ＤＮＡ分子と、第１ＤＮＡ分子とは異なる第２ＤＮ【請求項２】Ａ分子とを含む、一対のＤＮＡ分子であって、該第１おトウモロコシＤＮＡを含有する試料中に検出することがよび第２ＤＮＡ分子は、それぞれ、ＤＮＡプライマーとできる組換えＤＮＡ分子であって、該分子のヌクレオチして機能して、増幅反応においてトウモロコシイベントド配列は配列番号１またはその完全相補体に対して少なＭＯＮ８７４１１テンプレートＤＮＡを含有する試料とくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列であり共に、一緒に使用した場合に、該試料中の該トウモロコ、当該ＤＮＡ分子の存在が、該試料中のトウモロコシイ 20 シイベントＭＯＮ８７４１１ベントＭＯＮ８７４１１ンプリコンが作製されるように、配列番号１または配列ＤＮＡに特徴的である、組換ＤＮＡに特徴的であるアえＤＮＡ分子。番号２または配列番号３または配列番号４の十分な長さ【請求項３】の連続ヌクレオチドのポリヌクレオチドセグメントを含トウモロコシＤＮＡを含有する試料中に検出することがみ、前記アンプリコンが、配列番号１、配列番号２、配できる組換えＤＮＡ分子であって、該分子のヌクレオチ列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列ド配列は、番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列（ａ）配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配番号２１、および配列番号２５からなる群より選択され列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４るヌクレオチド配列を含む、一対のＤＮＡ分子。４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列【請求項８】番号５１、および配列番号５２からなる群より選択され 30 第１ＤＮＡ分子と、第１ＤＮＡ分子とは異なる第２ＤＮるか、またはＡ分子とを含む、一対のＤＮＡ分子であって、該第１お（ｂ）（ａ）に完全に相補的なヌクレオチド配列でありよび第２ＤＮＡ分子は、それぞれ、ＤＮＡプライマーと、して機能して、増幅反応においてトウモロコシイベント当該ＤＮＡ分子の存在が、該試料中のトウモロコシイベＭＯＮ８７４１１テンプレートＤＮＡを含有する試料とントＭＯＮ８７４１１共に、一緒に使用した場合に、該試料中の該コンストラＤＮＡ内に含まれるコンストラクトに特徴的である、組換えＤＮＡ分子。クトを含むＤＮＡに特徴的であるアンプリコンが作製さ【請求項４】れるように、配列番号１または配列番号２または配列番該ＤＮＡ分子がトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１号３または配列番号４の十分な長さの連続ヌクレオチドに由来し、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含のポリヌクレオチドセグメントを含み、該アンプリコンむ種子の代表試料がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２６６ 40 が、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列９として寄託されている、請求項１、請求項２または請番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４求項３に記載の組換えＤＮＡ分子。、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番【請求項５】号５１、および配列番号５２からなる群より選択される該試料がトウモロコシ植物、トウモロコシ植物細胞、トヌクレオチド配列を含む、一対のＤＮＡ分子。ウモロコシ種子、後代トウモロコシ植物、トウモロコシ【請求項９】植物部分、またはコモディティートウモロコシ製品を含試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１に特徴む、請求項１、請求項２または請求項３に記載の組換え的であるＤＮＡセグメントの存在を検出する方法であっＤＮＡ分子。て、【請求項６】（ａ）該試料を請求項６に記載のＤＮＡ分子と接触させストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で試 50 ること； ( 3 ) JP 3 2015-519051 A 2015.7.9 4 （ｂ）該試料および該ＤＮＡ分子をストリンジェントな物部分。ハイブリダイゼーション条件に付すこと；および【請求項１４】（ｃ）トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１に特徴的Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種の食物に入れて提供された場合である該ＤＮＡセグメントへの該ＤＮＡ分子のハイブリに殺虫性である、請求項１２に記載のトウモロコシ植物ダイゼーションを検出することまたはそのトウモロコシ植物部分。を含み、該検出ステップが該試料中の該トウモロコシイ【請求項１５】ベントＭＯＮ８７４１１分子の存在に特徴的である、方該Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種が、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ法。ｖｉｒｇｉｆｅｒａ【請求項１０】コーンルートワーム、ＷＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１に特徴 10 ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウエスタンｂａｒｂｅｒｉ（ノーザンコーンルートワーム、ＮＣ的であるＤＮＡセグメントの存在を検出する方法であっＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａて、ｅａｅ（メキシカンコーンルートワーム、ＭＣＲ）、Ｄ（ａ）該試料を、請求項７に記載の一対のＤＮＡ分子とｉａｂｒｏｔｉｃａｂａｌｔｅａｔａ（ブラジリアンコ接触させること；ーンルートワーム、ＢＺＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ（ｂ）ＤＮＡアンプリコンを作製するのに十分な増幅反ｂａｌｔｅａｔａ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ応を行うこと；およびｕｌａとＤｉａｂｒｏｔｉｃａ（ｃ）該反応中の該ＤＮＡアンプリコンの存在を検出すらなるブラジリアンコーンルートワーム複合体、ＢＣＲること）、およびＤｉａｂｒｏｔｉｃａを含み、該ＤＮＡアンプリコンは、配列番号１、配列番ｎｃｔａｔａ号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号 20 ワーム、ＳＣＲ）からなる群より選択される、請求項１６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１４に記載のトウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植０、配列番号２１および配列番号２５からなる群より選物部分。択されるヌクレオチド配列を含み、該アンプリコンの存【請求項１６】在の該検出が、該試料におけるトウモロコシイベントＭ該トウモロコシ植物がさらに、該イベントＭＯＮ８７４ＯＮ８７４１１１１を含むトウモロコシ植物の任意の世代の後代植物とＤＮＡの存在に特徴的である、方法。ｖｉｒｇｉｆｅｒａｚｖｉｒｉｄｓｐｅｃｉｏｓａとかｕｎｄｅｃｉｍｐｕｈｏｗａｒｄｉｉ（サザンコーンルート【請求項１１】規定される、請求項１２に記載のトウモロコシ植物また試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１内に含はそのトウモロコシ植物部分。まれるコンストラクトに特徴的であるＤＮＡセグメント【請求項１７】の存在を検出する方法であって、該トウモロコシ植物が、少なくとも片方はイベントＭＯ（ａ）該試料を、請求項８に記載の一対のＤＮＡ分子と 30 Ｎ８７４１１を含む親から育種された雑種である、請求接触させること；項１６に記載のトウモロコシ植物またはそのトウモロコ（ｂ）ＤＮＡアンプリコンを作製するのに十分な増幅反シ植物部分。応を行うこと；および【請求項１８】（ｃ）該反応中の該ＤＮＡアンプリコンの存在を検出す該トウモロコシ植物が、ＤＡＳ−５９１２２−７；ＭＯることＮ８９０３４；ＭＯＮ８８０１７；ＭＩＲ６０４；ＭＯを含み、該ＤＮＡアンプリコンは、配列番号１２、配列Ｎ８７４２７；ＴＣ１５０７；５３０７；ＤＡＳ−０６番号１４、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４２２７５−８；ＢＴ１７６；ＢＴ１１；およびＭＩＲ１６、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番２からなる群より選択されるトランスジェニックイベン号４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号トをさらに含む、請求項１２に記載のトウモロコシ植物５２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み 40 またはそのトウモロコシ植物部分。、該アンプリコンの存在の該検出が、該試料におけるト【請求項１９】ウモロコシイベントＭＯＮ８７３１１配列番号１のヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレＤＮＡ内に含まれる該コンストラクトの存在に特徴的である、方法。オチド分子を含む、トウモロコシ種子。【請求項１２】【請求項２０】配列番号１のヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレ検出可能な量の、イベントＭＯＮ８７４１１またはそこオチド分子を含む、トウモロコシ植物またはそのトウモに含まれるコンストラクトにユニークなＤＮＡ分子を含ロコシ植物部分。むトウモロコシコモディティー製品であって、該分子が【請求項１３】請求項１、請求項２または請求項３に記載の組換えＤＮグリホサート除草剤処置に対して耐性である、請求項１Ａ分子を含む、トウモロコシコモディティー製品。２に記載のトウモロコシ植物またはそのトウモロコシ植 50 【請求項２１】 ( 4 ) JP 2015-519051 A 2015.7.9 5 6 全粒または加工トウモロコシ種子、トウモロコシを含む細菌および植物細胞からなる群より選択される、請求項動物用飼料、トウモロコシ油、コーンミール、コーンフ２８に記載の微生物。ラワー、コーンフレーク、コーンブラン、トウモロコシ【請求項３０】バイオマス、ならびにトウモロコシおよびトウモロコシ（ａ）配列番号１２に示す組換えポリヌクレオチドと部分を使って生産された燃料製品からなる群より選択さ（ｂ）配列番号１４に示す組換えポリヌクレオチドとれるコモディティー製品とさらに規定される、請求項２（ｃ）配列番号１６に示す組換えポリヌクレオチドと０に記載のトウモロコシコモディティー製品。を含むＤＮＡ分子であって、【請求項２２】該組換えポリヌクレオチド配列がホスホジエステル結合ＤＮＡ増幅方法で試験した場合にテンプレートとして機によって一つに連結されている、ＤＮＡ分子。能しうるＤＮＡを含むトウモロコシ植物またはそのトウ 10 【請求項３１】モロコシ植物部分であって、該テンプレートを使った該配列番号４を含むと規定される、請求項３０に記載のＤＤＮＡ増幅方法を実行することで、イベントＭＯＮ８７ＮＡ分子。４１１【請求項３２】ＤＮＡまたはそこに含まれるコンストラクトの存在に特徴的であるアンプリコンが作製される、トウモトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロロコシ植物またはそのトウモロコシ植物部分。コシ植物が約５０∼約１００パーセントを構成するトウ【請求項２３】モロコシ植物の圃場を耕作することを含む、トウモロコグリホサート除草剤に対して耐性なトウモロコシ植物をシ植物の圃場を保護する方法。作製する方法であって、該トウモロコシ植物のゲノムに【発明の詳細な説明】トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を提供すること【技術分野】を含み、該トウモロコシ植物がイベントＭＯＮ８７４１ 20 【０００１】１に関してホモ接合である近交系トウモロコシ植物であ関連出願の参照るか、または少なくとも片方はイベントＭＯＮ８７４１本願は、２０１２年５月８日に出願された米国仮特許出１を含む親トウモロコシ植物のＦ１雑種後代である、方願第６１／６４４，３６８号の利益を主張し、当該仮特法。許出願は引用によりそのまま本明細書に組み込まれる。【請求項２４】【０００２】トウモロコシコモディティー製品を生産する方法であっ配列表の組み込みて、２３０キロバイト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（ａ）請求項１２に記載のトウモロコシ植物またはそのｓ（登録商標）で測定したサイズ）であって２０１３年トウモロコシ植物部分を取得すること；および５月６日に作成された「ＭＯＮＳ３０８ＷＯ＿ＳＴ２５（ｂ）前記組換えトウモロコシ植物またはそのトウモロ 30 ．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、コシ植物部分からトウモロコシコモディティー製品を生電子申請により本願に添付して提出され、引用により本産すること明細書に組み込まれる。を含む、方法。【０００３】【請求項２５】発明の分野圃場における雑草の生長を管理するための方法であって本発明は、トランスジェニックＺｅａ、圃場でイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシト（ｅｖｅｎｔ）ＭＯＮ８７４１１に関する。本イベン植物を生長させること、および雑草の生長を管理するたトは、コーンルートワーム寄生に対する抵抗性のためのめに該圃場を有効量のグリホサートで処置することを含二重の作用機序と除草剤グリホサート耐性とを提供するむ、方法。【請求項２６】Ｗｉｎｄｏｗｍａｙｓイベン。また本発明は、イベントＭＯＮ８７４１１に関係する 40 植物、植物部分、植物種子、植物細胞、農産物、および該有効量のグリホサートが１エーカーあたり約０．１２方法にも関係し、本イベントにユニークなヌクレオチド５ポンド∼約６．４ポンドである、請求項２５に記載の分子であってＺｅａ方法。スジェニックＤＮＡの挿入に関連して作出されたヌクレ【請求項２７】オチド分子を提供する。検出可能な量の請求項１、請求項２または請求項３に記【背景技術】載の組換えＤＮＡ分子を含む、生きていない植物材料。【０００４】【請求項２８】発明の背景検出可能な量の請求項１、請求項２または請求項３に記トウモロコシ（Ｚｅａ載の組換えＤＮＡ分子を含む微生物。において重要な作物であり、望ましい形質を有するトウ【請求項２９】 50 ｍａｙｓ植物のゲノムへのトランｍａｙｓ）は世界の多くの地域モロコシを作製するために、この作物には生物工学の方 ( 5 ) JP 2015-519051 A 2015.7.9 7 8 法が応用されてきた。植物における昆虫抵抗性または除性、熱、もしくはストレスなどによって、さらに複雑に草剤耐性トランスジーンの発現は、昆虫抵抗性および／なりうる。したがって、望ましい一組の表現型形質を付または除草剤耐性という望ましい形質を植物に付与しう与するイベントが得られるかどうかは、容易には予測するが、そのようなトランスジーンの発現は、植物染色体ることができない。に導入された個々の遺伝子の発現を駆動するカセットの【発明の概要】配向および組成、ならびにトランスジーン挿入の染色体【発明が解決しようとする課題】上の位置およびゲノム結果を含む、多くの異なる因子に【０００６】よって左右されうる。例えば、トランスジーンの染色体発明の概要挿入部位の相違を除けば他の点では同一である個々のイ本発明者らは、既存のトランスジェニックトウモロコシベント間でも、トランスジーン発現のレベルおよびパタ 10 植物と比べて、そしてまた、並行して構築された新しいーンにはばらつきが存在しうる。いくつかのイベントのイベントと比べて、優れた性質および成績を呈するトラ間には、望ましくない表現型上または農学上の相違も存ンスジェニックトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１在しうる。したがって、そのイベントを商業的目的に適を同定した。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１はしたものにするのに必要な望ましい形質ならびに最適な、連結された３つの発現カセットを含有し、これらのカ表現型上および農業上の特徴に関して優れた性質を有すセットは全体として、トランスジェニックイベントＭＯるイベントを選択するためには、多数の個別植物形質転Ｎ８７４１１を含有するトウモロコシ細胞、トウモロコ換イベントを作製し、解析することが、しばしば必要にシ組織、トウモロコシ種子およびトウモロコシ植物に、なる。そのような選択は、多くの場合、相当量の農学的コーンルートワーム抵抗性およびグリホサート除草剤耐データ、表現型データ、および分子データを収集するこ性の形質を付与する。トウモロコシイベントＭＯＮ８７とができるように、大規模な分子キャラクタリゼーショ 20 ４１１は、コーンルートワーム病害虫種（Ｄｉａｂｒｏンと、複数年にわたって複数の立地においてさまざまなｔｉｃａ種を含む；とりわけ病害虫が、Ｄｉａｂｒｏｔ条件下で数多くのイベントを使って行われる温室試験おｉｃａよび圃場試験とを必要とする。エスタンコーンルートワーム、ＷＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏその結果得られたデータおよび観察記録は、次に、商業ｔｉｃａ的に好適なイベントを選択することを目指して、科学者ム、ＮＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａと農学者のチームによって解析されなければならない。ｒａそのようなイベントがひとたび選択されたら、次に、そＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａの望ましい形質を植物育種方法で他の遺伝的背景に遺伝ジリアンコーンルートワーム（ＢＺＲ）もしくはＤｉａ子移入し、よって望ましい形質を持ちかつ具体的局所生ｂｒｏｔｉｃａ長条件に適切に適応したいくつかの異なる作物品種を作 30 ｃａ製するために、そのイベントを使用することができる。ルートワーム複合体（ＢＣＲ））、またはＤｉａｂｒｏ【０００５】ｔｉｃａ単一の形質転換イベントを含有するトランスジェニックｒｄｉｉ（サザンコーンルートワーム、ＳＣＲ）である植物を作るには、組換えＤＮＡコンストラクトの一部を場合）に対して、２つの作用機序を提供する。二重の作トウモロコシ細胞のゲノム中に導入し、次に、そのトウ用機序は冗長性を与え、病害虫防除形質に対する抵抗性モロコシ細胞を植物へと生長させる。イベントが最初にが発生する可能性を著しく低減する。導入されたトウモロコシ細胞を再生することでＲ０世代【課題を解決するための手段】を作製する。Ｒ０植物とＲ０植物からの後代植物を所望【０００７】する任意の形質について試験することができるが、イベイベントＭＯＮ８７４１１は、試料中のイベントの存在ントの有効性は、形質転換イベントにおける挿入部位に 40 を検出するのに役立つユニークな特異的ＤＮＡセグメン対してシスおよび／またはトランスの因子による影響をトによって特徴づけられる。試料とは、実質的に純粋な受けうる。イベントによって付与される表現型は、ＤＮトウモロコシＤＮＡである組成物またはトウモロコシＤＡコンストラクトのサイズと設計による影響も受け、そＮＡを含有する組成物のどちらかを指すものとする。どれは発現カセットにおける遺伝要素の組み合わせ、トラちらの場合も試料は生物学的試料である。すなわち試料ンスジーンの数、発現カセットの数、ならびにそのようは生体物質、例えば限定するわけではないが、トウモロな要素およびそのようなカセットの配置によって変動しコシイベントＭＯＮ８７４１１のゲノムから直接的にまうる。望ましい形質を伴うイベントの同定は、トランスたは間接的に取得されるまたは由来するＤＮＡなどを含ジーン発現の植物発生的、日周的、時間的、または空間有する。「直接的に」とは、当業者が、トウモロコシ細的パターンなどといった因子によって、または外因、例胞を破砕し（または破砕されたトウモロコシ細胞を含有えば環境的植物生長条件、水利用可能性、窒素利用可能 50 するトウモロコシの試料を取得し）、検出を目的としてｖｉｒｇｉｆｅｒａｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウｂａｒｂｅｒｉ（ノーザンコーンルートワーｖｉｒｇｉｆｅｚｅａｅ（メキシカンコーンルートワーム、ＭＣｂａｌｔｅａｔａ（ブラｖｉｒｉｄｕｌａとＤｉａｂｒｏｔｉｓｐｅｃｉｏｓａとからなるブラジリアンコーンｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａｈｏｗａ ( 6 ) JP 9 2015-519051 A 2015.7.9 10 ゲノムＤＮＡを露出させることによって、トウモロコシンスジェニックＤＮＡに近接するＤＮＡ配列のトウモロゲノムからＤＮＡを直接的に取得できることを指す。「コシゲノムセグメント）はわずかな変異を起こしやすい間接的に」とは、当業者が、トウモロコシ細胞の破砕にことが知られており、したがって少なくとも９９％またよるかまたは破砕されたトウモロコシ細胞を含有するトはそれ以上の同一性という限定は、トウモロコシゲノムウモロコシの試料を取得することによる直接的な手段以ごとのそのような異常または多型に関連している。ここ外の手段で、ターゲットまたは特異的リファレンスＤＮで参照される特定の特徴的配列と比較してその全長にわＡ、すなわち、特定試料中のイベントＭＯＮ８７４１１たって完全に相補的なヌクレオチドセグメントは、本発の存在に特徴的であると本明細書に記載する新規でユニ明の範囲内にあるものとする。ークな接合部セグメントを取得できることを指す。その【０００９】ような間接的手段には、ターゲット配列に特異的に結合 10 本発明のヌクレオチドセグメントの、互いの相対的な、するように設計された特定プローブのターゲットとなるそしてトウモロコシゲノム内での位置を、図３に図解しＤＮＡ配列を含有するＤＮＡセグメントの増幅、または、それぞれのヌクレオチド配列を配列番号１に示すよう測定し、特徴づけることができるＤＮＡセグメントの増に説明する。イベントＭＯＮ８７４１１を特徴づけ、試幅、すなわち、アガロースゲルやアクリルアミドゲルな料中のイベントＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれるどといった効率のよい何らかのマトリックスによるＤＮコンストラクトの存在に特徴的であるヌクレオチドセグＡの他のセグメントからの分離によって測定することがメントには、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配できる、またはアンプリコンの直接配列解析によって特列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列徴づけることができるか、アンプリコンをベクターにク番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配ローニングし、そのベクター内に存在する挿入されたア列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１ンプリコンのダイレクトシークエンスによって特徴づけ 20 ９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列ることができるＤＮＡセグメントの増幅などがあるが、番号２３、配列番号２４、および配列番号２５；配列番それらに限定されるわけではない。あるいは、トウモロ号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、コシ染色体内の位置であって、トランスジェニックＤＮ配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号Ａはその位置でトウモロコシ染色体に挿入されており、５１、または配列番号５２が含まれる。試料中にこれらイベントＭＯＮ８７４１１を規定するために使用するこのヌクレオチド配列のうちの１つもしくは２つまたはそとができるような位置に対応するＤＮＡのセグメントをれ以上が存在することは、その試料がトウモロコシ組織、さまざまな手段によってクローニングしてから、特定を含有し、したがってトウモロコシＤＮＡを含有する場試料または特定トウモロコシゲノムにおけるその存在に合には、イベントＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれついて同定し、特徴づけることもできる。そのようなＤるコンストラクトの存在に特徴的である。ＮＡセグメントは接合部セグメントまたは接合部配列と 30 【００１０】呼ばれ、挿入ＤＮＡとトウモロコシゲノムの間の接合点「由来」という単語の使用は、ある特定ＤＮＡ分子がトがそのセグメントに含まれている限り、任意の長さの挿ウモロコシ植物ゲノム中にあるか、トウモロコシ植物Ｄ入ＤＮＡと近接（隣接）トウモロコシ染色体ＤＮＡとでＮＡ中に検出されうることを意味している。「検出されあることができる。配列番号１２および配列番号２１なうる」とは、ある特定ＤＮＡセグメントが増幅され、Ｄらびにこれらの配列のそれぞれの逆相補体は、そのようＮＡ配列解析によって、そのサイズおよび／または配列なセグメントを代表するものである。が特徴づけられるまたは解明されることが可能であるこ【０００８】とを指し、また、あるプローブがその特定ＤＮＡセグメ本明細書に記載する特異的配列は、イベントＭＯＮ８７ント、すなわちターゲットＤＮＡセグメントに特異的に４１１中に、またはそこに含まれるコンストラクト中に結合することができ、続いて、そのターゲットへのプロ、ユニークに存在することができ、これらの配列の同定 40 ーブの結合を検出できることも指す。本発明の特定ＤＮは、それが直接配列解析によるものであるか、そのようＡセグメントまたはターゲットＤＮＡセグメントは、挿な配列に結合したプローブを検出することによるもので入イベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ内あるか、または本明細書に記載する特定アンプリコンのに存在する。サイズと場合によっては組成とを観察することによるも【００１１】のであるかを問わず、それが特定トウモロコシの生殖質トウモロコシへの言及は、各実施形態が、トウモロコシまたはゲノム中に存在しかつ／またはトウモロコシＤＮイベントＭＯＮ８７４１１Ａを含有する特定生物学的試料中に存在するのであればると本明細書に記載するセグメントのうちの任意の１つ、そのような試料におけるイベントＭＯＮ８７４１１ま、２つまたはそれ以上に対応する検出可能な量のＤＮＡたはそこに含まれるコンストラクトの存在に特徴的であを含有する限り、トウモロコシ細胞、トウモロコシ種子る。隣接ゲノムセグメント（すなわち、挿入されたトラ 50 、トウモロコシ植物部分およびトウモロコシ植物が本発ＤＮＡの存在に特徴的であ ( 7 ) JP 11 2015-519051 A 2015.7.9 12 明の範囲内であることを意味するものとする。トウモロ、プローブとして作用する少なくとも２つの異なるＤＮコシ植物部分には、細胞；花粉；胚珠、莢（ｐｏｄ）；Ａ分子（ただし、そのような分子の配列は、上述のプロ花および花の一部、例えば穂軸、絹糸、および雄穂；根ーブよりは特異性が多少低くてもよい）を使用する熱増組織；茎組織；および葉組織が含まれる。イベントＭＯ幅方法による方法など、いくつかの方法で同定し、特徴Ｎ８７４１１の存在に特徴的であると本明細書に記載すづけることができる。適当なハイブリダイゼーション条るＤＮＡのセグメントを検出可能な量で含有するトウモ件下で特定のターゲットＤＮＡをプローブまたはプライロコシから作られたコモディティー製品は、本発明の範マーと接触させると標的ＤＮＡセグメントへのプローブ囲内である。そのようなコモディティー製品には、全粒またはプライマーの結合が起こることになることは、当または加工トウモロコシ種子、トウモロコシまたはトウ業者には理解される。モロコシ副産物を含有する動物用飼料、トウモロコシ油 10 【００１４】、コーンミール、コーンフラワー、トウモロコシデンプＤＮＡのターゲットセグメントである本発明のＤＮＡ分ン、コーンフレーク、コーンブラン、トウモロコシのバ子は増幅が可能であり、特定試料の増幅方法によって得イオマスおよび茎葉、ならびにトウモロコシまたはトウられた該当する長さの１つ以上のアンプリコンとして検モロコシ植物およびトウモロコシ植物部分から作られた出される場合、それは、その試料におけるイベントＭＯ場合の燃料製品および燃料副産物などを含めることがでＮ８７４１１またはそこに含まれるコンストラクトの存きる。在に特徴的でありうる。そのようなＤＮＡ分子またはポ【００１２】リヌクレオチドセグメントは、配列番号１、配列番号２トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１のＤＮＡは、典、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、型的には、本イベントを含有するトウモロコシ植物、ト配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、ウモロコシ種子、およびトウモロコシ組織の各細胞およ 20 配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号び各染色体中に存在する。トウモロコシゲノムはメンデ２１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配ルの法則に従って後代に遺伝するので、トウモロコシ植列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４物がホモ接合であるなら、各後代トウモロコシ植物およ９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２び細胞は、親から後代へと生成される親染色体のそれぞのそれぞれに示すヌクレオチド配列を有し、本明細書とれに、イベントＤＮＡを含有するであろう。しかし、イ下記の実施例においてさらに詳しく規定する。プライマベントＭＯＮ８７４１１ＤＮＡを含有するトウモロコー分子および／またはプローブは、対照を含む必要な試シゲノムがヘテロ接合親または雑種親である場合は、雑薬類と共にキットの形態で、使用説明書を同梱して提供種親からの交配に関与する花粉の５０％および胚珠の５することができる。０％しかトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１【００１５】ＤＮＡを含有せず、イベントＭＯＮ８７４１１ＤＮＡを含有 30 本発明の組換えＤＮＡ分子は、それが微生物内にあるかする後代の混合個体群をもたらすことになり、そのよう、または微生物に由来する場合、本発明の範囲内であるな雑種を使った交雑から生じる後代であって、後代に遺とみなされる。微生物は、原核生物であるか真核生物で伝されたイベントＭＯＮ８７４１１ＤＮＡを有するもあるかを問わず、あるいはＤＮＡをゲノムまたは染色体ののパーセンテージは、約５０パーセントないし約７５内に含有するか、染色体外ＤＮＡ構造、より一般的にはパーセントにわたりうる。プラスミドまたはベクターと呼ばれるものに含有するか【００１３】を問わず、任意の顕微鏡的細胞を包含するものとする。本発明のＤＮＡ分子は、トウモロコシイベントＭＯＮ８顕微鏡的生物には、平均的なヒトの視覚域を下回る、典７４１１挿入ＤＮＡにユニークであるか、トランスジェ型的には５０立方ミクロン未満の、より一般的には１０ニック挿入ＤＮＡとその挿入ＤＮＡの一端に近接するト立方ミクロン未満の、細菌（原核生物）および、より高ウモロコシゲノムＤＮＡとの間の２つの接合部にユニー 40 等な生物（真核生物）に対応する細胞が包含される。細クでありうる。これらの分子は、それが、本明細書に記菌は、配列番号１に示すように存在する各発現カセット載する方法により、プローブ、プライマーを使って、まのそれぞれを含む本発明の新規ＤＮＡセグメントの１つた場合によってはＤＮＡ配列解析を使って解析される特もしくは複数または全部を含有するベクターまたはプラ定試料中に存在する場合、その試料におけるある量のイスミドをおそらく含有するであろう、一般的な顕微鏡的ベントＭＯＮ８７４１１トウモロコシの存在に特徴的で微生物である。植物細胞、特にトウモロコシ植物細胞はありうる。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１Ｄ、それらが本発明の新規ＤＮＡセグメントの任意の１つＮＡにユニークであるそのようなＤＮＡ分子は、そのユ、２つもしくはそれ以上または全部を含有する場合、本ニークＤＮＡ分子に特異的に結合するように設計された発明の範囲内である。プローブ核酸分子を使用し、続いてユニークＤＮＡへの【００１６】そのようなプローブの結合を検出することによる方法や 50 ここで使用されるプローブは、典型的には、本明細書に ( 8 ) JP 13 2015-519051 A 2015.7.9 14 おいて規定するストリンジェントなハイブリダイゼーシトワームＤｉａｂｒｏｔｉｃａの全ての既知種のコーンョン条件下で機能して、特定のターゲットＤＮＡセグメルートワーム、例えば限定するわけではないが、Ｄｉａント、すなわち、試料内に存在して、試料中のイベントｂｒｏｔｉｃａＭＯＮ８７７４１ｒａ（ウエスタンコーンルートワーム、ＷＣＲ）、ＤｉＤＮＡの存在に特徴的である、ユニｖｉｒｇｉｆｅｒａｖｉｒｇｉｆｅークなＤＮＡのセグメントと結合するのに十分な長さのａｂｒｏｔｉｃａＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドセグメントと特徴づートワーム、ＮＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａけられる。そのようなプローブは、トウモロコシイベンｇｉｆｅｒａトＭＯＮ８７４１１ム、ＭＣＲ）、ＤｉａｂｒｏｔｉｃａＤＮＡ中にのみ存在する単一の接ｂａｒｂｅｒｉ（ノーザンコーンルｖｉｒｚｅａｅ（メキシカンコーンルートワーｂａｌｔｅａｔ合部または他の新規配列だけに結合するか、または２つａ（ブラジリアンコーンルートワーム（ＢＺＲ）または以上のそのような単一接合部セグメントに結合するよう 10 ＤｉａｂｒｏｔｉｃａｖｉｒｉｄｕｌａとＤｉａｂｒｏに設計することができる。いずれにせよ、トウモロコシｔｉｃａＤＮＡを含有すると疑われる特定試料中のＤＮＡ分子へーンルートワーム複合体（ＢＣＲ））、およびＤｉａｂのそのようなプローブの結合の検出は、その試料におけｒｏｔｉｃａるトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１の存在に特徴ｗａｒｄｉｉ（サザンコーンルートワーム、ＳＣＲ）に的である。よる寄生に対して抵抗性でもある。Ｄｉａｂｒｏｔｉｃ【００１７】ａ種に対する抵抗性は、挿入トランスジェニックＤＮＡプライマーは、典型的には、特定のＤＮＡターゲットセ内で作動的かつ共有結合的に連結された２つの異なるＤグメントを増幅する熱増幅反応において使用するためのＮＡセグメントの発現に関連して生じる。すなわちｄｓ異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドセグＲＮＡは、配列番号１に示す挿入トランスジェニックＤメントのペアとして提供される。ペア内の各プライマー 20 ＮＡの５’近位端にある発現カセット（図１に［Ｇ］配は、増幅のために、目的のＤＮＡセグメント内またはそ列番号１２の位置で図解するもの）から転写され、コーの近くにある、かなり特異的なＤＮＡセグメントに結合ンルートワーム中の必須遺伝子を抑制のターゲットとすするように設計される。プライマーは、それらが、次いる。また、コウチュウ毒性Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質は、で、１つ以上のアンプリコン（増幅されたターゲットＤｄｓＲＮＡ［Ｇ］を発現するカセットと、配列番号１にＮＡセグメント）の作製をもたらす局在化した核酸配列示す挿入トランスジェニックＤＮＡの３’遠位端にある重合の領域として働くような形で結合する。本発明におカセット（図１に［Ｉ］配列番号１６によって図解するいて、特定の生物学的試料中のトウモロコシイベントＭグリホサート耐性発現カセット）との間の中央にある発ＯＮ８７４１１ｓｐｅｃｉｏｓａとからなるブラジリアンコｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａｈｏＤＮＡのユニークなセグメントに結合現カセット（図１に［Ｈ］配列番号１４の位置で示されするように設計されたプライマーであって、本明細書にるように配列番号１のほぼ中央にある）から発現される記載の接合部セグメントの１つ以上を含有する特定のア 30 。ｄｓＲＮＡは、ｓｎｆ７と呼ばれる酵母オルソログ遺ンプリコンを増幅するものの使用、ならびにポリメラー伝子を抑制のターゲットとし、ＣＡＭＶゼ反応が完了または終結した時のそのようなアンプリコモーターから発現される。一方、Ｃｒｙ３Ｂｂタンパクンの検出および／またはキャラクタリゼーションは、そ質は、Ｚｅａの特定試料におけるトウモロコシイベントＭＯＮ８７４現される。これらのｄｓＲＮＡおよびＣｒｙ３Ｂｂタン１１の存在に特徴的である。当業者はこの増幅方法を熟パク質は、コーンルートワーム種にとっては毒性作用物知しており、ここで増幅の詳細を細かく説明する必要は質である。ない。【００１９】【００１８】ｄｓＲＮＡおよびＣｒｙ３Ｂｂ毒性作用物質の発現を駆トウモロコシ植物、トウモロコシ植物細胞、トウモロコ動するプロモーターは分岐的に置かれているので、各毒シ植物組織およびトウモロコシ種子は、配列番号１に示 40 性作用物質の各プロモーターからの発現は、２つのプロすように３’遠位端にある発現カセット中のイネＲｃｃモーター間の中央にある点から離れていく。すなわち、３プロモーターからのグリホサート非感受性ＣＰ４各発現カセットの転写は反対の向きに進行し、一点にはＥｍａｙｓｅ３５ＳプロＰＩＩＧプロモーターから発ＰＳＰＳ酵素の発現により、グリホサート除草剤の施用集まらない。グリホサート耐性ＣＰ４に対して非感受性である。そのような種子は圃場に播種カセットは、Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質の発現を駆動するすることができる。カセットの下流、すなわち配列番号１に示すように３’ 発芽および苗条の出現の数日後に、雑草防除有効量のグ端に近い方、３’遠位側にある。Ｃｒｙ３ＢｂとＥＰＳリホサート除草剤を施用することができ、これは、圃場ＰＳの発現を駆動するカセットはタンデム配向の転写（内の雑草の実質的に全てを排除するが、トウモロコシイＣｒｙ３ＢｂがＥＰＳＰＳの上流）を使ってそれぞれのベントＭＯＮ８７４１１タンパク質を生産し、同じ配向で、ただし各々別個のプＤＮＡを含有するトウモロコシ植物の継続的生育は許すことになる。本植物は、ルー 50 ＥＰＳＰＳ発現ロモーターから、それぞれ転写される。ｄｓＲＮＡ発現 ( 9 ) JP 15 2015-519051 A 2015.7.9 16 カセットとグリホサート耐性カセットを無傷のまま、ト有するであろう。ウモロコシゲノムへの挿入を意図したＤＮＡセグメント【００２２】の遠位端に置いておき、Ｃｒｙ３Ｂｂカセットの配向をイベントＭＯＮ８７４１１イベントＭＯＮ８７４１１ＤＮＡを含有する植物に何ＤＮＡ内に存在する設計とらかの追加形質を付与するトランスジェニック特性または反転または逆転させた、他の変異型コンストラクトをはトランスジェニックアレルは、特に望ましい。そのよ作製した。これらの変異型コンストラクトでは、Ｃｒｙうなトランスジェニックアレルとして、コーンルートワ３Ｂｂの発現を駆動するのに、ＺｅａＰＩーム抵抗性を付与する他のトランスジェニックイベントＩＧプロモーターまたはイネＲｃｃ３プロモーターを利、例えば限定するわけではないが、ＤＡＳ−５９１２２ｍａｙｓ用した。 −７；ＭＩＲ６０４；および５３０７などのイベントが【００２０】 10 挙げられる。これらのイベントはそれぞれ追加のコーンＣｒｙ３Ｂｂ発現カセットのこれらの変異型コンストラルートワーム毒性作用物質を与える（ＤＡＳ−５９１２クト／配向だけを含有するトランスジェニックイベント２−７は、ルートワーム毒性を呈するＰＳ１４９Ｂ１（を、イベントＭＯＮ８７４１１、ならびに現在市販されＣｒｙ３４／Ｃｒｙ３５）およびグルホシネートに対すているイベントＭＯＮ８６３（Ｃｒｙ３Ｂｂ発現カセッる除草剤耐性を与え；ＭＩＲ６０４は、ルートワーム毒トだけを含有するもの）、ＭＯＮ８８０１７（ＣＰ４性を呈する修飾Ｃｒｙ３Ａａを与え；イベント５３０７ＥＰＳＰＳ発現カセットに作動的に連結されたＣｒｙ３は、ルートワーム毒性を呈するＦＲ８ａ遺伝子を与えるＢｂ発現カセットを含有するもの）、およびＤＡＳ−５）。これらのような追加のコーンルートワーム抵抗性形９１２２−７（作動的に連結された３つの発現カセット質を与えることにより、与えられたコーンルートワームを含有し、そのうちの２つが二重Ｂｔ毒素コンポーネン毒性作用物質のいずれか一つに対する抵抗性が発生するトＣｒｙ３４およびＣｒｙ３５をタンデムに発現すると 20 可能性を減少させうる。他の望ましい形質には、収量お共に、１つがグルホシネート耐性を付与するもの）と比よびストレス抵抗性または耐性形質、窒素固定形質、水較した。の使用を調整する形質、真菌寄生に対する抵抗性、ジカ以下に実施例で説明する結果は、イベントＭＯＮ８７４ンバ（ＭＯＮ８７４２７）、グルホシネートなどの除草１１がＣｒｙ３Ｂｂタンパク質の根指向的発現に関して剤に対する抵抗性、ならびに鱗翅類寄生に対する抵抗性優れた性質を呈すること、そしてイベントＭＯＮ８７４などがある。鱗翅類寄生抵抗性形質は当技術分野におい１１を生成させるために使用したコンストラクトを使って提供されており、これには、トランスジェニックトウて作製したトランスジェニックイベントの多くは、他のモロコシイベント（およびそれぞれの鱗翅類活性タンパコンストラクトを使って作製した他のイベントよりも、ク質）ＭＯＮ８１０（Ｃｒｙ１Ａｂ）、ＭＯＮ８９０３それぞれコーンルートワームの有効な防除を呈する可能４（Ｃｒｙ１Ａ．１０５およびＣｒｙ２Ａｂ）；ＴＣ１性が高いことを示している。 30 ５０７（Ｃｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ１Ｆａ）；ＤＡＳ− 【００２１】０６２７５−８（ＴＣ−６２７５とも呼ばれる）（ＣｒイベントＭＯＮ８７４１１に対応するＤＮＡをそれぞれｙ１Ｆａおよびｂａｒ（グリホシネート耐性を与える）含有する、本発明のトウモロコシ植物およびその部分、）；ＭＩＲ１６２（Ｖｉｐ３Ａａ）、ＢＴ１７６（Ｃｒ例えば種子は、本発明の範囲内である。そのような植物ｙ１Ａｂ）；およびＢＴ１１（Ｃｒｙ１Ａｂ）などがあはコーンルートワームの寄生に対して抵抗性であり、除る。これらの形質、特にイベントＭＯＮ８７４１１形質草剤グリホサートの施用に対して非感受性である。そのに対応する昆虫抵抗性形質、他の列挙したコーンルートような植物には、ＭＯＮ８７４１１アレルを１つしか含ワーム抵抗性形質、または鱗翅類抵抗性形質の何らかの有しない雑種、すなわちイベントＭＯＮ８７４１１Ｄ組み合わせまたは全部を単一の植物に与えることに代わＮＡに対応する座位に関してヘテロ接合と特徴づけられる選択肢は、これらをさまざまな組み合わせの種子ブレるゲノムを含有する雑種が包含される。そのような雑種 40 ンドとして提供することであるだろう。この場合、ブレは、雑種強勢および他の農業上望ましいトウモロコシのンド中の種子のうち、あるものは、ＭＯＮ８７４１１形性質を確保するために、望ましい生殖質を使った育種に質および列挙したコウチュウ抵抗性形質のみの何らかのよって作製される。雑種はいくつもの方法によって作製組み合わせを含有し、地下でコーンルートワームの寄生することができるが、好ましい一方法では、イベントＭを防止するように協同して作用する一方、ブレンド中のＯＮ８７４１１特異的アレルを、どちらの染色体でも、他の種子は鱗翅類抵抗性形質だけを含有し、地上でトウイベントＭＯＮ８７４１１ＤＮＡが挿入された座位にモロコシの鱗翅類寄生に対する抵抗性を付与する。この含有する第１近交系（ホモ接合）親を利用し、その第１ようにして、ブレンド中の種子は互いにとってのリフュ近交系を、ＭＯＮ８７４１１ＤＮＡを含有しない第２ージ（ｒｅｆｕｇｅ）になる。すなわち、コウチュウ防近交系と交配する。どちらの親近交系品種も、後代種子御種子および植物は鱗翅類抵抗性を付与する植物にとっ、すなわち雑種種子に望まれる１つ以上の有利な性質を 50 てのリフュージとして働き、逆もまた同じである。しか ( 10 ) JP 17 2015-519051 A 2015.7.9 18 し典型的には、これらの形質は、次に述べるような何らーン／ゲノムＤＮＡ接合部配列を形成する配列番号２おかの形質の組み合わせまたはパッケージとして提供されよび３の相対的位置に対応する；［Ｄ］は、ゲノムに組る。すなわち、ＭＯＮ８７４１１形質は、圃場の作物にみこまれてイベントＭＯＮ８７４１１をもたらすトラン病害虫抵抗性の完全なパッケージが提供されるように、スジェニックＤＮＡインサートの配列である配列番号４鱗翅類抵抗性形質の１つ以上との交配により、単一の植を表す；［Ｅ］は、それぞれトランスジェニック挿入Ｄ物中に一緒に提供される。そして、わずかな割合の種子ＮＡの末端と隣接ゲノムＤＮＡとの間の５’接合部をま（おそらく１∼２０パーセントまたはその間の任意の数たぐ配列番号５、配列番号６および配列番号７の相対的字、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１位置に対応する；［Ｆ］は、それぞれトランスジェニッ１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、またク挿入ＤＮＡの末端と隣接ゲノムＤＮＡとの間の３’接は１９パーセント）には、除草剤耐性だけが付与されて 10 合部をまたぐ配列番号８、配列番号９および配列番号１いて、それらは病害虫防御形質を欠き、圃場には、病害０の相対的位置に対応する；［Ｇ］、［Ｈ］および［Ｉ虫抵抗性形質を付与された種子と共にランダムに混植さ］は、それぞれ、トウモロコシ植物ゲノムに挿入されてれるか、区画化された（別個の）作物群落として植え付イベントＭＯＮ８７４１１をもたらすトランスジェニッけられ、それらが、地上でトウモロコシ植物を攻撃するクＤＮＡコンストラクトに対応する３つの異なる発現カ病害虫にとっても地下でトウモロコシ植物を攻撃する病セットを表す；［Ｊ］および［Ｋ］は、イベントＭＯＮ害虫にとっても、リフュージとして働くことになるだろ８７４１１の接合部に対応するオリゴヌクレオチドプラう。イマー、オリゴヌクレオチドプローブ、およびＤＮＡア【００２３】ンプリコンを表す。イベントＭＯＮ８７４１１に挿入されたコンストラクト【図２】ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）をタにはＥＰＳＰＳ発現カセットに関連して特別な利点があ 20 ーゲットとする２つの植物内保護物質（ＰＩＰ）カセッる。第１に、このカセットの存在は、コンストラクトがトおよび１つの除草剤耐性カセットを含む、最高３つの挿入されているトランスジェニックイベントの選択を容異なるカセットを発現するように工学的に操作された、易にする。第２に、このカセットは、イベントＭＯＮ８１１の異なるＤＮＡコンストラクト（４１７、４１６、７４１１に対応する種子が植え付けられた圃場における４１８、４１９、４０２、４０３、４０４、４２３、４雑草の防除を可能にする。そのようなＭＯＮ８７４１１０５、４０６、および８９０）の図解。２つのＰＩＰカ植物が入っている圃場には、グリホサートに感受性であセットは、（ａ）Ｄｖ＿Ｓｎｆ７ｏる雑草の、圃場における生長を管理するために、有効量反復用の発現カセット、および（ｂ）Ｃｒｙ３Ｂｂタンのグリホサートを散布することができる。グリホサートパク質用の発現カセットを含む。に感受性でない雑草については、上述のように、他の除図示したコンストラクトのそれぞれは、これらの発現カ草剤に対する耐性、例えばジカンバに対する耐性または 30 セットをさまざまな順序および配向で含む。コンストラグルホシネートに対する耐性などをもたらす他のトランクト４０５および４０６は除草剤耐性カセットを含有せスジェニックイベントを、イベントＭＯＮ８７４１１とず、コンストラクト８９０はＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ共に単一の雑種に導入することで、除草剤グリホサートマー逆方向反復用の単一発現カセットだけを含む。３つ、ジカンバ、またはグルホシネートのうちの２つ以上をのコンストラクトは、左境界（ＬＢ）から右境界（ＲＢ施用することによる圃場の雑草を防除するための有効な）までに、全部で１６の遺伝要素、すなわち［１］ＬＢ手段を提供することができる。；［２］Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９というのも、これらの除草剤のうちの２つ以上に対して２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ逆方向反復遺伝子；［４］耐性を呈する雑草が存在する可能性は考えがたく、上述トウモロコシＤｎａＫイントロン；［５］ＣａＭＶの場合、トウモロコシ作物は、上述のような除草剤の併５Ｓリーダー；［６］ｅＣａＭＶ用施用に対して抵抗性を呈する雑種からなるだろうから 40 ；［７］トウモロコシＰＩＩＧプロモーター；［８］コである。ムギＬｈｃｂ１リーダー；［９］イネＡｃｔ１イントロ【図面の簡単な説明】ン；［１０］ｃｒｙ３Ｂｂ【００２４】ｓｐ１７【図１】トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１のゲノーター、リーダー、イントロン）；［１３］ＣＴＰ；［ムにおけるトランスジェニックインサートの概略図：［１４］ＣＰ４Ａ］は、トウモロコシＬＨ２４４のゲノムに組み込まれ ’ＵＴＲ；および［１６］ＲＢを含む。たトランスジェニックＤＮＡインサートと挿入ＤＮＡに【図３】［Ａ］∼［Ｎ］および［ａａ］∼［ｍｍ］は、隣接する５’および３’ゲノムＤＮＡとの連続配列であ作動的に連結された要素および隣接トウモロコシゲノムる配列番号１を表す；［Ｂ］および［Ｃ］は、それぞれ、ならびにそれらがトウモロコシイベントＭＯＮ８７４イベントＭＯＮ８７４１１の５’および３’トランスジ 50 １１ゲノム中のトランスジェニックＤＮＡ挿入位置内に２４０マー逆方向２４０３’ＵＴＲ；［３］３３５ＳプロモーターＯＲＦ；［１１］コムギＨ３’ＵＴＲ；［１２］イネＴｕｂＡ（プロモＥＰＳＰＳ；［１５］イネＴｕｂＡ３ ( 11 ) JP 19 2015-519051 A 2015.7.9 20 存在する時の、それらの互いの相対的な位置を図解してらの発現の方向に、それぞれのプロモーター（［Ｅ］おいる。以下の説明では、配列番号１に示す要素のそれぞよび［Ｆ］）を表現している）。れについて、組成、機能および位置を特定する。示すヌクレオチド位置４５４１∼４６０１は、Ｔｒｉｔ［Ａ［Ｇ］配列番号１に］配列番号１に示すヌクレオチド位置１∼５００は、トｉｃｕｍウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１中でトランスジェａ．Ｌｈｃｂ１）由来の非翻訳５’リーダー配列に対応ニック挿入ＤＮＡに近接しているトウモロコシゲノムＤする。ＮＡに対応し、この例では、これを随意にトランスジェ１８∼５０９７は、Ｏｒｙｚａニック挿入ＤＮＡの５’端に割り当てている。 −１遺伝子（Ｏｓ．Ａｃｔ１）由来のイントロン配列に［Ｂ］ａｅｓｔｉｖｕｍ集光複合体ｂ１遺伝子（Ｔ［Ｈ］配列番号１に示すヌクレオチド位置４６ｓａｔｉｖａアクチン配列番号１に示すヌクレオチド位置８０７∼１４３９は対応する。、Ｐｉｓｕｍ５１０７∼７０６８は、Ｃｒｙ３Ｂｂコーンルートワーｓａｔｉｖｕｍリブロース二リン酸カル 10 ボキシラーゼ小サブユニットＥ９３’転写終結およびポリアデニル化シグナルの逆相補配列に対応する。［Ｉ］配列番号１に示すヌクレオチド位置ム毒性タンパク質（ｃｒｙ３Ｂｂ）をコードするヌクレ［オチド配列に対応する。コードされているＣｒｙ３ＢｂＣ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１４６９∼２０タンパク質は、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ（コーンルートワ９８は、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種の食物に入れて提供さーム）種の食物に入れて提供された場合に殺虫性であるれた場合に、Ｓｎｆ７タンパク質をコードする酵母遺伝。［Ｊ］配列番号１に示すヌクレオチド位置７０８８子のＤｉａｂｒｏｔｉｃａ種オルソログを抑制のターゲ ∼７２９７は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍットとするように設計された、２４０ヌクレオチドのｄショックタンパク質１７（ＨＳＰ１７）転写終結およびｓＲＮＡと１５０ヌクレオチドのヘアピン構造に折りたポリアデニル化シグナルの配列に対応する。たまれるＲＮＡ分子として発現するように設計された、列番号１に示すヌクレオチド位置７３４６∼９５２６は逆相補配列に対応する。Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ、Ｏｒｙｚａｓｎｆ 20 ａｅｓｔｉｖｕｍ熱［Ｋ］配ｓａｔｉｖａαチューブリン−３遺伝子７オルソログ遺伝子の一部分に対応する第１の２４０ヌ（ＴｕｂＡ−３）由来の連続プロモーター−リーダー− クレオチドセグメントは、配列番号１に示すヌクレオチイントロン配列に対応する。このプロモーターは、付随ド位置１４６９∼１７０８に与えられ、第１セグメントのリーダーおよびイントロン、ならびに転写終結およびの逆相補体に対応する第２の２４０ヌクレオチドセグメポリアデニル化要素［Ｍ］と共に、要素［Ｌ］の発現をントは、配列番号１に示すヌクレオチド位置１８５０∼ 調節する。２０９８に示されており、第１セグメントと第２セグメ９５３１∼１１１２６は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓントは配列番号１に示すヌクレオチド位置１７０９∼１ｈａｌｉａｎａ細胞質ターゲティングペプチド（ｃｙｔ８５８にある１５０ヌクレオチドのスペーサーによってｏｐｌａｓｍｉｃ作動的に連結されている。ｅ）（ＣＴＰ；ヌクレオチド位置９５３１∼９７５８）［Ｄ］配列番号１に示すヌクレオチド位置２１３５∼２９３８は、Ｚｅａｓｍａｙ 30 ｄｎａＫ遺伝子に由来するイントロンの逆相補配列に対応する。［Ｌ］配列番号１に示すヌクレオチド位置ｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｐｅｐｔｉｄの配列、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣＰ４由来のＥＰＳＰＳの配列（ヌクレオチド位置９７５９∼１［Ｅ］配列番号１に示すヌクレオチド位１１２６）に対応する。この配列がトウモロコシ植物細置２８３９∼３２９８は、カリフラワーモザイクウイル胞中で転写され、タンパク質に翻訳されると、ＣＴＰがス強化３５Ｓプロモーター配列の逆相補体および非翻訳ＥＰＳＰＳに作動的に連結される。イベントＭＯＮ８７５’リーダー配列に対応する。このプロモーター、付随４１１を含むトウモロコシ植物細胞中で発現すると、この非翻訳リーダー、イントロン要素［Ｄ］ならびに転写のＣＴＰ−ＥＰＳＰＳは除草剤グリホサートに対する耐終結およびポリアデニル化要素［Ｂ］は、トウモロコシ性を提供する。植物細胞における要素［Ｃ］の発現を調節する。位置１１１３４∼１１７１５は、Ｏｒｙｚａ［Ｆ［Ｍ］配列番号１に示すヌクレオチドｓａｔｉ］配列番号１に示すヌクレオチド位置３５８６∼４５３ｖａαチューブリン−３遺伝子（ＴｕｂＡ−３）転写終４は、Ｚｅａ結およびポリアデニル化シグナルの配列に対応する。ｍａｙｓの物理的障害誘導タンパク質（ 40 ｐｈｙｓｉｃａｌｄｉｍｐｅｄａｎｃｅｉｎｄｕｃｅ［Ｎ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１１７４９∼ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子（Ｚｍ．ＰＩＩＧ）由来の１２２４８は、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１プロモーター配列に対応する。このプロモーター、付随中でトランスジェニック挿入ＤＮＡに近接しているトウの非翻訳リーダー［Ｇ］、イントロン要素［Ｈ］ならびモロコシゲノムＤＮＡに対応し、この例では、これを随に転写終結およびポリアデニル化要素［Ｊ］は、要素［意にトランスジェニック挿入ＤＮＡの３’端に割り当てＩ］の発現を調節する。このプロモーターは、プロモーている。ター［Ｅ］に対して、各プロモーター（［Ｅ］と［Ｆ］５０１∼８０６は、４１７コンストラクトのＡｇｒｏｂ）が各々の要素（［Ｃ］および［Ｉ］）の分岐発現を駆ａｃｔｅｒｉｕｍ動するような配向にある（図２のブロック矢印を参照さ左境界配列のうち、イベントＭＯＮ８７４１１を形成されたい；図２では、矢印が、表示した各プロモーターか 50 せるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジ［ａａ］配列番号１に示すヌクレオチド位置ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓオクトピン ( 12 ) JP 21 2015-519051 A 2015.7.9 22 ェニックＤＮＡインサートの随意に割り当てられた５’ ５１０６は、要素［Ｈ］と［Ｉ］の間の介在配列に対応端において、ゲノムに近接している部分に対応する。配する。配列番号１に示す［ｈｈ］の５’端は要素［Ｈ］列番号１に示す［ａａ］の５’端は要素［Ａ］の３’端の３’端に連結され、要素［ｈｈ］の３’端は要素［Ｉに連結されて、配列番号５、配列番号６、配列番号７］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を、および配列番号２１に包含されるユニークな５’トラ形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニック挿入ＤＮＡ／トウモロコシゲノム接合部ンスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号４７にを形成する。要素［ａａ］の３’端は要素［Ｂ］の５’ 包含される接合部を形成するが、この接合部はイベント端に連結されて、配列番号４１に包含されるトランスジＭＯＮ８７４１１にユニークではない。ェニック挿入ＤＮＡ内のユニークな接合部を形成する。番号１に示すヌクレオチド位置７０６９∼７０８７は、［ｂｂ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１４４０ 10 ［ｉｉ］配列要素［Ｉ］と［Ｊ］の間の介在配列に対応する。配列番 ∼１４６８は、要素［Ｂ］と［Ｃ］の間の介在配列に対号１に示す［ｉｉ］の５’端は要素［Ｉ］の３’端に連応する。配列番号１に示す［ｂｂ］の５’端は要素［Ｂ結され、要素［ｉｉ］の３’端は要素［Ｊ］の５’端に］の３’端に連結され、要素［ｂｂ］の３’端は要素［連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるたＣ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１めにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニッを形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトクＤＮＡインサート内に、配列番号４８に包含される接ランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番号４２合部を形成するが、この接合部はイベントＭＯＮ８７４に包含されるユニークな接合部を形成する。１１にユニークではない。［ｃｃ］［ｊｊ］配列番号１に示す配列番号１に示すヌクレオチド位置２０９９∼２１３４ヌクレオチド位置７２９８∼７３４５は、要素［Ｊ］とは、要素［Ｃ］と［Ｄ］の間の介在配列に対応する。配［Ｋ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［列番号１に示す［ｃｃ］の５’端は要素［Ｃ］の３’端 20 ｊｊ］の５’端は要素［Ｊ］の３’端に連結され、要素に連結され、要素［ｃｃ］の３’端は要素［Ｄ］の５’ ［ｊｊ］の３’端は要素［Ｋ］の５’端に連結され、イ端に連結されて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコるためにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサニックＤＮＡインサート内に、配列番号４３に包含されート内に、配列番号４９に包含されるユニークな接合部るユニークな接合部を形成する。を形成する。［ｅｅ］配列番号１［ｋｋ］配列番号１に示すヌクレオチドに示すヌクレオチド位置３２９９∼３５８５は、要素［位置９５２７∼９５３０は、要素［Ｋ］と［Ｌ］の間のＥ］と［Ｆ］の間の介在配列に対応する。配列番号１に介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｋｋ］の５’ 示す［ｅｅ］の５’端は要素［Ｅ］の３’端に連結され端は要素［Ｋ］の３’端に連結され、要素［ｋｋ］の３、要素［ｅｅ］の３’端は要素［Ｆ］の５’端に連結さ ’端は要素［Ｌ］の５’端に連結されて、イベントＭＯれて、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにト 30 Ｎ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムにウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮ挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、Ａインサート内に、配列番号４４に包含されるユニーク配列番号５０に包含されるユニークな接合部を形成するな接合部を形成する。［ｆｆ］配列番号１に示すヌク。［ｌｌ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１１１レオチド位置４５３５∼４５４０は、要素［Ｆ］と［Ｇ２７∼１１１３３は、要素［Ｌ］と［Ｍ］の間の介在配］の間の介在配列に対応する。配列番号１に示す［ｆｆ列に対応する。配列番号１に示す［ｌｌ］の５’端は要］の５’端は要素［Ｆ］の３’端に連結され、要素［ｆ素［Ｌ］の３’端に連結され、要素［ｌｌ］の３’端はｆ］の３’端は要素［Ｇ］の５’端に連結されて、イベ要素［Ｍ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮ８７ントＭＯＮ８７４１１を形成させるためにトウモロコシ４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿入さゲノムに挿入されたトランスジェニックＤＮＡインサーれたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配列番ト内に、配列番号４５に包含されるユニークな接合部を 40 号５１に包含されるユニークな接合部を形成する。形成する。［ｇｇ］配列番号１に示すヌクレオチド位ｍｍ］配列番号１に示すヌクレオチド位置１１７１６∼ 置４６０２∼４６１７は、要素［Ｇ］と［Ｈ］の間の介１１７４８は、４１７コンストラクトのＡｇｒｏｂａｃ在配列に対応する。配列番号１に示す［ｇｇ］の５’端ｔｅｒｉｕｍは要素［Ｇ］の３’端に連結され、要素［ｇｇ］の３’ 配列のうち、イベントＭＯＮ８７４１１を形成させるた端は要素［Ｈ］の５’端に連結されて、イベントＭＯＮめにトウモロコシゲノムに挿入されたトランスジェニッ８７４１１を形成させるためにトウモロコシゲノムに挿クＤＮＡインサートの随意に割り当てられた３’端にお入されたトランスジェニックＤＮＡインサート内に、配いて、ゲノムに近接している部分に対応する。配列番号列番号４６に包含される接合部を形成するが、この接合１に示す［ｍｍ］の５’端は要素［Ｍ］の３’端に連結部はイベントＭＯＮ８７４１１にユニークではない。され、要素［ｍｍ］の３’端は要素［Ｎ］の５’端に連［ｈｈ］配列番号１に示すヌクレオチド位置５０９８∼ 50 結されて、配列番号５２に包含されるユニークなトラン［ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリン右境界 ( 13 ) JP 23 2015-519051 A 2015.7.9 24 スジェニック挿入ＤＮＡ／トウモロコシゲノム接合部をオチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡの境界残余部形成する。（２６３ヌクレオチド）とを表す。【図４】コーンルートワーム毒性作用物質の発現を駆動配列番号８は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチする分岐プロモーターの効力が、コーンルートワーム毒ド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベン性作用物質の発現を駆動するタンデム配向のプロモータトＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡのーを持つベクターと比べて高いことを示すために試験しセグメント（８３ヌクレオチド）と挿入トランスジェニたベクターの図解。ックＤＮＡに近接する３’ゲノムＤＮＡのセグメント（【発明を実施するための形態】３４ヌクレオチド）とを表す。【００２５】配列の簡単な説明配列番号９は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチ 10 ド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベン配列番号１は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチトＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡのド配列であり、５’から３’に向かって、イベントＭＯセグメント（８３ヌクレオチド）と挿入トランスジェニＮ８７４１１中の、挿入トランスジェニックＤＮＡに隣ックＤＮＡに近接する３’ゲノムＤＮＡのセグメント（接（近接）する５’ゲノムＤＮＡのセグメント（５００９０ヌクレオチド）とを表す。ヌクレオチド）、挿入トランスジェニックＤＮＡ（１１配列番号１０は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオ，２４８ヌクレオチド）、および挿入トランスジェニッチド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベクＤＮＡに隣接（近接）する３’ゲノムＤＮＡのセグメントＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡント（５００ヌクレオチド）を表す。のセグメント（８３ヌクレオチド）と挿入トランスジェ配列番号２は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチニックＤＮＡに近接する３’ゲノムＤＮＡのセグメントド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベン 20 （２５５ヌクレオチド）とを表す。トＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡに【００２７】近接する５’ゲノムＤＮＡのセグメント（５００ヌクレ配列番号１１は、酵母Ｓｎｆ７にオルソロガスなＥＳＣオチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡの境界残余部ＲＴ−ＩＩＩ複合体サブユニットをコードするＤｉａｂ（２６３ヌクレオチド）とを表す。ｒｏｔｉｃａ配列番号３は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチａ（ウエスタンコーンルートワーム）由来のｃＤＮＡ配ド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベン列のヌクレオチド配列である。トＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡの配列番号１２は、逆方向反復ＲＮＡ分子を発現するよう境界残余部（１５ヌクレオチド）と挿入ゲノムＤＮＡにに工学的に操作された組換え遺伝子を含むＤＮＡ発現カ近接する３’ゲノムＤＮＡのセグメント（５００ヌクレセットのアンチセンス鎖を表すヌクレオチド配列であるオチド）とを表す。 30 ｖｉｒｇｉｆｅｒａｖｉｒｇｉｆｅｒ。逆方向反復ＤＮＡセグメントは位置６６３∼９０２と配列番号４は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチ位置１２９２∼１０５３とに対応する。これらの逆方向ド配列であり、イベントＭＯＮ８７４１１の挿入ゲノム反復ＤＮＡ配列は配列番号１１のヌクレオチド位置１５ＤＮＡ（１１２４８ヌクレオチド）を表す。１∼３９０のヌクレオチド配列に対応する。配列番号５は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチ配列番号１３は、配列番号１２に示すＤＮＡから転写さド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベンれるリボヌクレオチド配列である。トＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡに配列番号１４は、コーンルートワーム毒性Ｃｒｙ３Ｂｂ近接する５’ゲノムＤＮＡのセグメント（５０ヌクレオタンパク質をコードし発現するように工学的に操作されチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡの境界残余部（た組換え遺伝子を含むＤＮＡ発現カセットのセンス鎖を２６３ヌクレオチド）とを表す。【００２６】表すヌクレオチド配列である。 40 配列番号１５は、配列番号１４の位置１５２２∼３４８配列番号６は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチ０に対応するポリヌクレオチドのアミノ酸配列翻訳であド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベンって、コーンルートワーム毒性Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質トＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡにを表す。近接する’５ゲノムＤＮＡのセグメント（１１０ヌクレ【００２８】オチド）と挿入トランスジェニックＤＮＡの境界残余部配列番号１６は、５−エノールピルビルシキミ酸−３− （２６３ヌクレオチド）とを表す。リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）タンパク質をコードし配列番号７は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオチ発現するように工学的に操作された組換え遺伝子を含むド接合部配列であり、５’から３’に向かって、イベンＤＮＡ発現カセットのセンス鎖を表すヌクレオチド配列トＭＯＮ８７４１１の挿入トランスジェニックＤＮＡにである。近接する５’ゲノムＤＮＡのセグメント（１４５ヌクレ 50 配列番号１７は、配列番号１６の位置２１８６∼３７８ ( 14 ) JP 25 2015-519051 A 2015.7.9 26 １に対応するポリヌクレオチドのアミノ酸配列翻訳であ８４に対応する。この配列を呈するアンプリコンは、一って、除草剤グリホサートに対して非感受性を呈するＥ対のプライマー、例えばＳＱ２７０６６およびＳＱ２６ＰＳＰＳタンパク質を表す。９７７で増幅することができ、イベントＭＯＮ８７４１配列番号１８は、ＳＱ２７０１１と呼ばれる合成オリゴ１に特徴的である。ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の【００３０】位置４６２∼４９０に対応するヌクレオチド配列と同一配列番号２６は、ＤＮＡコンストラクト＃４１７を表すである。ヌクレオチド配列である。配列番号１９は、ＰＢ３５５２と呼ばれる合成オリゴヌ配列番号２７は、ＤＮＡコンストラクト＃４１６を表すクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の位ヌクレオチド配列である。置５０２∼５１５に対応するヌクレオチド配列の逆相補 10 配列番号２８は、ＤＮＡコンストラクト＃４１８を表す体と同一である。ＰＢ３５５２は、一対の熱増幅プライヌクレオチド配列である。マー、例えばＳＱ２７０１１およびＳＱ９０８５と組み配列番号２９は、ＤＮＡコンストラクト＃４１９を表す合わせて使用するために、６−カルボキシフルオレセイヌクレオチド配列である。ン成分（６−ＦＡＭ（商標））で５’標識し、クエンチ配列番号３０は、ＤＮＡコンストラクト＃４０２を表すャー成分で３’標識することができ、トウモロコシイベヌクレオチド配列である。ントＭＯＮ８７４１１配列番号３１は、ＤＮＡコンストラクト＃４０３を表すＤＮＡを含有する生物学的試料中のイベントＭＯＮ８７４１１ＤＮＡの存在を検出するヌクレオチド配列である。ために、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＤＮＡ増幅方法で使配列番号３２は、ＤＮＡコンストラクト＃４０４を表す用することができる。ヌクレオチド配列である。配列番号２０は、ＳＱ９０８５と呼ばれる合成オリゴヌ 20 配列番号３３は、ＤＮＡコンストラクト＃４２３を表すクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の位ヌクレオチド配列である。置５１６∼５４１に対応するヌクレオチド配列の逆相補配列番号３４は、ＤＮＡコンストラクト＃４０５を表す体と同一である。ヌクレオチド配列である。【００２９】配列番号３５は、ＤＮＡコンストラクト＃４０６を表す配列番号２１は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオヌクレオチド配列である。チド配列であり、配列番号１の位置４６２∼５４１に対【００３１】応する。この配列を呈するアンプリコンは、一対の熱増配列番号３６は、ＤＮＡコンストラクト＃８９０を表す幅プライマー、例えばＳＱ２７０１１およびＳＱ９０８ヌクレオチド配列である。５を使って作製することができる。配列番号３７は、イベントＭＯＮ８７４１１の野生型ア配列番号２２は、ＳＱ２７０６６と呼ばれる合成オリゴ 30 レルを表すＬＨ２４４トウモロコシ植物のヌクレオチドヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の配列である。このヌクレオチド配列を呈するアンプリコ位置１１７１０∼１１７２８に対応するヌクレオチド配ンは一対のＰＣＲプライマー、例えばＳＱ２７０１１お列と同一である。よびＳＱ２６９７７で作製することができ、イベントＭ配列番号２３は、ＰＢ１１３００と呼ばれる合成オリゴＯＮ８７４１１の野生型アレルに特徴的である。ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の配列番号３８は、ＳＱ２０２２１と呼ばれる合成オリゴ位置１１７３１∼１１７５５に対応するヌクレオチド配ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。列と同一である。ＰＢ１１３００は、６−カルボキシフ配列番号３９は、ＰＢ１００６５と呼ばれる合成オリゴルオレセイン成分（６−ＦＡＭ（商標））で５’標識しヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ＰＢ１００６、クエンチャー成分で３’標識することができる。こう５は、ＶＩＣ（商標）で５’標識し、クエンチャー成分して標識されたＰＢ１１３００は、ＴＡＱＭＡＮ（登録 40 で３’標識することができる。こうして標識されたＰＢ商標）アッセイでイベントＭＯＮ８７４１１を検出する１００６５は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイでトために、一対のＰＣＲプライマー、例えばＳＱ２７０６ウモロコシの内在性遺伝子のセグメントの存在を検出す６およびＳＱ２６９７７と組み合わせて使用することがるために、一対のＰＣＲプライマー、例えばＳＱ１００できる。６５およびＳＱ２０２２２と組み合わせて使用すること配列番号２４は、ＳＱ２６９７７と呼ばれる合成オリゴができる。ヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、配列番号１の配列番号４０は、ＳＱ２０２２２と呼ばれる合成オリゴ位置１１７５６∼１１７８４に対応するヌクレオチド配ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。列の逆相補体と同一である。配列番号４１∼５２は、配列番号１の領域のヌクレオチ配列番号２５は、イベントＭＯＮ８７４１１のヌクレオド配列であり、各配列番号は、図３に関する簡単な説明チド配列であり、配列番号１の位置１１７１０∼１１７ 50 で詳述した介在配列と発現カセット要素とによって形成 ( 15 ) JP 27 2015-519051 A 2015.7.9 28 される接合部を包含する。，８１９）と交配することによる組み合わせも開示され【００３２】ている。そのような組み合わせには、トウモロコシゲノ詳細な説明ム内の複数の異なる座位および複数の染色体上に位置す本発明者らは、既存のトランスジェニックトウモロコシるこれら複数の形質を、まとめて単一のトウモロコシ植植物と比べて優れた性質および成績を呈するトランスジ物に導入し、これらの形質を、何百とはいわないまでもェニックトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を同定何十という異なるトウモロコシ生殖質品種に、雑種としした。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１は、作動て維持することの必要に関連する課題がつきまとう。そ的に連結された３つの発現カセットを含有し、これらののような課題の解決策は、これらの形質の組み合わせをカセットは全体として、トランスジェニックイベントＭ、まとめて単一の座位に含めることであるだろう。本発ＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ細胞、トウモロ 10 明者らは、ここに、この課題に対するそのような解決策コシ組織、トウモロコシ種子およびトウモロコシ植物にの一つを、共有結合で連結された３つの発現カセットを、コーンルートワーム抵抗性およびグリホサート除草剤トウモロコシゲノム内の単一の座位に併せもつトウモロ耐性の形質を付与する。トウモロコシイベントＭＯＮ８コシイベントＭＯＮ８７４１１の形態で提供するもので７４１１は、コーンルートワーム病害虫種（Ｄｉａｂｒあり、これらの発現カセットは、トランスジェニックイｏｔｉｃａ種を含む；とりわけ病害虫がＤｉａｂｒｏｔベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ細胞、ｉｃａｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウトウモロコシ組織、トウモロコシ種子およびトウモロコエスタンコーンルートワーム、ＷＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏシ植物に、コーンルートワーム抵抗性およびグリホサーｔｉｃａト除草剤耐性の形質を付与する。トウモロコシイベントｖｉｒｇｉｆｅｒａｂａｒｂｅｒｉ（ノーザンコーンルートワーム、ＮＣＲ）、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａｒａｖｉｒｇｉｆｅｚｅａｅ（メキシカンコーンルートワーム、ＭＣ 20 Ｒ）、ＤｉａｂｒｏｔｉｃａＭＯＮ８７４１１の使用により、トウモロコシ栽培者は、ａ）２つの異なるコーンルートワーム抵抗性作用機序ｂａｌｔｅａｔａ（ブラを用意することによる、コーンルートワーム幼虫に起因ジリアンコーンルートワーム（ＢＺＲ）もしくはＤｉａする経済的損失からの保護、およびｂ）広スペクトル雑ｂｒｏｔｉｃａｖｉｒｉｄｕｌａとＤｉａｂｒｏｔｉ草防除のためにトウモロコシ作物にグリホサート含有農ｃａｓｐｅｃｉｏｓａとからなるブラジリアンコーン業用除草剤を施用することができることという、大きなルートワーム複合体（ＢＣＲ）、またはＤｉａｂｒｏｔ利益を得る。加えて、コーンルートワーム耐性形質とグｉｃａｈｏｗａｒリホサート耐性形質をコードするトランスジーンは同じｄｉｉ（サザンコーンルートワーム、ＳＣＲ）である場ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａＤＮＡセグメント上で連結されており、ＭＯＮ８７４１合）に対して、２つの作用機序を提供する。当技術分野１のゲノム中の単一座位に見いだされるので、それが育では、他に、一つずつ付与されるさまざまな実施形態を種効率の強化をもたらし、また育種個体群およびその後与えるトランスジェニックトウモロコシイベント、例え 30 代においてトランスジーンインサートを追跡するためにばＭＯＮ８６３（Ｃｒｙ３Ｂｂ殺虫性毒素タンパク質の分子マーカーを使用することを可能にする。発現によってコーンルートワームに対する抵抗性の形質【００３３】を付与するもの）、またはトウモロコシイベントＭＯＮトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１は、プラスミド８８０１７（Ｃｒｙ３Ｂｂ殺虫性毒素タンパク質の発現コンストラクトｐＭＯＮ１２０４１７による近交系トウによるコーンルートワームに対する抵抗性の形質とグリモロコシ系統のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転ホサート非感受性ＥＰＳＰＳの発現によるグリホサート換プロセスによって作製された。このプラスミドコンス除草剤に対する抵抗性の形質とを付与するもの）やトウトラクトは、連結された植物発現カセットを、ＣＰ４モロコシイベントＤＡＳＥＰＳＰＳタンパク質、ならびにＣｒｙ３Ｂｂタンパク５９１２２−７（Ｃｒｙ３４／Ｃｒｙ３５とも呼ばれる二元Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈ質、およびトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素ＰＳ１４９Ｂ１の発現によ 40 有するトウモロコシ細胞がコーンルートワームの食物にるコーンルートワームに対する抵抗性の形質と除草剤グ入れて提供された時にコーンルートワームの細胞においルホシネートに対する耐性の形質とを付与するもの）のて必須遺伝子を抑制のターゲットとするｄｓＲＮＡのト場合のように、２つ以上の形質を与えるトランスジェニウモロコシ植物細胞における発現に必要な調節遺伝要素ックトウモロコシイベントも言及されている。他に、トと共に含有する。トウモロコシ細胞を完全なトウモロコウモロコシイベントＭＯＮ８８０１７またはＤＡＳ５シ植物に再生させ、植物の個体群から、植物発現カセッ９１２２−７によって付与される形質を、ルートワームトの完全性ならびにグリホサートおよびコーンルートワの生存にとって不可欠なコーンルートワーム遺伝子を抑ーム幼虫食害に対する抵抗性を示す個々の植物を選択し制のターゲットとするｄｓＲＮＡの発現によってもたらた。トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１中に存在すされるコーンルートワーム抵抗性の形質を付与するトラる連結された植物発現カセットをそのゲノムに含有するンスジェニックトウモロコシイベント（ＵＳ７，９４３ 50 トウモロコシ植物は、本発明の一態様である。 ( 16 ) JP 29 2015-519051 A 2015.7.9 30 【００３４】トウモロコシ植物イベントＭＯＮ８７４１１中の挿入トトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１のゲノムに挿入ランスジーンＤＮＡの全ＤＮＡ配列（配列番号１）を決されたプラスミドＤＮＡを詳細な分子解析によって特徴定した。づけた。これらの解析には、インサート数（トウモロコ【００３５】シゲノム内の組み込み部位の数）、コピー数（１つの座トランスジェニックイベントＭＯＮ８７４１１の作製に位内のＴ−ＤＮＡのコピー数）、およびトランスジェニ使用したコンストラクトを使って数十のトランスジェニック挿入ＤＮＡの完全性が含まれた。トウモロコシゲノックイベントを作製した。また、異なるコンストラクトムに挿入されてイベントＭＯＮ８７４１１を生じさせるを作製し、それらを使って、何十という他のトランスジ連結された３つの発現カセットを含有するプラスミドコェニックトウモロコシイベントを作製し、それらをＭＯンストラクトは、トウモロコシゲノムにも、トウモロコ 10 Ｎ８７４１１および類似のイベントと比べた。これらのシの他のベクターもしくはトランスジェニックイベントイベントを全て、トランスジェニックトウモロコシ植物にも、それ以外にも、自然に出現することは知られていイベント組織をコーンルートワーム幼虫の食物に入れてない複数のセグメント（いくつかの発現カセットを製作提供する食物バイオアッセイにおいて、コーンルートワまたは構築するために使用された要素間の接合部配列）ームの防除に関する効力について試験した。さまざまなを含有する（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番イベントにコーンルートワーム抵抗性形質を付与する原号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号因となる２つの異なる発現カセットの発現の配向は、こ７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０；配列番号れらの抵抗性形質を発現するトウモロコシイベント細胞１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配をコーンルートワーム幼虫の食物に入れて提供した時に列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４コーンルートワーム防除をもたらすイベントの効力にと３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列 20 って、決定的に重要であることが決定された。２つの異番号５０、配列番号５１、および配列番号５２に示す配なるプロモーターＣＡＭＶ列）。加えて、イベントＭＯＮ８７４１１中の挿入トラＩＧは、ｅ３５ＳプロモーターからｄｓＲＮＡコーンルンスジェニックＤＮＡを生じさせる形質転換イベントはートワーム保護物質を発現し、ｅ３５Ｓプロモーターに、ここに、トウモロコシゲノム中の単一座位への挿入で近接しかつ同プロモーターから分岐しているＺｍ．ＰＩあって、挿入ＤＮＡとトウモロコシゲノムＤＮＡとの間ＩＧプロモーターからＣｒｙ３Ｂｂコーンルートワームに、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシゲノ毒性タンパク質を発現する発現カセットを含有するトウムだけにユニークたりうる十分な長さを有する、２つのモロコシイベントの、驚くべき優れた効力をもたらすこ新しい座位または接合部配列（追加の接合部配列）をもとが観察された。これらのプロモーターがこの特定の配たらすものであると特徴づけられる。これらの接合部配向にあると、効力を呈するトランスジェニックイベント列は、トウモロコシ細胞、組織、種子および植物または 30 の割合が著しく改善された。植物製品（コモディティー製品）におけるイベントＭＯ【００３６】Ｎ８７４１１本明細書に別段の注記がある場合を除き、用語は、関連ＤＮＡの存在を検出するのに役立つ。イベントＭＯＮ８７４１１ｅ３５ＳおよびＺｍ．ＰＩＤＮＡを含有するトウモロコ技術分野における通常の技能を有する者による従来の用シ細胞、種子、植物部分または植物組織を含有するか含法に従って理解されるものとする。分子生物学における有すると疑われる生物学的試料中のこれらさまざまな接一般的用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒら「Ｇｌｏｓｓａｒ合部セグメントの存在を同定するために開発されたＤＮｙｏｆＡ分子プローブおよびプライマー対を、本明細書に記載ａｎｄする。データは、イベントＭＯＮ８７４１１が単一のＴｒ−Ｖｅｒｌａｇ：ニューヨーク、１９９１）およびＬ −ＤＮＡ挿入を持ち、挿入されたトランスジェニックＤｅｗｉｎ「ＧｅｎｅｓＮＡが１コピーであることを示している。トウモロコシ 40 ｅｒｓｉｔｙゲノムへの植物形質転換プラスミドからのトランスジェに見いだすこともできる。本明細書において使用する用ニックＤＮＡ導入に使用されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ語「トウモロコシ」はＺｅａｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ左および右境界領域の一Ｎ８７４１１を含むトウモロコシ植物と交配することが部分以外の形質転換ベクターｐＭＯＮ１２０７１４からできる全ての植物品種を包含する。本明細書において使の追加要素は、イベントＭＯＮ８７４１１中に同定され用する用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「をていない。最後に、試料中の上記イベントＭＯＮ８７４含むが、それらに限定されるわけではない（ｉｎｃｌｕ１１ｄｉｎｇＤＮＡの存在に特徴的である特異的アンプリコンＧｅｎｅｔｉｃｓ：ＣｌａｓｓｉｃａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒ」第５版（ＳｐｒｉｎｇｅＶ」（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖＰｒｅｓｓ：ニューヨーク、１９９４）ｂｕｔｎｏｔｍａｙｓを意味し、ＭＯｌｉｍｉｔｅｄｔｏ）」を作製する熱増幅とＤＮＡ配列解析とを行って、随意にを意味する。割り当てられた５’および３’インサート−植物ゲノム【００３７】接合部を決定し、インサート内の要素の構成を確認し、 50 本発明は、少なくとも３つの発現カセット、すなわち、 ( 17 ) JP 31 2015-519051 A 2015.7.9 32 酵母ｓｎｆ７遺伝子にオルソロガスなコーンルートワー核酸またはリボ核酸だけでなく、ターゲットＤＮＡ配列ム必須遺伝子を抑制するように設計されたコーンルートに特異的に結合し、そのターゲットＤＮＡ配列の存在をワーム毒性量のｄｓＲＮＡを発現する第１発現カセット検出するために使用することができる、ポリアミドおよ、コーンルートワーム毒性量のＣｒｙ３Ｂｂδ−エンドび他のプローブ材料も含まれる。トキシンを発現する第２発現カセット、およびグリホサ【００４０】ート阻害に対して非感受性であるグリホサート耐性酵素ＤＮＡプライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによＣＰ４ＥＰＳＰＳを発現する第３発現カセットを含有って相補的ターゲットＤＮＡ鎖にアニールすることでプするＤＮＡコンストラクトで形質転換された、トランスライマーとターゲットＤＮＡ鎖とのハイブリッドを形成ジェニック植物を提供する。本明細書において開示するし、次にポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼによ方法に従って、本明細書に開示するＤＮＡコンストラク 10 って、ターゲットＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離さトで形質転換されたトウモロコシ植物は、ＣＲＷに対しれたポリ核酸である。本発明のＤＮＡプライマー対またて抵抗性であり、グリホサート除草剤の施用に対して耐はＤＮＡプライマーセットは、例えばポリメラーゼ連鎖性である。連結された農業形質は、育種個体群内にこれ反応（ＰＣＲ）または他の従来のポリ核酸増幅方法によらの形質をまとめて維持することを容易にし、単一のコるターゲット核酸配列の増幅に役立つ２つのＤＮＡプラーンルートワーム阻害遺伝子だけを含有する植物またはイマーを指す。育種素材として組み合わされた同じコーンルートワーム【００４１】阻害遺伝子（Ｃｒｙ３ＢｂおよびｄｓＲＮＡ）を含有すＤＮＡプローブおよびＤＮＡプライマーは、一般的にはる植物よりも高いコーンルートワーム効力を呈する。、長さが１１ポリヌクレオチド以上、多くの場合、１８【００３８】ポリヌクレオチド以上、２４ポリヌクレオチド以上、まトランスジェニック「植物」は、異種ＤＮＡ、すなわち 20 たは３０ポリヌクレオチド以上である。そのようなプロ目的のトランスジーンを含むポリ核酸コンストラクトにーブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブよる植物細胞の形質転換、植物細胞のゲノムへのトランリダイゼーション条件下でターゲット配列に特異的にハスジーンの挿入によって得られる植物の個体群の再生、イブリダイズするのに十分な長さであるように選択されおよび特定ゲノム位置への挿入を特徴とする特定植物のる。本発明のプローブおよびプライマーは、好ましくは選択によって作製される。「イベント」という用語は、、ターゲット配列との完全な配列類似性を有するが、タ異種ＤＮＡを含む最初の形質転換体植物およびその形質ーゲット配列とは異なるプローブであって、ターゲット転換体の後代を指す。「イベント」という用語は、イベ配列にハイブリダイズする能力を保っているものを、従ントと別の植物との間の有性異系交雑によって作製され来の方法で設計することもできる。る、異種ＤＮＡを含む後代も包含する。反復親への反復【００４２】戻し交雑後でも、形質転換親イベントからの挿入ＤＮＡ 30 本明細書に開示する隣接ゲノムＤＮＡおよびインサートおよび隣接ゲノムＤＮＡは、交雑の後代において、同じ配列に基づくプライマーおよびプローブは、従来の方法染色体位置に存在する。「イベント」という用語は、挿、例えば当該ＤＮＡ分子の再クローニングおよび配列決入ＤＮＡと挿入ＤＮＡにじかに近接する隣接ゲノム配列定などによって、開示されたＤＮＡ配列を確認（そしてとを含む最初の形質転換体からのＤＮＡであって、挿入必要であれば修正）するために使用することができる。ＤＮＡを含む一方の親系統（例えば最初の形質転換体お【００４３】よび自殖によって得られる後代）と挿入ＤＮＡを含有し本発明の核酸プローブおよびプライマーはストリンジェない親系統との有性交雑の結果として目的のトランスジントな条件下でターゲットＤＮＡ分子にハイブリダイズーンを含む挿入ＤＮＡを受け取る後代に導入されると予する。試料中のトランスジェニック植物からのＤＮＡの想されうるものも指す。本発明は、ＭＯＮ８７４１１を存在を同定するには、従来の任意の核酸ハイブリダイゼ含むトランスジェニックイベントトウモロコシ植物、そ 40 ーション法または増幅方法を使用することができる。ポの後代、およびそこに含まれるＤＮＡ組成物に関する。リ核酸分子（核酸セグメントともいう）またはそのフラ【００３９】グメントは、一定の状況下で他の核酸分子に特異的にハ「プローブ」は、従来の検出可能ラベルまたはレポータイブリダイズする能力を有する。本明細書では、２つのー分子、例えば放射性同位体、リガンド、化学発光剤、ポリ核酸分子が逆平行二本鎖核酸構造を形成する能力をまたは酵素が取り付けられている単離された核酸である有するのであれば、それら２つの分子は互いに特異的に。そのようなプローブはターゲット核酸の鎖に、本発明ハイブリダイズする能力を有するという。ある核酸分子の場合であればＭＯＮ８７４１１からのゲノムＤＮＡのがもう一つの核酸分子の「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ鎖に、それがＭＯＮ８７４１１植物からであるか、ＭＯｔ）」であるといわれるのは、それらが完全な相補性をＮ８７４１１呈する場合である。本明細書では、一方の分子の全てのＤＮＡを含む試料からであるかを問わず、相補的である。本発明のプローブには、デオキシリボ 50 ヌクレオチドが他方の分子のヌクレオチドに相補的であ ( 18 ) JP 33 2015-519051 A 2015.7.9 34 る場合に、それらの分子は「完全な相補性」を呈すると１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１いう。２つの分子が、少なくとも従来の「低ストリンジ４、１６、２１、２５、４１、４２、４３、４４、４５ェンシー」条件下で互いにアニールした状態を保つこと、４９、５０、５１、または５２に示す核酸分子もしくができるほど十分な安定性で互いにハイブリダイズするはその相補体またはどちらかのフラグメントの１つ以上ことができる場合、それら２つの分子は「最低限に相補に、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダ的」であるという。また、従来の「高ストリンジェンシイズするであろう。本発明の一態様では、好ましい本発ー」条件下で互いにアニールした状態を保つことができ明のマーカー核酸分子が、配列番号１、または配列番号るほど十分な安定性で互いにハイブリダイズすることが２、または配列番号３、または配列番号４、または配列できる場合、それらの分子は「相補的」であるという。番号５、または配列番号６、または配列番号７、または従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら 10 配列番号８、または配列番号９、または配列番号１０；（１９８９）およびＨａｙｍｅｓら「Ｎｕｃｌｅｉｃまたは配列番号１２、または配列番号１４、または配列ＡｃｉｄＡＰｒ番号１６、または配列番号２１、または配列番号２５、Ｈｙｂｒｉｄａｉｚａｔｉｏｎ，ａｃｔｉｃａｌＰｒｅまたは配列番号４１、または配列番号４２、または配列ｓｓ、ワシントンＤＣ（１９８５））に記載されている番号４３、または配列番号４４、または配列番号４５、。したがって完全な相補性からの逸脱は、その逸脱が二または配列番号４９、または配列番号５０、または配列本鎖構造を形成する分子の能力を完全に妨げるものでな番号５１、または配列番号５２に示す核酸配列もしくはい限り、許容される。ある核酸分子がプライマーまたはその相補体またはどちらかのフラグメントを有する。タプローブとして役立つには、使用する特定溶媒および特ーゲットＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーシ定塩濃度において安定な二本鎖構造を形成することがでョンは、当業者に知られているいくつもの方法で検出すきるように、配列が十分に相補的でありさえすればよい 20 ることができ、例えば限定するわけではないが、蛍光タ。グ、放射性タグ、抗体ベースのタグ、および化学発光タ【００４４】グを挙げることができる。本明細書にいう実質的に相同な配列とは、比較しようと【００４５】している核酸配列の相補体に高ストリンジェンシー条件特定増幅プライマー対を使った（例えばＰＣＲによる）下で特異的にハイブリダイズするであろう核酸配列であターゲット核酸配列の増幅に関して、「ストリンジェンる。例えば約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエントな条件」とは、ＤＮＡ熱増幅反応において、対応する酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、５０℃の２．０×ＳＳＣ野生型配列（またはその相補体）を有するプライマーがで洗浄などといった、ＤＮＡハイブリダイゼーションを結合して、好ましくはユニークな増幅産物、アンプリコ促進する適当なストリンジェンシー条件は当業者に知らンを作製するターゲット核酸配列だけに、プライマー対れているか、「Ｃｕｒｒｅｎｔがハイブリダイズすることを許す条件である。ｎＡｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｉｌｅｙ＆Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉ 30 Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ【００４６】Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８９「（ターゲット配列）に特異的」という用語は、プロー））の６．３．１−６．３．６に見いだすことができるブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダ。例えば洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃で約２イゼーション条件下で、ターゲット配列を含む試料中の．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃で約ターゲット配列だけにハイブリダイズすることを示す。０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択するこ【００４７】とができる。加えて、洗浄ステップにおける温度を、室本明細書にいう「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリ温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６コン」とは、ポリ核酸テンプレートの一部であるターゲ５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加させることがットポリ核酸分子に向けられたポリ核酸増幅方法の産物できる。温度と塩の両方を変動させるか、または温度も 40 を指す。しくは塩濃度のどちらか一方を一定に保った上で、他方例えば、有性交雑の結果生じたトウモロコシ植物が、本の変数を変化させることができる。好ましい一実施形態発明のＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植物からのでは、本発明のポリ核酸が、配列番号１、２、３、４、トランスジェニック植物ゲノムＤＮＡを含有するかどう５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、２１、かを決定するには、ＭＯＮ８７４１１植物ＤＮＡの存在２５、４１、４２、４３、４４、４５、４９、５０、５に特徴的であるアンプリコンを作製するために、トウモ１、または５２に示す核酸分子もしくはその相補体またロコシ植物組織試料から抽出されたＤＮＡを、ＭＯＮ８はどちらかのフラグメントの１つ以上に、中等度にスト７４１１を含む植物のゲノム中の挿入異種ＤＮＡ（トラリンジェントな条件下で、例えば約２．０×ＳＳＣおよンスジーンＤＮＡ）の挿入部位に近接するＤＮＡ配列にび約６５℃で、特異的にハイブリダイズするであろう。由来するプライマーと、挿入異種ＤＮＡに由来する第２特に好ましい実施形態では、本発明の核酸が、配列番号 50 のプライマーとを含むプライマー対を使ったポリ核酸増 ( 19 ) JP 35 2015-519051 A 2015.7.9 36 幅方法に付すことができる。特徴的アンプリコンは、植条件下で特徴的アンプリコンを増幅する、ＤＮＡプライ物ゲノムＤＮＡに特徴的でもある長さとＤＮＡ配列を有マー分子が含まれる。本キットは、アガロースゲルベーする。アンプリコンの長さは、プライマー対の長さを合スの検出方法、または当技術分野で知られているいくつわせたもの＋１ヌクレオチド塩基対から、好ましくは＋もの特徴的アンプリコン検出方法を提供しうる。配列番約５０ヌクレオチド塩基対、より好ましくは＋約２５０号１に示すトウモロコシゲノム領域の任意の部分およびヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは＋約４５０ヌク配列番号１に示す挿入トランスジェニックＤＮＡの任意レオチド塩基対またはそれ以上に及びうる。あるいは、の部分に相同または相補的なＤＮＡプライマーを含むキプライマー対は、インサートポリヌクレオチド配列全体ットは、本発明の一目的である。ＤＮＡ増幅の技術分野を含むアンプリコンが作製されるように、挿入異種ＤＮの当業者であれば、開示されたＭＯＮ８７４１１のトラＡの両側にあるゲノム配列に由来することもできる（例 10 ンスジーン／ゲノムＤＮＡ配列（配列番号１）から、Ｄえば配列番号１のゲノム部分から単離されたフォワードＮＡプライマーとして役立つＤＮＡ分子を選択することプライマーと、イベントＭＯＮ８７４１１ゲノム中の本ができる。明細書に特定する接合部配列を含むＤＮＡ分子を増幅す【００５０】る配列番号１のゲノム部分から単離されたリバースプラこれらの方法によって作製された特徴的アンプリコンはイマー）。挿入トランスジェニックＤＮＡに近接する植、多数の技法によって検出することができる。そのよう物ゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿な技法の一つが遺伝子ビット解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ入ＤＮＡ配列から、ある距離に位置し、この距離は１ヌｉｔクレオチド塩基対から約２０００ヌクレオチド塩基対まＮｕｃｌｅｉｃでに及ぶことができる。「アンプリコン」という用語を −４１７５，使用する場合、ＤＮＡ熱増幅反応中に形成されうるプラ 20 隣接ゲノムＤＮＡ配列と挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバイマー二量体は、特に除外される。ーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される。【００４８】オリゴヌクレオチドはマイクロタイタープレートのウェポリ核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含ルに固定化される。（挿入配列中の１プライマーと、近む当技術分野において知られるさまざまなポリ核酸増幅接する隣接ゲノム配列中の１プライマーとを用いる）関方法のいずれかによって達成することができる。増幅方心領域のＰＣＲ後に、一本鎖ＰＣＲ産物を固定化オリゴ法は当技術分野では知られており、とりわけ、米国特許ヌクレオチドにハイブリダイズさせ、それを、ＤＮＡポ第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２リメラーゼと、予想される次の塩基に特異的な標識ジデ号ならびに「ＰＣＲＡＧｕオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）とを使ったＡｐｐｌｉｃ１塩基伸長反応のテンプレートとして、役立たせることｉｄｅｔｏＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＢＡｎａｌｙｓｉｓ）（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら，ＡｃｉｄＲｅｓ．２２：４１６７１９９４）であり、ここでは、近接するａｔｉｏｎｓ」（Ｉｎｎｉｓら編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰ 30 ができる。読出しは、蛍光に基づくか、ＥＬＩＳＡに基ｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９０）に記載されているづくことができる。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼ。２２ｋｂ（キロベース）までのゲノムＤＮＡおよび４ーション、および１塩基伸長の成功により、トランスジ２ｋｂまでのバクテリオファージＤＮＡを増幅するためーン／ゲノム配列の存在を示す。のＰＣＲ増幅方法が開発されている（Ｃｈｅｎｇら，【００５１】Ｐｒｏｃ．もう一つの方法は、Ｗｉｎｇｅによって記載されたパイＡＮａｔｌ．Ａｃａｄ．９１：５６９５−５６９９，Ｓｃｉ．ＵＳ１９９４）。本発明ロシーケンシング技法である（Ｉｎｎｏｖ．Ｔｅｃｈ．００：１８−２４，Ｐｈａｒを実施する際には、これらのＤＮＡ増幅方法および当技ｍａ．術分野で知られている他のＤＮＡ増幅方法を使用するこ。この方法では、近接ゲノムＤＮＡおよびインサートＤ２０００）とができる。イベントＭＯＮ８７４１１からの異種ＤＮＮＡ接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドがＡインサートの配列または隣接ゲノムＤＮＡ配列は、Ａ 40 設計される。オリゴヌクレオチドを関心領域からの一本ＴＣＣに寄託された、受託番号がＰＴＡ−１２６６９で鎖ＰＣＲ産物（挿入配列中の１プライマーと、隣接ゲノある、イベントＭＯＮ８７４１１を含む種子、またはそム配列中の１プライマー）にハイブリダイズさせ、ＤＮの種子から生長させた植物から、当該ＤＮＡ分子を、こＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラこに提供する配列に由来するプライマーを使って増幅しーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸およびルた後、ＰＣＲアンプリコンまたはそのクローン化ＤＮＡシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰがフラグメントの標準的なＤＮＡ配列決定によって、検証個別に加えられ、組込みがもたらす光シグナルが測定さ（そして必要であれば修正）することができる。れる。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション、【００４９】および１塩基または多塩基伸長の成功により、トランスＤＮＡ増幅方法に基づくＤＮＡ検出キットには、ターゲジーン／ゲノム配列の存在を示す。ットＤＮＡに特異的にハイブリダイズして、適当な反応 50 【００５２】 ( 20 ) JP 37 ９：４９２−４９８， A 2015.7.9 38 Ｃｈｅｎらが記載する蛍光偏光（Ｇｅｎｏｍｅ． 2015-519051 Ｒｅｓ本明細書に開示する組成物とＤＮＡ検出の技術分野にお１９９９）は、本発明のアいて周知の方法とを使って、ＤＮＡ検出キットを開発すンプリコンを検出するために使用することができる一方ることができる。キットは試料中のトウモロコシイベン法である。この方法では、ゲノム隣接および挿入ＤＮＡトＭＯＮ８７４１１接合部とオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計７４１１される。オリゴヌクレオチドを関心領域からの一本鎖Ｐるための方法に応用することができる。キットには、プＣＲ産物（挿入ＤＮＡ中の１プライマーと、隣接ゲノムライマーまたはプローブとして役立ち、かつ本明細書にＤＮＡ配列中の１プライマー）にハイブリダイズさせ、記載の配列番号１の少なくとも適用可能部分に相同またＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下は相補的な、ＤＮＡ分子が含まれる。これらのＤＮＡ分でインキュベートする。１塩基伸長がｄｄＮＴＰの組込 10 子はＤＮＡ増幅方法（ＰＣＲ）で使用するか、ポリ核酸みをもたらす。組込みは、蛍光計を使用して偏光の変化ハイブリダイゼーション法、すなわちサザン解析、ノーとして測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハザン解析においてプローブとして使用することができるイブリダイゼーション、および１塩基伸長の成功により。、トランスジーン／ゲノム配列の存在を示す。【００５６】【００５３】ＤＮＡの同定に役立ち、ＭＯＮ８ＤＮＡを含有するトウモロコシ植物を育種す接合部配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢ配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシテ列番号１０；配列番号２１、配列番号２５、配列番号４ィ）は、製造者が提供する説明書では、ＤＮＡ配列の存１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列在を検出し定量する方法と記載され、よく理解されてい番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１る。簡単に述べると、ゲノム隣接およびインサートＤＮ 20 、および配列番号５２からなる群からの配列によって表Ａ接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオすことができる。例えば接合部配列は、随意に、配列番チドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰ号５および配列番号８として提供されるヌクレオチド配ＣＲプライマー（インサートＤＮＡ配列中の１プライマ列によって表すことができる。あるいは接合部配列は、ーと、隣接ゲノム配列中の１プライマー）を耐熱性ポリ随意に、配列番号６および配列番号９として提供されるメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルさせる。Ｆヌクレオチド配列によって表すこともできる。あるいはＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションは、ＦＲＥＴ接合部配列は、随意に、配列番号７および配列番号１０プローブ上の消光成分からの蛍光成分の切断と放出をもとして提供されるヌクレオチド配列によって表すこともたらす。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーできる。これらのヌクレオチドはホスホジエステル結合ションの成功により、トランスジーン／ゲノム配列の存によってつながれ、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４在を示す。 30 【００５４】る。トウモロコシ植物、種子、または植物部分に由来すＴｙａｎｇｉら（Ｎａｔｕｒｅ：３０３−３０８，１１中では、組換え植物細胞ゲノムの一部として存在すＢｉｏｔｅｃｈ．１４る試料における配列番号１、配列番号２、配列番号３、１９９６）に記載されているよう配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配に、配列検出用の分子ビーコンが記述されている。簡単列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２、配に述べると、隣接ゲノムおよびインサートＤＮＡ接合部列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプロ３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列ーブが設計される。ＦＲＥＴプローブのユニークな構造番号５０、配列番号５１、または配列番号５２の１つ以により、プローブは、蛍光成分と消光成分とを極めて接上の同定は、そのＤＮＡがトウモロコシイベントＭＯＮ近した状態に保つ二次構造を含むことになる。ＦＲＥＴ８７４１１から得られたことを決定づけ、トウモロコシプローブとＰＣＲプライマー（インサートＤＮＡ配列中 40 イベントＭＯＮ８７４１１からのＤＮＡを含有する試料の１プライマーと、隣接ゲノム配列中の１プライマー）における存在に特徴的である。したがって本発明は、配を耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイク列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列ルさせる。ＰＣＲ増幅の成功に続いて、ターゲット配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションが、プ号９、配列番号１０、配列番号２１、配列番号２５、配ローブ二次構造の解除および蛍光成分と消光成分との空列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４間的分離をもたらす。その結果、蛍光シグナルが生じる４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーション番号５１、または配列番号５２として提供されるヌクレの成功により、隣接／トランスジーンインサート配列のオチド配列の少なくとも１つを含有するＤＮＡ分子を提存在を示す。供する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番【００５５】 50 号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号 ( 21 ) JP 39 2015-519051 A 2015.7.9 40 ８、配列番号９、配列番号１０、配列番号２１、配列番れぞれ、ＤＮＡプライマーとして機能して、熱増幅反応号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、においてトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１由来の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号テンプレートＤＮＡと共に、一緒に使用した場合に、試５０、配列番号５１、または配列番号５２として提供さ料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１れる配列の少なくとも１つを含むのに十分なトランスジに特徴的であるアンプリコンが作製されるように、十分ェニックトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１に由来な長さを持つ、ＤＮＡ配列の連続ヌクレオチドである。するＤＮＡの任意のセグメントは、本発明の範囲内であプライマーとして役立つ例示的ＤＮＡ分子を、配列番号る。加えて、この段落内に記載した配列のいずれかに相１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２補的な配列を含む任意のポリヌクレオチドも、本発明の範囲内である。４として提供する。 10 【００５７】本発明は、試料中の、イベントＭＯＮ８７４１１ＤＮＡ【００５９】「プローブ」は、ターゲット核酸の鎖に相補的な、単離ＤＮされた核酸である。プローブには、デオキシリボ核酸まＡを含むトウモロコシ植物由来のＤＮＡの存在を検出すたはリボ核酸だけでなく、ターゲットＤＮＡ配列に特異るためのプライマーまたはプローブとして使用すること的に結合するポリアミドおよび他のプローブ材料も含まができる例示的ＤＮＡ分子を提供する。そのようなプラれ、そのような結合の検出は、特定試料における当該タイマーまたはプローブはターゲット核酸配列に特異的でーゲットＤＮＡ配列の存在を診断、識別、決定、検出、あり、したがって、本明細書に記載する発明の方法によまたは確認するのに役立ちうる。プローブは、従来の検るトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１核酸配列の同出可能ラベルまたはレポーター分子、例えば放射性同位定に役立つ。体、リガンド、化学発光剤、または酵素に取り付けるこ【００５８】 20 とができる。プローブとして役立つ例示的ＤＮＡ分子を「プライマー」は、典型的には、熱増幅を伴う特異的ア配列番号１９および配列番号２３として提供する。ニーリングまたはハイブリダイゼーション法において使【００６０】用するために設計された高純度の単離ポリヌクレオチドプローブおよびプライマーは、ターゲット配列との完全である。な配列同一性を有しうるが、ターゲット配列とは異なるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの熱増幅では、アプライマーおよびプローブであって、ターゲット配列にンプリコンを作製するために、一対のプライマーをトウ優先的にハイブリダイズする能力を保っているものを従モロコシゲノムＤＮＡの試料などのテンプレートＤＮＡ来の方法によって設計することもできる。と共に使用することができ、そのような反応から作製さある核酸分子がプライマーまたはプローブとして役立つれたアンプリコンは、プライマーがテンプレートにハイには、使用する特定溶媒および特定塩濃度において安定ブリダイズした２つの部位の間にあるテンプレートＤＮ 30 な二本鎖構造を形成することができるように、配列が十Ａの配列に対応するＤＮＡ配列を有するであろう。本明分に相補的でありさえすればよい。従来の核酸ハイブリ細書にいう「アンプリコン」とは、増幅技法を使って合ダイゼーション法または増幅方法はいずれも、試料中の成されたＤＮＡの一片またはフラグメントである。本発トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１由来のトランス明のアンプリコンは、配列番号２１または配列番号２５ジェニックＤＮＡの存在を同定するために使用することとして提供される配列の少なくとも１つを含む。プライができる。プローブおよびプライマーは長さが一般に少マーは、典型的には、相補的ターゲットＤＮＡ鎖にハイなくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレブリダイズしてプライマーとターゲットＤＮＡ鎖のハイオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、もしくは少なブリッドを形成するように設計され、プライマーの存在くとも約３０ヌクレオチドまたはそれ以上である。そのは、ターゲットＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用するようなプローブおよびプライマーは、ストリンジェントプライマーの伸長（すなわち、伸びているヌクレオチド 40 なハイブリダイゼーション条件下でターゲットＤＮＡ配分子への追加ヌクレオチドの重合）を開始するための、列に特異的にハイブリダイズする。従来のストリンジェポリメラーゼによる認識点である。本明細書にいうプランシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびイマー対とは、プライマー対の個々のメンバーによる結Ｈａｙｍｅｓら「Ｎｕｃｌｅｉｃ合のターゲットとした位置に挟まれたポリヌクレオチドｉｄａｉｚａｔｉｏｎ，セグメントを典型的には熱増幅反応でまたは他の従来のｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ核酸増幅方法で線形に増幅するための、二本鎖ヌクレオＣ（１９８５））に記載されている。チドセグメントの反対の鎖に結合する２つのプライマー【００６１】の使用を指すものとする。この応用に役立つプライマー本明細書に開示するＤＮＡ分子またはそのフラグメント対は、第１ＤＮＡ分子および第１ＤＮＡ分子とは異なるを単離し操作するには、熱増幅方法を含めて、当業者に第２ＤＮＡ分子を含むべきであり、この場合、両者はそ 50 周知のいくつもの方法を使用することができる。ＤＮＡＡｃｉｄＨｙｂｒＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡＰｒｅｓｓ、ワシントンＤ ( 22 ) JP 41 2015-519051 A 2015.7.9 42 分子またはそのフラグメントは、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成装置を使ってよく実施されているように種子に、特許寄託物名（ＰａｔｅｎｔＤｅｐｏｓｉｔＤｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）ＰＴＡ−１２６６９を割り、そのフラグメントを化学的手段で直接合成することな当てている。ど、他の技法によって取得することもできる。【００６５】【００６２】本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列したがって、ここに提供するＤＮＡ分子および対応する番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番ヌクレオチド配列は、とりわけ、トウモロコシイベント号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列ＭＯＮ８７４１１の同定、トウモロコシイベントＭＯＮ番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５８７４１１を含む植物品種または雑種の選択、試料中の、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番トランスジェニックトウモロコシイベントＭＯＮ８７４ 10 号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、１１に由来するＤＮＡの存在の検出、およびトウモロコ配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択シイベントＭＯＮ８７４１１またはイベントＭＯＮ８７される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子をその４１１を含むトウモロコシ植物に由来する植物部分の存ゲノム中に含んでなる微生物を提供する。そのような微在および／または不在に関する試料のモニタリングに役生物の一例はトランスジェニック植物細胞である。本発立つ。明の植物細胞などの微生物は、例えば限定するわけでは【００６３】ないが、（ｉ）科学的探求または工業的研究のための研本発明はトウモロコシ植物、後代、種子、植物細胞、植究ツールとしての使用；（ｉｉ）後続の科学的研究に使物部分（花粉、胚珠、穂または絹糸組織、雄穂組織、根用するか工業製品として使用することができる内在性ま組織、茎組織、および葉組織など）、およびコモディテたは組換え糖質、脂質、核酸、もしくはタンパク質産物ィー製品を提供する。これらの植物、後代、種子、植物 20 または小分子を生産するための培養における使用；およ細胞、植物部分、およびコモディティー製品は、検出可び（ｉｉｉ）農業上の研究または生産に使用することが能な量の本発明のポリヌクレオチド、すなわち、配列番できるトランスジェニック植物または植物組織培養物を号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号作製するための現代的植物組織培養技法による使用など５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、多くの工業的応用に役立つ。トランスジェニック植物、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番細胞などの微生物の作製および使用では、現代的微生物号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、学技法および人間の介入を利用して、人造のユニークな配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号微生物が作製される。この過程で、組換えＤＮＡが植物４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、ま細胞のゲノムに挿入されて、自然界に存在する植物細胞たは配列番号５２として提供される配列の少なくとも１とは別個のユニークなトランスジェニック植物細胞が作つを有するポリヌクレオチドなどを含有する。本発明の 30 製される。次に、このトランスジェニック植物細胞は現植物、後代、種子、植物細胞、および植物部分は１つ以代的微生物学技法を使って細菌および酵母細胞と同様に上の追加トランスジーンも含有しうる。そのような追加培養することができ、未分化な単細胞状態で存在するこトランスジーンは、望ましい形質、例えば限定するわけとができる。トランスジェニック植物細胞の新しいまたではないが、増加した昆虫抵抗性、増加した水利用効率は改変された遺伝子組成および表現型は、細胞のゲノム、増加した収量成績、増加した乾燥抵抗性、増加した種への異種ＤＮＡの組込みが生み出す技術的効果である。子品質、改良された栄養品質、および／または増加したトランスジェニック植物細胞などの本発明の微生物には除草剤耐性などを付与するタンパク質またはＲＮＡ分子、（ｉ）細胞のゲノムに組換えＤＮＡを組み込むことにをコードする任意のヌクレオチド配列であることができよってトランスジェニック細胞を作製した後、この細胞、ここで、望ましい形質は、そのような追加トランスジを使って、同じ異種ＤＮＡを保持するさらなる細胞を派ーンを欠くトウモロコシ植物を基準として測定される。 40 生させる方法；（ｉｉ）組換えＤＮＡを含有する細胞を【００６４】現代的微生物学技法を使って培養する方法；（ｉｉｉ）本発明は、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトランスジ培養細胞から内在性または組換え糖質、脂質、核酸、まェニックトウモロコシ植物に由来するトウモロコシ植物たはタンパク質産物を生産し、精製する方法；および（、後代、種子、植物細胞、および植物部分、例えば花粉ｉｖ）現代的植物組織培養技法をトランスジェニック植、胚珠、穂または絹糸組織、雄穂組織、根または茎組織物細胞と共に使って、トランスジェニック植物またはト、および葉を提供する。イベントＭＯＮ８７４１１を含ランスジェニック植物組織培養物を作製する方法が含まむトウモロコシ種子の代表試料は、ブダペスト条約に従れる。ってＡｍｅｒｉｃａｎ【００６６】ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。本発明の植物は、トランスジーンを含むイベントＤＮＡＡＴＣＣ寄託機関は、イベントＭＯＮ８７４１１を含む 50 を後代に伝えることができる。 ( 23 ) JP 43 2015-519051 A 2015.7.9 44 本明細書にいう「後代」には、祖先植物に由来するイベグリホサート耐性とを持つイベントＭＯＮ８７４１１トントＤＮＡを含み、かつ／または配列番号１、配列番号ウモロコシを、異なるトランスジェニックトウモロコシ２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６植物と交雑させて、両方のトランスジェニック親の特徴、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０を有する雑種または近交系植物を作製することができる、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番。その一例は、コーンルートワーム寄生に対して抵抗性号２１、配列番号２５；配列番号４１、配列番号４２、でありかつグリホサートに対して耐性であって少なくと配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号も１つ以上の追加形質を有する後代植物または種子をも４９、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５たらす、コーンルートワーム寄生に対する抵抗性および２からなる群より選択される少なくとも１つの配列を有グリホサート耐性を持つイベントＭＯＮ８７４１１と、するＤＮＡ分子を含む、任意の植物、種子、植物細胞、 10 １つ以上の追加形質、例えば除草剤耐性および／またはおよび／または再生可能な植物部分が包含される。植物昆虫防除を有するトウモロコシ植物との交雑であるだろ、後代、および種子は、トランスジーンに関してホモ接う。栄養生殖と同様、親植物への戻し交雑および非トラ合でもヘテロ接合でもよい。後代は、トウモロコシイベンスジェニック植物との異系交雑も考えられる。さまざントＭＯＮ８７４１１含有植物によって生産された種子まな形質および作物のために一般に使用される他の育種から、および／またはトウモロコシイベントＭＯＮ８７方法の説明は、例えばＦｅｈｒ「Ｂｒｅｅｄｉｎｇ４１１含有植物からの花粉で受精させた植物によって生ｅｔｈｏｄｓ産された種子から、生長させることができる。ｏｐｍｅｎｔ」Ｗｉｌｃｏｘ【００６７】ｎＳｏｃｉｅｔｙ後代植物を自家受粉（「自殖」ともいう）させて純粋種コンシン州マディソン（１９８７）など、いくつかある系統の植物、すなわちトランスジーンに関してホモ接合 20 参考文献の１つに見いだすことができる。である植物を生成させることができる。適当な後代の自【００６９】殖により、両方の付加された外因性遺伝子に関してホモ本発明は、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコ接合である植物を作製することができる。シ植物に由来する植物部分を提供する。本明細書にいう【００６８】「植物部分」とは、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトあるいは、後代植物を異系交雑して、例えば別の無関係ウモロコシ植物に由来する材料から構成される植物の任な植物と交配して、品種または雑種種子または植物を作意の部分を指す。植物部分には、花粉、胚珠、穂または製してもよい。他の無関係な植物はトランスジェニック絹糸、雄穂、根または茎組織、繊維、および葉などがあでも非トランスジェニックでもよい。したがって本発明るが、これらに限定されるわけではない。植物部分は、の品種または雑種種子または植物は、トウモロコシイベ生育可能、生育不能、再生可能、および／または再生不ントＭＯＮ８７４１１の特異的かつユニークなＤＮＡを 30 能であることができる。欠く第１の親を、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１【００７０】１を含む第２の親と交雑し、その結果としてトウモロコ本発明は、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１の特異的かつユニークなＤシ植物に由来し、かつ検出可能な量の、イベントＭＯＮＮＡを含む雑種を得ることによって、派生させることが８７４１１に特異的な核酸を含有する、コモディティーできる。各親は、交雑または交配が本発明の植物または製品を提供する。本明細書にいう「コモディティー製品種子、すなわち、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１」とは、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１１のＤＮＡおよび／または配列番号１、配列番号２、配Ａを含有するトウモロコシ植物、全粒または加工トウモ列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列ロコシ種子、１つ以上の植物細胞および／または植物部番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列分に由来する材料を含有する任意の組成物または製品を番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１ 40 指す。コモディティー製品は消費者に販売することがで、配列番号２５；配列番号４１、配列番号４２、配列番き、生育可能であっても生育不能であってもよい。生育号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、不能コモディティー製品には、発芽不能トウモロコシ種配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２から子；加工トウモロコシ種子、トウモロコシ種子部分、おなる群より選択される少なくとも１つの配列を有するＤよびトウモロコシ植物部分；飼料または食品、油、荒粉ＮＡ分子を含有するアレルを少なくとも１つは有する種、細粉、フレーク、ふすま、バイオマス、および燃料製子をもたらす限り、雑種または近交系／品種であること品用に加工されたトウモロコシ種子およびトウモロコシができる。したがって、２つの異なるトランスジェニッ植物部分などがあるが、これらに限定されるわけではなク植物を交雑して、独立して分離する２つの付加されたい。生育可能コモディティー製品には、トウモロコシ種外因性遺伝子を含有する雑種次代を作製することができ子、トウモロコシ植物、およびトウモロコシ植物細胞なる。例えば、コーンルートワーム寄生に対する抵抗性と 50 どがあるが、これらに限定されるわけではない。したがｆｏｒＣｕｌｔｉｖａｒＭＤｅｖｅｌＪ．編、ＡｍｅｒｉｃａｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ、ウィスＤＮ ( 24 ) JP 45 2015-519051 A 2015.7.9 46 って、イベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ植用することからなる。そのようなグリホサート除草剤の物は、通例トウモロコシから得られる任意のコモディテ施用は出芽前、すなわちＭＯＮ８７４１１含有種子が植ィー製品を製造するために使用することができる。トウえ付けられた後、かつＭＯＮ８７４１１含有植物が出芽モロコシイベントＭＯＮ８７４１１ＤＮＡを含有するする前の任意の時点であってもよいし、出芽後、すなわトウモロコシ植物に由来するそのようなコモディティーちＭＯＮ８７４１１含有植物が出芽した後の任意の時点製品はいずれも、その存在がトウモロコシイベントＭＯであってもよい。圃場において雑草を防除するためのもＮ８７４１１を決定づける１つ以上の特異的かつユニーう一つの方法が提供され、それは、圃場における雑草をクなＤＮＡ分子を少なくとも検出可能な量で含有し、具防除するために有効量のグリホサート除草剤を施用する体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列こと、そして次に、その圃場にイベントＭＯＮ８７４１番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番 10 １を含むトウモロコシ植物を植え付けることからなる。号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列そのようなグリホサート除草剤の施用は植え付け前、す番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５なわちＭＯＮ８７４１１含有種子が植え付けられる前で；配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番あり、植え付け前の任意の時点で、例えば限定するわけ号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、ではないが、植え付けの約１４日前∼植え付けの約１日配列番号５１、および配列番号５２からなる群より選択前に行うことができるだろう。本発明は、ＭＯＮ８７４される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含む１１を含むグリホサート耐性トウモロコシ植物の種子をポリヌクレオチドを、検出可能な量で含有しうる。本明圃場に植え付け、雑草を殺すのに十分な出芽後有効量の細書に開示する検出方法を含めて、任意の標準的なヌクグリホサート除草剤を圃場に施用し、その圃場から種子レオチド分子検出方法を使用することができる。コモデを収穫することによって、雑草種子を本質的に含まないィティー製品は、配列番号１、配列番号２、配列番号３ 20 トウモロコシ種子を生産するための方法も提供する。圃、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、場で使用するためのグリホサートの除草有効量は、１栽配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２培期で１エーカーあたり約０．１２５ポンドから１エー、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番カーあたり約６．４ポンドまでの範囲のグリホサートか号２５；配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、らなるはずである。一実施形態では、１栽培期で１エー配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号カーあたり合計約１．５ポンドのグリホサートが施用さ５０、配列番号５１、および配列番号５２からなる群よれる。１栽培期で複数回のグリホサート施用、例えば２り選択される少なくとも１つの特徴的配列を有するＤＮ回の施用（植え付け前施用と出芽後施用または出芽前施Ａ分子が、コモディティー製品中に、いくらかでも検出用と出芽後施用など）または３回の施用（植え付け前施可能な量で存在するのであれば、本発明の範囲内である用、出芽前施用および出芽後施用など）を使用してもよ。 30 い。【００７１】【００７３】それゆえに、本発明の植物、後代、種子、植物細胞、植本発明のイベントＭＯＮ８７４１１に特異的かつユニー物部分（花粉、胚珠、穂または絹糸、雄穂、根または茎クなＤＮＡ配列を含む昆虫および除草剤耐性トウモロコ組織、および葉など）、およびコモディティー製品は、シ植物を生産するための方法が提供される。これらの方とりわけ、農業上の目的でトウモロコシイベントＭＯＮ法で使用されるトランスジェニック植物はトランスジー８７４１１を含む種子および／または植物部分を生産すンに関してホモ接合でもヘテロ接合でもよい。これらのるために植物を生長させること、植物育種および研究目方法によって生産される後代植物は品種植物でも雑種植的でトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含む後代物でもよく；トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１含を生産すること、工業的応用および研究的応用のために有植物によって生産された種子および／またはトウモロ微生物学技法と共に使用すること、および消費者への販 40 コシイベントＭＯＮ８７４１１含有植物からの花粉で受売に有用である。精させた植物によって生産された種子から生長させるこ【００７２】とができ；トランスジーンに関してホモ接合でもヘテロ本発明は、グリホサート除草剤およびトウモロコシイベ接合でもよい。次に、後代植物を自家受粉させて純粋種ントＭＯＮ８７４１１を使って雑草を防除するための方系統の植物、すなわちトランスジーンに関してホモ接合法および植物を生産するための方法を提供する。圃場にである植物を生成させるか、あるいは異系交雑して、例おいて雑草を防除するための方法が提供され、これは、えば別の無関係な植物と交配して、品種または雑種種子トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１含有品種またはまたは植物を生産してもよい。雑種植物を圃場に植え付けること、およびＭＯＮ８７４【００７４】１１含有植物に被害を与えることなく圃場における雑草試料中の、トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１を含を防除する目的で圃場に除草有効量のグリホサートを施 50 むトウモロコシ細胞、組織、種子、または植物に由来す ( 25 ) JP 47 2015-519051 A 2015.7.9 48 るＤＮＡの存在を検出する方法を提供する。一方法は、と、（ｉｉ）ＤＮＡ試料を、イベントＭＯＮ８７４１１（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、組織、種子ＤＮＡに特異的なＤＮＡプローブと接触させること、、または植物からＤＮＡ試料を抽出すること、（ｉｉ）（ｉｉｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーションＤＮＡ配列決定にとって適当な条件下で、ＤＮＡ試料を条件下でプローブとＤＮＡ試料とをハイブリダイズさせ、イベントＭＯＮ８７４１１ＤＮＡに特異的なＤＮＡること、そして次に（ｉｖ）プローブとターゲットＤＮ配列を作製する能力を有する少なくとも１つのプライマＡ試料の間のハイブリダイゼーションを検出することかーと接触させること、（ｉｉｉ）ＤＮＡシークエンス反らなる。イベントＭＯＮ８７４１１応を行うこと、そして次に（ｉｖ）ヌクレオチド配列がＤＮＡプローブの配列の例を、配列番号１９または配列、イベントＭＯＮ８７４１１またはそこに含まれるコン番号２３として提供する。当業者は他のプローブを容易ストラクトに特異的なヌクレオチド配列、例えば配列番 10 に設計することができ、それらは、例えば限定するわけ号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号ではないが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番番号１０、配列番号２１、および配列番号２５に提供す号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４１、る配列など、インサートに隣接するゲノムＤＮＡの少な配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号くとも１つのフラグメントと、インサートＤＮＡの少な４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、おくとも１つのフラグメントとを含むであろう。ＤＮＡ試よび配列番号５２からなる群より選択される１つを含む料へのプローブハイブリダイゼーションの検出は、試料ことを確認することからなる。もう一つの方法は、（ｉ中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１特異的ＤＮ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、組織、種子、まＡの存在に特徴的である。あるいは、ハイブリダイゼーたは植物からＤＮＡ試料を抽出すること、（ｉｉ）ＤＮ 20 ションの不在は、試料中のトウモロコシイベントＭＯＮＡ増幅にとって適当な条件下で、ＤＮＡ試料を、イベン８７４１１特異的ＤＮＡの不在に特徴的である。トＭＯＮ８７４１１【００７５】ＤＮＡからアンプリコンを作製すＤＮＡに特異的なる能力を有するプライマー対と接触させること、（ｉｉ試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１ＤＮｉ）ＤＮＡ増幅反応を行うこと、そして次に（ｉｖ）アＡを同定するのに役立ち、適当なイベントＤＮＡを含有ンプリコン分子を検出し、かつ／またはアンプリコンのするトウモロコシ植物を育種するための方法に応用するヌクレオチド配列がイベントＭＯＮ８７４１１に特異的こともできる、ＤＮＡ検出キットが提供される。そのよなヌクレオチド配列、例えば配列番号２１および配列番うなキットには、配列番号１、配列番号２、配列番号３号２５からなる群より選択される１つを含むことを確認、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、することからなる。配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２アンプリコンは、イベントＭＯＮ８７４１１に特異的な 30 、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２１、配列番もの、例えば配列番号２１または配列番号２５を含むア号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、ンプリコンなどであるべきである。アンプリコン中の、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９、配列番号イベントＭＯＮ８７４１１に特異的なヌクレオチド配列５０、配列番号５１、および配列番号５２のフラグメンの検出は、試料中のトウモロコシイベントＭＯＮ８７４トを含むＤＮＡプライマーおよび／またはプローブが入１１特異的ＤＮＡの存在を決定づけ、かつ／またはそのっている。そのようなキットの一例は、試料中の、イベ存在に特徴的である。ントＭＯＮ８７４１１を含むトランスジェニックトウモＤＮＡ増幅にとって適当な条件下でイベントＭＯＮ８７ロコシ植物由来のＤＮＡの存在および／または不在を検４１１ＤＮＡからアンプリコンを作製する能力を有す出するのに役立つＤＮＡプローブとして機能するためにるプライマー対の例を、配列番号１８、配列番号２４、、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２０、および配列番号２２として提供する。当 40 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配業者は他のプライマー対を容易に設計することができ、列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４それらは配列番号２１または配列番号２５を含むアンプ、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番リコンを作製するであろう。この場合、そのようなプラ号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、イマー対は、インサートに隣接するゲノム領域内にある配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号少なくとも１つのプライマーと、インサート内にある第５１、および配列番号５２の十分な長さの連続ヌクレオ２のプライマーとを含む。試料中の、トウモロコシイベチドのＤＮＡ分子を、少なくとも１つは含む。イベントントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ細胞、組織、ＭＯＮ８７４１１を含むトランスジェニックトウモロコ種子、または植物由来のＤＮＡの存在を検出するもう一シ植物に由来するＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、つの方法は、（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配、組織、種子、または植物からＤＮＡ試料を抽出するこ 50 列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配 ( 26 ) JP 49 2015-519051 A 2015.7.9 50 列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番１、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４２、配列号５１、および配列番号５２に提供する配列の十分な数番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４９の連続核酸、例えば少なくとも１５、少なくとも１６、、配列番号５０、配列番号５１、および配列番号５２か少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少らなる群より選択される少なくとも１つの配列を有するなくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なＤＮＡ分子を含むであろう。試料中のトウモロコシイベくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくントＭＯＮ８７４１１ＤＮＡの存在および／または不とも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくと在を決定、検出、または診断するのに役立つＤＮＡプロも２９、または少なくとも３０連続ヌクレオチドを含むーブとしての使用にとって十分なＤＮＡ分子が、配列番べきであり、イベント由来のＤＮＡを同定するためにト号１９および配列番号２３として提供される。当業者は 10 ウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１他のプローブを容易に設計することができ、それらは配ユニークであるべきである。列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列【００７６】番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番本発明のキットおよび検出方法は、とりわけ、トウモロ号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配コシイベントＭＯＮ８７４１１の同定、トウモロコシイ列番号１６、配列番号２１、配列番号２５、配列番号４ベントＭＯＮ８７４１１を含む植物品種または雑種の選１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列択、試料中のイベントＭＯＮ８７４１１を含むトランス番号４５、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１ジェニックトウモロコシ植物に由来するＤＮＡの存在の、および配列番号５２の十分な数の連続核酸、例えば少検出、およびトウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１をなくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少な含むトウモロコシ植物またはイベントＭＯＮ８７４１１くとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なく 20 を含むトウモロコシ植物に由来する植物部分の存在およとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとび／または不在に関する試料のモニタリングに役立つ。も２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも【００７７】２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３トウモロコシイベントＭＯＮ８７４１１からの異種ＤＮ０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３Ａインサート、接合部配列、または隣接配列の配列は、、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、ここに提供する配列に由来するプライマーを使って、イ少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、まベントからそのような配列を増幅した後、アンプリコンたは少なくとも４０連続ヌクレオチドを含むべきでありまたはクローン化ＤＮＡの標準的ＤＮＡ配列決定を行う、イベント由来のＤＮＡを同定するためにトウモロコシことによって、検証（そして必要であれば修正）するこイベントＭＯＮ８７４１１とができる。ＤＮＡに十分にユニークでＤＮＡに十分にあるべきである。もう一つのタイプのキットは、試料中 30 【００７８】のトランスジェニックトウモロコシイベントＭＯＮ８７本発明の一定の好ましい実施形態の例を実証するために４１１由来のＤＮＡの存在および／または不在を検出す以下に実施例を挙げる。以下の実施例において開示するるのに役立つアンプリコンを作製するのに役立つプライ技法は、本発明の実施においてよく機能することを本発マー対を含む。そのようなキットでは、ターゲットＤＮ明者らが見いだしたアプローチを表し、したがってそのＡ試料を本明細書に記載のプライマー対と接触させ、次実施にとって好ましい形態の例を構成するとみなしうるに配列番号２１および配列番号２５からなる群より選択ことは、当業者には理解されるはずである。しかし当業される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含む者は、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、アンプリコンを作製するのに十分な核酸増幅反応を行いここに開示する具体的実施形態に多くの変更を加えても、次にアンプリコンの存在および／または不在を検出す、なお同様の結果を得ることが可能であることも、本開ることを含む方法が使用されるであろう。そのような方 40 示に照らして、理解するはずである。法は、ターゲットＤＮＡ試料中のトウモロコシイベント【００７９】ＭＯＮ８７４１１特異的ＤＮＡの存在を決定づける、す寄託情報なわちその存在に特徴的であるであろう、アンプリコンイベントＭＯＮ８７４１１を含むトウモロコシ種子の代またはそのフラグメントを配列決定することも含みうる表試料の寄託は、ブダペスト条約に従って、２０１２年。当業者は他のプライマー対も容易に設計することがで３月１４日に、郵便番号２０１１０米国バージニア州マき、それらは、限定するわけではないが、配列番号１、ナッサス、ユニバーシティ・ブールバード１０８０１に配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配住所を有するＡｍｅｒｉｃａｎ列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）になされ、ＡＴ０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列ＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２６６９が割り当てられている番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４ 50 。本願の係属中、特許商標庁長官および長官が権限を有ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ ( 27 ) JP 51 2015-519051 A 2015.7.9 52 すると決定した者は、請求により、本寄託物を利用することが可能である。特許の発行後は直ちに、公衆に対する利用可能性に関する全ての制約が、取消不能に取り除かれるであろう。寄託物は、３０年間、または最後の請求後５年間、または特許の有効期間中は、そのいずれが長くても、受託機関に維持され、その期間中は必要に応じて補充されるであろう。［実施例］【実施例１】【００８０】 10 この実施例では、４１７と呼ばれるコンストラクトの設計および選択ならびにさまざまなＤＮＡコンストラクトの工学的操作および評価を説明する。表１にこれらのＤＮＡコンストラクトを試験基準および結果によって表にする。【００８１】ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）をターゲットとするＲＮＡベースの植物内保護物質（ＰＩＰ）をトウモロコシ内で発現するように、ＤＮＡコンストラクトを【表１−２】工学的に操作した。ＲＮＡ転写産物のバリエーションを 20 、ＷＣＲのターゲット遺伝子の相違（グループ１）、ＲＮＡの長さの相違（グループ２）、中立的ＲＮＡキャリアの有無（グループ２）、二次構造の相違（グループ４）、およびＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏのターゲットセグメントの相違（グループ２および３）について試験した。複数トランスジーンのバリエーション、例えばＲＮＡ転写産物＋ＷＣＲ活性タンパク質（グループ３および５）、および２つのＷＣＲターゲットをターゲットとする２つのＲＮＡ転写産物（グループ１および４）も試験した。使用した発現カセットおよび要素の数および配置のバリエー 30 ションも試験した（全てのグループ）。【００８２】［表１］４５のＤＮＡコンストラクトをトウモロコシ植物に安定に形質転換した。１つのＤＮＡコンストラクトにつき複数の形質転換イベントからの後代植物を評価した。【表１−１】【００８３】グループ２のＤＮＡコンストラクトを一例として用いる 40 と、さまざまな長さのＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ（２７ｎｔ長から４２９ｎｔ長まで）のターゲティングを試験するために、７つのＤＮＡコンストラクトを工学的に操作した。各ＤＮＡコンストラクトを作製し、植物細胞を形質転換し、植物を取得し、近交系をグロースチャンバー効力バイオアッセイで評価した。結果は逆方向反復ＲＮＡ（ＩＲ）の長さとＷＣＲ活性の間の相関関係を示した（表２、（Ｂ）列および（Ｈ）列）。【００８４】［表２］ＩＲの長さとＷＣＲ活性の間の相関関係 50 【表２】 ( 28 ) JP 53 2015-519051 A 2015.7.9 54 数を示している。（Ｆ）列は、形質転換イベント中に１コピーのインサートＤＮＡを内包すると予想されるＲ０植物の数を示している。（Ｇ）列は、単一形質転換イベントを内包すると予想され、かつ多施設グロースチャンバーバイオアッセイ用に十分な種子を生産したＲ０植物の数を示している。（Ｈ）列は、ＷＣＲ活性を評価するために計画された植物グロースチャンバー研究の結果を示している。「＋＋＋＋＋」は平均ＲＤＲが０．５ＲＤＲ未満であったことを示す。「＋＋」は平均ＲＤＲが０ 10 ．５ＲＤＲ∼２．０ＲＤＲであったことを示す。「−」は、平均ＲＤＲが約２．０ＲＤＲであったことを意味し、これはグロースチャンバー効力研究では陰性対照に匹敵した。【００８６】 †ＤＮＡコンストラクト＃４７４と同じ２７マーであるが、中立的な１５０マーＩＲに埋め込まれている。グロースチャンバーで生長させた植物におけるＷＣＲ活性を評価するために、１コンストラクトあたり１０∼２０のイベントのそれぞれについて６∼８体の植物を、ピート 20 鉢で生長させた。植物を、インサートＤＮＡの存在およびトランスジーンの発現について、葉組織と根組織の両方で試験した。次に、トランスジーンの発現が確認された植物を、ＷＣＲ卵を寄生させた大きな鉢に植え替えた。非トランスジェニックトウモロコシ系統ＬＨ５９およびＬＨ２４４を陰性対照として含めた。イベントＭＯＮ８８０１７（Ｃｒｙ３Ｂｂを発現するもの）を含有する植物を陽性対照として含めた。生長するトウモロコシ植物の根損傷を４週間後に評価した。根損傷評点（ｒｏｏｔｄａｍａｇｅ 30 ｒａｔｉｎｇ）（ＲＤＲ）を３点尺度で評価し、０ＲＤＲを根損傷なし、３ＲＤＲを最大根損傷とした。【００８７】研究結果から、グループ５のＤＮＡコンストラクトは、（ａ）２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏＩＲ用の発現カセットおよび（ｂ）Ｃｒｙ３Ｂｂタンパク質用の発現カセットを含有するように設計した（図２）。２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏＩＲを選択した理由は、（ａ）同じ２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏＩＲを発現する植物がＣＲＷ活性の阻害に何度も成功していたこと（グループ２∼ 40 ４）、（ｂ）長さが１００ｎｔより大きいセグメントではＷＣＲ抵抗性の発生確率が減少すること、および（ｃ）２４０ｎｔより大きいセグメントではトウモロコシゲ【００８５】ノムに無傷で導入することが困難になるであろうことで（Ｂ）列は、トウモロコシ植物中で逆方向反復ＲＮＡ（あった。ＩＲ）二次構造として発現するように工学的に操作され各発現カセット中の異なる調節遺伝要素およびＤＮＡコたＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏターゲットＲＮＡのさまざまな長さンストラクトにおける各発現カセットの異なる配置を試を示している。（Ｃ）列は、形質転換されたトウモロコ験するために、ＤＮＡコンストラクトを設計した。グルシ胚の数を示している。（Ｄ）列は、苗条を発生させたープ５のＤＮＡコンストラクトには、グリホサート耐性トウモロコシ胚の数を示している。（Ｅ）列は、土壌で発現カセットを伴うコンストラクトとグリホサート耐性生育可能な再生トウモロコシ植物（世代Ｒ０と呼ぶ）の 50 発現カセットを伴わないコンストラクト；および２４０ ( 29 ) JP 55 2015-519051 A 2015.7.9 56 マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏＩＲだけを発現するグループ３かネントは、次のとおりである。らの対照コンストラクトも含めた。各ＤＮＡコンストラ【００９０】クトを設計し、植物細胞を形質転換し、植物を取得し、［１］ＬＢ：配列番号２６の位置１∼４４２の逆相補体近交系をグロースチャンバー効力バイオアッセイで評価に対応する。この要素はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍした（表３（Ｃ）∼（Ｈ））。ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのオクトピン左境界配列に相当【００８８】する。［表３］グループ５のＤＮＡコンストラクトの形質転換［２］Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９からの植物作製数２６の位置４８６∼１１１８の逆相補体に対応する。Ｐ【表３】ｉｓｕｍ 10 ３’ＵＴＲ：配列番号ｓａｔｉｖｕｍ（エンドウ）のリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットＥ９（ｒｂｃＳ−Ｅ９）遺伝子転写産物からの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に相当する。［３］２４０マーＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏ逆方向反復遺伝子：配列番号２６の位置１１４８∼１７７７の逆相補体に対応する。この遺伝子は、互いに全く同一に逆相補的に一致する２つの２４０マーリボヌクレオチドセグメントを、１５０リボヌクレオチドの中立的セグメントによって分離された状態で含有するＲＮＡに転写されて、逆方向反復ＲＮＡ（ＩＲ）を形成する。２４０ｂｐセグメント 20 の配列は酵母Ｓｎｆ７にオルソロガスなＷＣＲ遺伝子と一致する。［４］トウモロコシＤｎａＫイントロン：配列番号２６の位置１８１４∼２６１７の逆相補体に対応する。この要素は、Ｚｅａｍａｙｓ（トウモロコシ）の熱ショックタンパク質７０遺伝子からのエクソン１の１０ヌクレオチド、イントロン１、およびエクソン２の１１ヌクレオチドからなる。エクソン２の１１ヌクレオチドには開始メチオニン残基を除去する修飾が加えられている。［５］ＣａＭＶ 30 ３５Ｓリーダー：配列番号２６の位置２６１８∼２６２６の逆相補体に対応する。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５ＳＲＮＡ転写産物からの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）であって、その遺伝子のｍＲＮＡ転写開始点の＋１位置から始まるものに【００８９】相当する。表３の（Ｈ）列に示すように、「＋＋＋＋＋」は、平均【００９１】すると、発生全体を通してトランスジェニック植物に最［６］ｅＣａＭＶも高い持続的遺伝子発現と、発生中に最も高いＷＣＲ阻の位置２６２７∼３２３８の逆相補体に対応する。−９害と、自家受精世代および交雑世代において最も高いＷ０∼−３５０領域の重複を含有するカリフラワーモザイＣＲ阻害を与えたＤＮＡコンストラクトを表す。「＋＋クウイルス（ＣａＭＶ）のプロモーターに相当する。＋＋」は、平均すると、トランスジェニック植物にＷＣ 40 ［７］トウモロコシＰＩＩＧプロモーター：配列番号２Ｒ阻害を与えるが、「＋＋＋＋＋」植物と比べると遺伝６の位置３２６５∼４２１３に対応する。この遺伝要素子発現量は少ないＤＮＡコンストラクトを表す。「＋＋は、Ｚｅａ＋」は、平均すると、トランスジェニック植物に与えらＩＩＧ）遺伝子のプロモーターに相当する。れるＷＣＲ阻害が「＋＋＋＋」植物および「＋＋＋＋＋［８］コムギＬｈｃｂ１リーダー：配列番号２６の位置」植物と比べて低いＤＮＡコンストラクトを表す。そこ４２２０∼４２８０に対応する。この遺伝要素はＴｒｉで、ＤＮＡコンストラクト＃４１７をさらなる解析に進ｔｉｃｕｍめた。このコンストラクトは、左境界（ＬＢ）から右境ｂ１（Ｌｈｃｂ１）遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）界（ＲＢ）までに、３つの発現カセットに編成された１に相当する。６の遺伝要素を有する。このコンストラクトを図２に示［９］イネＡｃｔ１イントロン：配列番号２６の位置４し、配列を配列番号２６に記載する。ベクターコンポー 50 ２９７∼４７７６に対応する。３５Ｓプロモーター：配列番号２６ｍａｙｓの物理的障害誘導タンパク質（Ｐａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）の集光複合体 ( 30 ) JP 57 Ｏｒｙｚａ 2015-519051 A 2015.7.9 58 ｓａｔｉｖａ（イネ）のアクチン１（Ａｃこの実施例では、形質転換と多数のトランスジェニックｔ１）遺伝子からのエクソン１の１２ヌクレオチド、イイベントからのイベントＭＯＮ８７４１１の選択を説明ントロン１、およびエクソン２の７ヌクレオチドの連続する。配列からなる。【００９４】［１０］Ｃｒｙ３ＢｂＯＲＦ：配列番号２６の位置４トウモロコシ系統ＬＨ２４４の穀粒から胚を摘出し、Ｄ７８６∼６７４７に対応する。ＮＡコンストラクト＃４１７を内包する組換えＡｇｒｏネイティブＢｔＣｒｙ３Ｂｂタンパク質コード遺伝子ｂａｃｔｅｒｉｕｍを接種した。同時培養した胚を選択と比べて修飾Ｈ２３１Ｒ、Ｓ３１１Ｌ、Ｎ３１３Ｔ、Ｅおよび生長培地に移して、発生中の苗条を伴うトランス３１７Ｋ、およびＱ３４９Ｒを呈するように工学的に操ジェニックカルス組織を生成させた。発生中の苗条を、作された非天然殺虫性Ｃｒｙ３Ｂタンパク質のコード領 10 小植物に発生させるための発根培地に移した。小植物を域に相当する。このヌクレオチド配列はイベントＭＯＮ土壌で全Ｒ０植物に再生させた。こうして回収したＲ０８８０１７に含まれるｃｒｙ３Ｂｂ遺伝子配列と一致す植物を、導入されたコンストラクトＤＮＡが１コピーでる。あるものについてスクリーニングした。表３に示すよう【００９２】に、推定１コピーのイベントが、７１のユニークなＲ０［１１］コムギＨｓｐ１７３’ＵＴＲ：配列番号２６形質転換体に得られた。各Ｒ０形質転換体を育苗条件下の位置６７６７∼６９７６に対応する。この遺伝要素はに置くことで、後代Ｒ１種子を生産した。４４のイベン、Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）からトを先に進めた。４４のＲ０植物のそれぞれによって生の熱ショックタンパク質１７（ＨＳＰ１７）遺伝子の３産されたＲ１種子を少なくとも８つは土壌に植え付け、 ’ＵＴＲに相当する。Ｒ１植物を生長させてＲ２種子を生産した。１つのイベ［１２］イネＴｕｂＡ（プロモーター、リーダー、イン 20 ントにつき１つのＲ１植物を選択して、各々のイベントトロン）：配列番号２６の位置７０２５∼９２０５に対を含有する各系統を継続させ、その１つのＲ１植物から応する。Ｏｒｙｚａの種子を、（ａ）自家受精（Ｒ３ｓａｔｉｖａ（イネ）のαチュー，４， … ，Ｎ）またはブリン遺伝子（ＴｕｂＡ−３）からの連続するプロモー（ｂ）他のトウモロコシ系統、例えばトウモロコシ系統ター、リーダー、イントロン、およびエクソン２の４ヌ９３ＩＤＩ３との交雑受精によって、以後の試験のためクレオチドに相当する。に増やした。ＤＮＡコンストラクト＃８９０（表３の行［１３］ＣＴＰ：配列番号２６の位置９２１０∼９４３１１）の形質転換からのイベントに相当する植物も再生７に対応する。Ａ．して、本実施例において後述する後続の圃場試験のためｔｈａｌｉａｎａの５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳの比較対照とした。）からのＮ末端ＣＴＰをコードする工学的に操作された【００９５】コード領域に相当する。この要素は、最後のＧＡＧコド 30 Ｃｒｙ３Ｂｂ発現を含む表現型に基づいて、４４イベンン（グルタミン酸）がＴＧＣ（システイン）に修飾されトのうち、２５イベントを選択して、先に進めた。これている点で、ネイティブ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセら２５イベントに相当するＲ１植物をさらに、実施例１ッション番号Ｘ０６６１３）とは異なる。に記載のグロースチャンバー効力方法でＷＣＲ阻害につ［１４］ＣＰ４いて評価し、インサートＤＮＡの多重遺伝要素のコピーＥＰＳＰＳ：配列番号２６の位置９４３８∼１０８０５に対応する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ数についても評価した。４つのイベントは２コピー以上ＣＰ４からのＥＰＳＰＳのＰｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９３’ＵＴＲ遺伝要素を呈しの工学的に操作されたコード領域に相当する。第２コド、他の４つのイベントに相当するＲ１植物が０．８ＲＤンがセリンをコードするものからＣＴＴ（ロイシン）へＲを上回る根損傷評点を呈したので、２５イベントのうと修飾されている点と、４つのサイレント置換とが、ネちの１７イベントを先に進めた。イティブＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ遺伝子とは異なる 40 【００９６】。残り１７のイベント、すなわち「Ａ」、ＭＯＮ８７４１［１５］イネＴｕｂＡ３’ＵＴＲ：配列番号２６の位置１０８１３∼１１３９４に対応する。Ｏｒｙｚａ１、および「Ｃ」∼「Ｑ」を含む後代植物をさらに、分ｓ子成績および圃場内成績について、並行して解析した（ａｔｉｖａ（イネ）からのαチューブリン遺伝子（Ｔｕ表４および表５参照）。ｂＡ−３）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に相当する。【００９７】［１６］ＲＢ：配列番号２６の位置１１４１３∼１１７［表４］ＤＮＡ形質転換ベクター＃４１７からのインサ４３に対応する。Ａ．ートＤＮＡを内包する１７のトランスジェニックトウモｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからのノパリン右境界配列に相当する。ロコシイベントの分子解析【実施例２】【表４】【００９３】 50 ( 31 ) JP 59 2015-519051 A 2015.7.9 60 でノーザンブロットを行ったところ、評価したイベントの全てがこの基準に合格した（表４（Ｇ）列）。【００９９】これら１７のイベントを農学的圃場試験、昆虫効力圃場試験およびグリホサート耐性効力圃場試験で評価した。その結果を表５に要約する。表５の列見出しは圃場試験のタイプ（「農学」、「昆虫」、または「グリホサート」）を表し、イベントと比較／対比された対照を列挙し、イベント雑種を生成させるために使用した遺伝的近交 10 系も列挙している。（Ａ）∼（Ｃ）列に要約した圃場試験は、（Ｄ）∼（Ｈ）列に要約した圃場試験の１暦年前に、また（Ｉ）列に要約した圃場試験の２年前に植え付けられた。【０１００】［表５］形質転換ベクター＃４１７で生成したイベントの農学的圃場試験、昆虫効力圃場試験、およびグリホサート効力圃場試験からの結果【表５】【００９８】イベントを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換ベクターのバックボーンＤＮＡセグメントについて、また意図したインサートＤＮＡの全ての部分の単コピー数について、スクリーニングした（表４（Ａ）列および（Ｂ）列）。７つのイベント（ＭＯＮ８７４１１、Ａ、Ｃ、Ｄ 30 、Ｅ、Ｆ、およびＧ）を、Ａｇｒｏ媒介挿入中に起こるアグロバクテリウム左境界および右境界のニック部位変異を除けば形質転換ベクター＃４１７と同一である挿入ＤＮＡの配列について解析したところ、イベントＤはこの配列解析に不合格だった（表４（Ｃ）列）。これら７つのイベントを、植物発生全体および数世代を通したＣｒｙ３Ｂｂタンパク質およびＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏＩＲＲＮＡの持続的植物発現についても評価したところ、７つのイベント全てが持続的植物発現に関する合格基準を満たした（表４（Ｄ）列）。７つのイベントのそれぞれ 40 をゲノム挿入部位特徴（すなわち中立的挿入部位）、例えばＤＮＡの置換、重複および反復、内在性遺伝子との近さ、内在性遺伝子の中断、およびＱＴＬへの近さ、な【０１０１】らびにバイオテクノロジー形質について解析したところイベントを各圃場試験において対照と比べた。各圃場試、イベントＥ、Ｆ、およびＧはこの解析に不合格だった験に関するデータは、複数の立地にわたる反復試験区で（表４、（Ｆ）列）。Ｃｒｙ３Ｂｂをコードするまたは平均した。ＬＨ２４４は形質転換系統に関する対照であＤｖ＿Ｓｎｆ７ｏる。ＤＮＡベクター「＃８９０」は、２４０マーＤｖ＿ＩＲＲＮＡを生産する２つのＲＮＡ転写産物の予想されるサイズが、イベントからのＲＮＳｎｆ７ｏＡ中に存在するかどうかを決定するために、イベントＭめに使用した。コウチュウ抵抗性およびグリホサート耐ＩＲだけを発現するイベントを作製するたＯＮ８７４１１、Ａ、Ｃ、およびＤを含有する植物組織 50 性をトウモロコシ植物に与える市販イベントＭＯＮ８８ ( 32 ) JP 61 2015-519051 A 2015.7.9 62 ０１７を対照として使用した。「ＲＮ近交系」は第Ｎ世付し、平均を５％確率水準の最小有意差（ＬＳＤ（０．代の後代を示している。圃場試験で評価した雑種イベン０５）で分離した。トは、評価対象であるイベントからの片親（ＭＯＮ８７【０１０３】４１１、またはＡ∼Ｑ）と、表５（Ｃ、Ｇ、またはＨ列北アメリカにある複数の立地にわたって平均したＷＣＲ）に示す片親との交雑から収穫された種子から生長させ損傷についての解析を含む昆虫効力圃場試験の結果を表た。具体的に述べると、表５において、列、Ｒ２近交系５のＣ列およびＨ列に要約する。これらの効力圃場試験 ×９３ＩＤＩ３は、評価対象であるイベントのＲ２近交では、トウモロコシ穀粒が、ＲＣＢ法で、１立地あたり系を近交系トウモロコシ９３ＩＤＩ３と交雑して雑種種１イベントあたり三重の試験区に植え付けられ、各複製子を作ったことを示している。同様に、表５のＧ列およ試験区は２５個の穀粒からなった。試験イベントは雑種びＨ列において、Ｒ４近交系×ＭＯＮ８９０３４は、評 10 植物として提示された。適当な対照を１立地あたり１対価対象であるイベントのＲ４近交系後代を、イベントＭ照あたり三重の試験区に含めた。トウモロコシの試験区ＯＮ８９０３４を含有する植物と交雑して雑種種子を作がそのＶ２生長段階に到達したら、１試験区あたり５つったことを示している。「ＮＡ」は、この試験イベントの植物に、１植物あたり３，３３０卵の割合で、ＷＣＲに関するデータを入手できなかったことを示す。「＝」卵を寄生させた。Ｖ１０生長段階中に、１試験区あたりは、対照と比べて形質が等価であることを表す。「−」５つの被害植物の根を掘り起こし、洗浄し、０ＲＤＲをは、対照と比べた形質ヒットを表す。「＋」は、対照と根損傷なし、３ＲＤＲを最大根損傷とする、０∼３の根比べた成績の向上を表す。「ＲＤＲ」は根損傷評点であ損傷評点（ＲＤＲ）に基づいて、食害を評価した。試験る。「‡」は、当該イベントが苗床で生長させた植物にイベントと対照植物のＲＤＲを、全ての立地における全おいて表現型異型を呈したことを、同時期の温室研究がての試験区にわたる植物で平均した。各昆虫効力圃場試示したことを表す。「†」は、当該イベントがＷＣＲ効 20 験の陰性対照植物は、それぞれ１．７ＲＤＲおよび１．力を与えなかったことを、同時期の温室研究が示したこ５ＲＤＲの平均ＲＤＲを呈した。各昆虫効力圃場試験のとを表す。市販品査照標準は、それぞれ０．２５ＲＤＲおよび０．【０１０２】２０ＲＤＲの平均ＲＤＲを呈した。ＤＮＡコンストラク農学的圃場試験を北アメリカおよび南アメリカにある複ト＃８９０からのイベントを含有する植物は、約０．３数の立地で行い、表５のＡ列、Ｂ列、Ｄ列、およびＩ列５∼０．５０ＲＤＲの範囲のＲＤＲを呈した。ＤＮＡコに要約するように、結果を全ての立地にわたって平均しンストラクト＃４１７からのイベントは、一貫して、平た。これらの農学的圃場試験では、トウモロコシ穀粒を均ＲＤＲスコアが０．２５ＲＤＲの経済的被害閾値未満、完全乱塊（ＲＣＢ）法で、１立地あたり１イベントあである植物を与えた。たり三重の試験区に植え付けた。各複製試験区は１００【０１０４】個の穀粒からなった。試験保守は、穀粒生産量を最適化 30 北アメリカにある複数の立地で行われたグリホサート除し、天然ＷＣＲ圧を排除するように計画した。以下の標草剤処置に対する生育耐性（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ準的な農学的圃場試験評点の１つ以上を収集した：５０ｏｌｅｒａｎｃｅ）を評価する効力圃場試験の結果を表％花粉飛散までの積算成長度日（ｄｅｇｒｅｅｕｎｉ５のＦ列およびＧ列に要約する。これらの効力圃場試験ｓｈｅｄ）（ＧＤＵ）、育種家スについて、個々の試験に使用したグリホサート施用レジｔｓｔｏ５０％コア（Ｂｒｅｅｄｅｒ’ｓｓｃｏｒｅ）（ＢＲ）、実生の活力（ｓｅｅｄｌｉｎｇ、茎倒伏（ｓｔａｌｋｖｉｇｏｒ）（ＳＤＶ）ｌｏｄｇｉｎｇ）（ＳＴＬＣ）メンを表６（表５のＦ列に対応）および表７（表５のＧ列に対応）に提示する。【０１０５】、根倒伏（ｒｏｏｔｌｏｄｇｉｎｇ）（ＲＴＬＣ）、成［表６］除草剤圃場試験処置熟植物の穂高（ｅａｒ【表６】ｒｅｈｅｉｇｈｔｏｆｍａｔｕｔｐｌａｎｔｓ）（ＥＨＴ）、成熟植物の草高（ｐ 40 ｌａｎｔｈｅｉｇｈｔｏｆｍａｔｕｒｅｎｔｓ）（ＰＨＴ）、穀粒水分（ｇｒａｉｎｐｌａｍｏｉｓｔｕｒｅ）（ＭＳＴ）、および穀粒試験重量（ｇｒａｉｎｔｅｓｔｗｅｉｇｈｔ）（ＴＷＴ）、表現型異型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｏｆｆ−ｔｙｐｅｓ）、およ「ｌｂｓａｅ」はポンド（酸換算）を示す。「Ａ」はび穀粒収量（ｇｒａｉｎｙｉｅｌｄ）。近交系イベンエーカーを示す。トと雑種イベントをどちらも評価した。結果を表５のＡ【０１０６】、Ｂ、Ｄ、およびＩ列に要約する。１立地あたり１対照［表７］除草剤圃場試験処置あたり三重の試験区に適当な対照を含めた。評点を全て【表７】の立地にわたる試験区で平均した。データを分散分析に 50 ( 33 ) JP 63 2015-519051 A 2015.7.9 64 ンサートの３’端と設定した）の１５ヌクレオチドだけが、イベントＭＯＮ８７４１１のゲノム挿入部位にある挿入ＤＮＡに保たれていることが確認された。【０１１１】「ｌｂｓａｅ」はポンド（酸換算）を示す。「Ａ」はイベントＭＯＮ８７４１１の挿入ＤＮＡに隣接するゲノエーカーを示す。ム配列と、ＬＨ２４４からの野生型アレルにおける挿入【０１０７】部位の対応ゲノム領域とを、比較解析した。この解析に植物１００体の各試験区を、各処置の最後の散布の７∼ より、ＬＨ２４４ゲノムＤＮＡの１１８塩基対セグメン１０日後に、作物被害について評定した。作物被害評点トが、イベントＭＯＮ８７４１１の生成過程で、形質転には萎黄病、奇形、および平均低草高を含めた。これら 10 換ベクター＃４１７の挿入ＤＮＡによって置き換えられはいずれもグリホサート除草剤に対する低い耐性を示することが決定された。。各試験区を、ＰＨＴ、ＥＨＴ、５０％花粉飛散までの【実施例４】日数（Ｄ５０Ｐ）、５０％絹糸出現までの日数（Ｄ５０【０１１２】Ｓ）、ＴＷＴ、ＭＳＴ、および収量についても評定したこの実施例では、トウモロコシ試料におけるイベントＭ。イベントは近交系植物および雑種植物として提供されＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡの存在を同定するのに、イベントＭＯＮ８８０１７と比べられた。イベント「役立つ方法を説明する。ゲノムＤＮＡとイベントＭＯＮＡ」、ＭＯＮ８７４１１、「Ｄ」、「Ｅ」、および「Ｇ８７４１１の挿入ＤＮＡの随意に割り当てられた５’端」は、作物被害、ＰＨＴ、ＥＨＴ、Ｄ５０Ｐ、Ｄ５０Ｓとの間に形成され、配列番号１、配列番号２、配列番号、ＴＷＴ、ＭＳＴ、および収量評点に関して、イベント４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列ＭＯＮ８８０１７と等価であった。他のイベントおよび 20 番号２１に包含される、ユニークな接合部（すなわち左市販のＭＯＮ８８０１７イベントと比べたイベントＭＯ接合部）を同定することを目的として、一対のプライマＮ８７４１１の有意なＲＤＲ優位性を加味したこれらのーおよびプローブを設計した。オリゴヌクレオチドフォ結果に基づいて、イベントＭＯＮ８７４１１を選択したワードプライマーＳＱ２７０１１の配列（配列番号１８。）は、配列番号１および配列番号２の位置４６２∼４９【実施例３】０、配列番号７の位置１０７∼１３５、配列番号６の位【０１０８】置７２∼１００、配列番号５の位置１２∼４０、およびこの実施例ではイベントＭＯＮ８７４１１の分子キャラ配列番号２１の位置１∼２９に対応するヌクレオチド配クタリゼーションを説明する。列と同一である。オリゴヌクレオチドリバースプライマ葉組織の試料を（Ｒ０）ＭＯＮ８７４１１植物から採取ーＳＱ９０８５の配列（配列番号２０）は、配列番号１した。イベントＭＯＮ８７４１１中のトランスジェニッ 30 および配列番号２の位置５１６∼５４１、配列番号７のク挿入部位に対応するゲノムＤＮＡの配列決定を行った位置１６１∼１８６、配列番号６の位置１２６∼１５１ところ、ベクター＃４１７に対応する形質転換ベクター、配列番号５の位置６６∼９１、配列番号４の位置１６中の配列と比べて相違は認められなかった。 ∼４１、および配列番号２１の位置５５∼８０に対応す【０１０９】るヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。オリゴヌ隣接配列を、トウモロコシＢ７３リファレンスゲノム（クレオチドプローブＰＢ３５５２の配列（配列番号１９ＲｅｆＢ７３）を含むトウモロコシゲノムリファレン）は、配列番号１および配列番号２の位置５０２∼５１ス配列にマッピングした。イベントＭＯＮ８７４１１は５、配列番号７の位置１４７∼１６０、配列番号６の位物理的に第９染色体上にあると決定された。左隣接／イ置１１２∼１２５、配列番号５の位置５２∼６５、配列ンサートＤＮＡ接合部における隣接配列の末端は、位置番号４の位置２∼１５、および配列番号２１の位置４１ＺＭ＿Ｂ７３＿ＣＲ０９：３９２６１７９７に対応する 40 ∼５４に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一で。右隣接／インサートＤＮＡ接合部における隣接配列のある。ＰＣＲプライマーＳＱ２７０１１（配列番号１８末端は、位置ＺＭ＿Ｂ７３＿ＣＲ０９：３９２６１９１）およびＳＱ９０８５（配列番号２０）は、イベントＭ５に対応する。イベントＭＯＮ８７４１１の隣接配列をＯＮ８７４１１の左接合部にあるユニークなゲノム／イ、ゲノム重複、反復、および内在性遺伝子について解析ンサートＤＮＡの７９ヌクレオチドアンプリコンを増幅した。いずれも検出されなかった。する。これと同じプライマー対を、蛍光標識（すなわち【０１１０】６ＦＡＭ（商標）蛍光ラベル）されたプローブＰＢ３５イベントＭＯＮ８７４１１中の挿入ＤＮＡの配列解析に５２（配列番号１９）と共に、試料におけるイベントＭより、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ左境界（随意にインＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡの存在を同定するためサートの５’端と設定した）の２６３ヌクレオチドだけのＥｎｄｐｏｉｎｔ、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ右境界（随意にイ 50 アッセイにおいて使用することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ ( 34 ) JP 65 2015-519051 A 2015.7.9 66 【０１１３】けるイベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡの存在ゲノムＤＮＡとイベントＭＯＮ８７４１１の挿入ＤＮＡを検出するために使用したプライマー対とプローブ（すの随意に割り当てられた３’端との間に形成され、配列なわち６ＦＡＭ（商標）などの蛍光タグで標識されたプ番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番ローブ）の各セット（ＳＱ２７０１１、ＳＱ９０８５、号９、配列番号１０、または配列番号２５に包含されるおよび／もしくはＰＢ３５５２、またはＳＱ２７０６６、ユニークな接合部（すなわち右接合部）を同定するこ、ＳＱ２６９７７、および／もしくはＰＢ１１３００）とを目的として、一対のプライマーおよびプローブを設で最適化した。一般に、最適化されたパラメータには、計した。オリゴヌクレオチドフォワードプライマーＳＱプライマー濃度、プローブ濃度、テンプレートＤＮＡの２７０６６の配列（配列番号２２）は、配列番号１の位量、ＰＣＲ増幅サイクルパラメータが含まれた。ＰＣＲ置１１７１０∼１１７２８、配列番号４の位置１１２１ 10 反応用の対照には、トウモロコシゲノム中の内部対照単０∼１１２２８、配列番号８、配列番号９、および配列コピー遺伝子に特異的なプライマー（ＳＱ２０２２１（番号１０の位置４５∼６３、および配列番号２５の位置配列番号３８）およびＳＱ２０２２２（配列番号４０）１∼１９に対応するヌクレオチド配列と同一である。オ）および／またはプローブ（ＰＢ１００６５（配列番号リゴヌクレオチドリバースプライマーＳＱ２６９７７の３９））（ＶＩＣ（商標）などの蛍光タグで標識された配列（配列番号２４）は、配列番号１の位置１１７５６プローブ）を含めた。内部対照プローブとして使用する ∼１１７８４、配列番号８の位置９１∼１１７、配列番かまたはＰＣＲアッセイ（例えばＴａｑＭａｎ（登録商号９および配列番号１０の位置９１∼１１９、配列番号標））における内部対照として使用するためのアンプリ３の位置２３∼５１、および配列番号２５の位置４７∼ コンを増幅するために使用することができるトウモロコ７５に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一であシゲノム中の単コピー遺伝子に特異的な他のＰＣＲプラる。オリゴヌクレオチドプローブＰＢ１１３００の配列 20 イマーを設計する方法は、当業者にはわかるであろう。（配列番号２３）は、配列番号１の位置１１７３１∼１次のそれぞれについてＤＮＡを葉組織から抽出した：［１７５５、配列番号４の位置１１２３１∼１１２４８、１］解析対象である葉試料；［２］陰性対照（非トラン配列番号８、配列番号９、および配列番号１０の位置６スジェニックトウモロコシＤＮＡ）；［３］陰性水対照６∼９０、配列番号３の位置１∼２２、および配列番号（テンプレートなし）；および［４］陽性対照ＭＯＮ８２５の位置２２∼４６に対応するヌクレオチド配列と同７４１１一である。ＰＣＲプライマーＳＱ２７０６６（配列番号リコンの検出は、ＤＮＡゲル電気泳動によって可視化さ２２）およびＳＱ２６９７７（配列番号２４）は、イベれ、、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイの場合ントＭＯＮ８７４１１の右接合部にあるユニークなゲノは蛍光検出によって可視化されるであろう。ム／インサートＤＮＡの７５ヌクレオチドアンプリコン【０１１６】を増幅する。これと同じプライマー対を、蛍光標識（す 30 接合性アッセイは、あるイベントを含む植物がそのイベなわち６ＦＡＭ（商標）蛍光ラベル）されたプローブＰントＤＮＡについてホモ接合であるか、すなわち染色体Ｂ１１３００（配列番号２３）と共に、試料におけるイ対の各染色体上の同じ場所に外因性ＤＮＡを含むか、そベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡの存在を同定れともあるイベントＤＮＡに関してヘテロ接合であるかするためのＥｎｄｐｏｉｎｔ、すなわち外因性ＤＮＡを染色体対の一方の染色体上にＴａｑＭａｎ（登録商標ＤＮＡ。標準的ＰＣＲアッセイからのアンプ）ＰＣＲアッセイにおいて使用することができる。のみ含むか、それともそのイベントＤＮＡについてヌル【０１１４】、すなわち野生型であるかを決定するのに役立つ。イベ試料中のイベントＭＯＮ８７４１１に由来するＤＮＡにントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ植物の接ユニークであってその存在を検出するのに役立つ配列番合性は、熱増幅（ＰＣＲ）方法によって、またはＥｎｄ号１内の配列を増幅しかつ／またはその配列にハイブリｐｏｉｎｔダイズするように、ＳＱ２７０１１、ＳＱ９０８５、Ｐ 40 決定することができる。例えばＰＣＲ増幅の場合は、プＢ３５５２、ＳＱ２７０６６、ＳＱ２６９７７、およびライマー対ＳＱ２７０１１（配列番号１８）およびＳＱＰＢ１１３００に加えて、他のプライマーおよび／また２６９７７（配列番号２２）が、イベントＭＯＮ８７４はプローブも設計できることは、当業者には明らかなは１１インサートに隣接するゲノムＤＮＡ内でハイブリダずである。イズする。このプライマー対は、イベントＭＯＮ８７４【０１１５】１１に由来するＤＮＡが試料中に存在すれば、１１３２分子解析および配列解析に基づいて、イベント同定アッ３ヌクレオチド長のアンプリコンを生成させることになセイのためのＰＣＲアッセイをイベントＭＯＮ８７４１る。試料中のトウモロコシＤＮＡがイベントＭＯＮ８７１用に開発した。標準的な分子生物学実験実務に従って４１１に由来していない場合は、これと同じプライマー、標準的ＰＣＲアッセイまたはＴａｑＭａｎ（登録商標対が、約１５０ヌクレオチド長しかないアンプリコンを）ＰＣＲアッセイのいずれかのパラメータを、試料にお 50 生成することになる。ＤＮＡゲル電気泳動において、１ＴａｑＭａｎ（登録商標）方法によって、 ( 35 ) JP 67 2015-519051 A 2015.7.9 68 １３２３ｂｐの単一バンドは、試料中のＤＮＡがホモ接Ｒの経済的閾値を上回るＲＤＲを呈した。これらのデー合ＭＯＮ８７４１１イベントであることを示し、約１５タからの結論は、イベントＭＯＮ８７４１１は、市販品０ｂｐの単一バンドは試料中のＤＮＡがＭＯＮ８７４１ＭＯＮ８８０７１およびＤＡＳ−５９１２２−７ならび１イベントからのものではないことを示し、１１３２３に陰性対照と比べて、コーンルートワーム損傷からの保ｂｐのバンドと約１５０ｂｐのバンドの両方の存在は、護を提供するのに、明らかに優れているというものであ試料中のＤＮＡがＭＯＮ８７４１１イベントに関してヘる。テロ接合であるトウモロコシ植物からのものであること【０１２０】を示す。［表８］≦０．２５ＲＤＲを呈する植物のおよそのパー【０１１７】センテージによる効力圃場試験の結果イベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコシ植物 10 【表８】の接合性を決定するためのＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを開発することができる。このアッセイのために、３つまたは４つのプライマーと２つのプローブとが設計され、この際、［１］第１プライマー対と第１プロー試験には各試験イベントにつき１３５体の植物を含めたブは試料中のイベントＭＯＮ８７４１１。ＤＮＡの存在の検出に関して特異的であり、［２］第１プライマー対【０１２１】とは異なる第２プライマー対と、第１プローブとは異なコーンルートワームの極端な寄生圧でのイベントＭＯＮる第２プローブは、野生型トウモロコシＤＮＡの存在（８７４１１の成績を試験するために、効力温室試験を行すなわちイベントＭＯＮ８７４１１を含有しない試料）った。この試験では次のイベントを評価した：イベントの検出に関して特異的である。ＴａｑＭａｎ（登録商標 20 ＭＯＮ８７４１１、ｄｓＲＮＡだけを発現するＤＮＡベ）または類似のアッセイでは、第１プローブだけからのクター＃８９０による形質転換からのイベント、ＭＯＮ蛍光シグナルが、イベントＭＯＮ８７４１１に関してホ８８０１７、ＤＡＳ−５９１２２−７、および陰性対照モ接合である植物を示し、それに特徴的であり、第１プ。これら高圧効力試験のために、評価対象であるトウモローブと第２プローブの両方からの蛍光シグナルが、イロコシ植物を温室中の鉢で生長させた。極端な寄生圧はベントＭＯＮ８７４１１に関してヘテロ接合である植物、Ｖ２生長段階で１鉢あたり約２，０００個のＷＣＲ卵を示し、それに特徴的であり、第２プローブだけからの、次に１∼１／２週間の間隔でさらに４回、１回あたり蛍光シグナルが、野生型アレルに関してホモ接合である１鉢あたり約１，０００個のＷＣＲ卵により、各ポット（すなわちイベントＭＯＮ８７４１１に関してヌルであに合計で約６，０００個のＷＣＲ卵を加える、各鉢植える）植物を示し、それに特徴的である。植物の逐次的寄生によって達成した。ＶＴ生長段階で植【実施例５】 30 物の根を取り出し、洗浄し、ＲＤＲについて評定した。【０１１８】全１３体（Ｎ＝１３）の陰性対照植物からの根は最大根この実施例では、現行の市販品（ＭＯＮ８８０１７およ損傷、すなわち３ＲＤＲの絶対ＲＤＲを呈した。これらびＤＡＳ−５９１２２−７）および陰性対照植物と比べの結果は、イベントＭＯＮ８７４１１が、コーンルートた時の、イベントＭＯＮ８７４１１を含む植物の、コーワームの防除に関して、入手可能な他のトウモロコシインルートワーム損傷からの優れた保護を説明する。イベベントより優れていることを例証している（表９）。ントＭＯＮ８７４１１、ＭＯＮ８８０１７、ＤＡＳ−５【０１２２】９１２２−７、および陰性対照をそれぞれ１３５体の植［表９］高コーンルートワーム寄生圧下での根損傷評点物で比較する効力圃場試験を行った。根損傷評点（ＲＤ（ＲＤＲ）（Ｎ＝評価した植物の数）Ｒ）を収集した。ＲＤＲが経済的被害レベル（０．２５【表９】ＲＤＲ）未満である植物のパーセンテージを表８に示す 40 。【０１１９】表８は、イベントＭＯＮ８７４１１を含有する植物のうち、０．２５ＲＤＲの経済的閾値を上回るＲＤＲを呈し【０１２３】たのは、約４％だけであったことを示している。対照的コーンルートワームトランスジェニックイベントの効力に、ＭＯＮ８８０１７を含有する市販植物の２２％は、の一つの尺度は、温室で栽培された植物の鉢植え土壌か０．２５ＲＤＲの経済的閾値を上回るＲＤＲを呈した。らの成体甲虫の出現を決定することによる。鉢で生長さまた、ＤＡＳ−５９１２２−７を含有する市販植物の２せたイベントＭＯＮ８７４１１植物の土壌からの成体コ０％は、０．２５ＲＤＲの経済的閾値を上回るＲＤＲをーンルートワーム甲虫の出現を決定するために、上述し呈した。また、陰性対照植物の９６％は、０．２５ＲＤ 50 たものと同様に、ＷＣＲ卵を寄生させた土壌が入ってい ( 36 ) JP 69 2015-519051 A 2015.7.9 70 る鉢で１０∼１５体の植物を発芽させた。生長期間中はおけるプロモーターからの発現の向きを示している。常に各トウモロコシ植物をメッシュ袋で覆って、出現し【０１２８】た成体甲虫があれば全て入るようにした。ベクターｐＭＯＮ１２０４１７およびｐＭＯＮ１２０４【０１２４】３４におけるカセット２の相対的配向は、プロモーター上記地上成体甲虫の計数を、植物出芽の６、１２、およからの発現の向きを示すブロック矢印（図４）によってび１８週間後に行い、試験の最後に、根をＲＤＲについ図解されるように、逆である。ｐＭＯＮ１２０４１７にて評価した。イベントＭＯＮ８７４１１を含有する植物おけるカセット２からのＣｒｙ３Ｂｂコーンルートワーを陰性対照植物および他のコーンルートワーム防御トラム毒素タンパク質の発現は、カセット１から発現するコンスジェニックイベントと比べた。イベントＭＯＮ８７ーンルートワーム毒性ｄｓＲＮＡの発現の向きからは分４１１植物を鉢植えした土壌からの出現が観察された甲 10 岐している。ｐＭＯＮ１２０４３４におけるカセット２虫の数は、他のコーンルートワーム防御トランスジェニからのＣｒｙ３Ｂｂコーンルートワーム毒素タンパク質ックイベントと比べて有意に少ないという結果になり、の発現は、カセット１からのコーンルートワーム毒性ｄコーンルートワーム損傷から保護するイベントＭＯＮ８ｓＲＮＡの発現と同じ配向にある。７４１１の優れた性質が例証された。【０１２９】【実施例６】ベクターｐＭＯＮ１２０４１６とｐＭＯＮ１２０４１９【０１２５】におけるカセット２の相対的配向は、プロモーターからこの実施例では、それぞれ異なるコーンルートワーム毒の発現の向きを示すブロック矢印（図４）によって図解性作用物質の発現を駆動するトウモロコシ細胞中の２つされるように、逆である。ｐＭＯＮ１２０４１６におけの異なるプロモーターの配向が、コーンルートワーム幼るカセット２からのＣｒｙ３Ｂｂコーンルートワーム毒虫の食物に入れて提供された場合に効力を呈するトラン 20 素タンパク質の発現は、カセット１から発現するコーンスジェニックイベントの割合を、著しく改善しうることルートワーム毒性ｄｓＲＮＡの発現の向きからは分岐しを例証する。ている。ｐＭＯＮ１２０４１９におけるカセット２から【０１２６】のＣｒｙ３Ｂｂコーンルートワーム毒素タンパク質の発トウモロコシ細胞を、４つの異なる植物形質転換ベクタ現は、カセット１からのコーンルートワーム毒性ｄｓＲーｐＭＯＮ１２０４１７、ｐＭＯＮ１２０４３４、ｐＭＮＡの発現と同じ配向にある。ＯＮ１２０４１６、またはｐＭＯＮ１２０４１９のうち【０１３０】の１つで形質転換してトランスジェニックイベントを取表１０からわかるように、トランスジェニックトウモロ得し、それをトランスジェニックトウモロコシ植物に再コシ植物からの組織をコーンルートワームのＤｉａｂｒ生させた。ｏｔｉｃａ種の食物に入れて与えると、コンストラクト【０１２７】 30 ｐＭＯＮ１２０４１７またはｐＭＯＮ１２０４１６（コ図４に関して、植物形質転換ベクターはいずれも、３つーンルートワーム毒性コンポーネントの分岐発現）のどの発現カセット１、２、および３を含み、それらは一端ちらかを使った形質転換によって生成した植物は、コンをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ左境界（ＬＢ）で、またストラクトｐＭＯＮ１２０４３４またはｐＭＯＮ１２０他端をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ右境界（ＲＢ）で区４１９（タンデム配向または同じ配向の発現）のどちら切られている。コーンルートワーム毒性ｄｓＲＮＡは、かを使った形質転換によって生成した植物と比べると、４つのベクターのいずれにおいても、カセット１から、殺虫活性に関して、より有効であった（表１０）。表１強化カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ｅ３５Ｓ）０のデータによって示されるとおり、ベクターｐＭＯＮプロモーターによって発現する。ベクターｐＭＯＮ１２１２０４１７およびｐＭＯＮ１２０４１６を使った形質０４１７、ｐＭＯＮ１２０４３４中のコーンルートワー転換から生成した有効なイベントの割合は、ベクターｐム毒素タンパク質Ｃｒｙ３Ｂｂは、カセット２から、Ｚ 40 ＭＯＮ１２０４１６およびｐＭＯＮ１２０４１９からのｍ．ＰＩＩＧプロモーターによって発現する。ベクター有効なイベントの割合と比べて、有意に大きかった。例ｐＭＯＮ１２０４１６、ｐＭＯＮ１２０４１９中のコーえば、分岐プロモーターがコーンルートワーム毒性コンンルートワーム毒素タンパク質Ｃｒｙ３Ｂｂは、カセッポーネントの発現を駆動するベクターｐＭＯＮ１２０４ト２から、Ｏｓ．Ｒｃｃ３プロモーターによって発現す１７から生成したイベントの場合、４３イベントのうちる。４つのベクターのいずれにおいても、グリホサートの１１イベント、すなわちほぼ２５％のイベントが、ル除草剤耐性を付与するタンパク質ＣＴＰ−ＥＰＳＰＳＣートワームの有効な防除を呈した。対照的に、プロモーＰ４は、カセット３から、Ｏｓ．ＴｕｂＡ３プロモータターがコーンルートワーム毒性コンポーネントのタンデーによって発現する。４つのベクターのいずれにおいてム配向での発現を駆動するベクターｐＭＯＮ１２０４３も、カセット１とカセット３は同じ相対的配向にある。４から生成したイベントについては、有効なイベントが図４に関して、ブロック矢印は各カセットのそれぞれに 50 得られなかった。分岐プロモーターがコーンルートワー ( 37 ) JP 71 2015-519051 A 2015.7.9 72 ム毒性コンポーネントの発現を駆動するベクターｐＭＯ【実施例７】Ｎ１２０４１６から生成したイベントについては、２７【０１３２】イベントのうちの１７イベント、すなわち約６３％のイ強化された農学的性質、殺虫特性、または除草剤特性をベントが、ルートワームの有効な防除を呈した。対照的含むトウモロコシ植物またはその植物部分を作製するたに、プロモーターがコーンルートワーム毒性コンポーネめに、イベントＭＯＮ８７４１１を含有するトウモロコントのタンデム配向での発現を駆動するベクターｐＭＯシ植物を、潜在的に任意の他のトウモロコシイベントまＮ１２０４１９から生成したイベントについては、有効たはそれらの組み合わせを含有するトウモロコシ植物となイベントが約１８．５％しか得られなかった。これら交雑し、表現型を評価することで、その結果生じる後代のデータは、２つの異なるコーンルートワーム毒性作用植物の性質を決定することができる。限定でない一例と物質の発現を分岐した向きにそれぞれ駆動する２つの異 10 して、ＭＯＮ８７４１１を次の１つ以上の組み合わせをなるプロモーターを持つ植物形質転換ベクターからトラ含むトウモロコシ植物と交雑することができる：ＤＡＳンスジェニックトウモロコシ植物を生成させ、そのトラ −５９１２２−７；ＭＩＲ６０４；ＭＯＮ８９０３４；ンスジェニックトウモロコシ植物をコーンルートワームＭＯＮ８７４１１；ＭＯＮ８７４２７；ＴＣ１５０７；幼虫の食物に入れて提供すれば、有効イベント数が著し５３０７；ＤＡＳ−０６２７５−８；ＢＴ１７６；ＢＴく改善され、効力を呈するトランスジェニックイベント１１；およびＭＩＲ１６２。の割合が改善されることを実証している。【０１３１】［表１０］４つの植物形質転換ベクターから得られたＲ０イベントの数および有効イベントの数を示す結果【表１０】 20 ( 38 ) 【図１】 JP 【図３】【図４】【図２】 2015-519051 A 2015.7.9 ( 39 ) 【配列表】 2015519051000001.app JP 2015-519051 A 2015.7.9 ( 40 ) 【国際調査報告】 JP 2015-519051 A 2015.7.9 ( 41 ) JP 2015-519051 A 2015.7.9 ( 42 ) JP 2015-519051 A 2015.7.9 ( 43 ) JP 2015-519051 A 2015.7.9 ( 44 ) JP 2015-519051 A 2015.7.9 ──────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩＡ２３Ｋ 1/14 (81)指定国 (2006.01) テーマコード（参考）Ａ２３Ｋ 1/14 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,T M),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,R S,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB, BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,H U,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI ,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG, US,UZ,VC (72)発明者キャサリン・エイ・チャイアメリカ合衆国６３１６７ミズーリ州セントルイス、ノース・リンドバーグ・ブールバード８００番 (72)発明者シェリル・エル・クローニンガーアメリカ合衆国６３１６７ミズーリ州セントルイス、ノース・リンドバーグ・ブールバード８００番 (72)発明者デン・ミンチーアメリカ合衆国６３１６７ミズーリ州セントルイス、ノース・リンドバーグ・ブールバード８００番 (72)発明者スタニスラフ・フラシンスキーアメリカ合衆国６３１６７ミズーリ州セントルイス、ノース・リンドバーグ・ブールバード８００番 (72)発明者クンシェン・ウアメリカ合衆国６３１６７ミズーリ州セントルイス、ノース・リンドバーグ・ブールバード８００番Ｆターム(参考) 2B030 AA02 AB04 AD04 AD05 CA17 CB02 2B150 CE05 DC19 4B024 AA08 CA01 CA20 DA01 GA11 HA14 4B063 QA01 QA17 QQ04 QQ09 QQ42 QR32 4B065 AA89X AB01 AC20 BA02 CA53 QX02 QR56 QR62 QS25 QS34