分子から心機能まで―イオンチャネルと安全性評価の係わり化合物の身体への影響を測る上で、心機能特に不整脈惹起の可能性を評価することは必須となっています。本講演では評価において実際に使われる電気生理学的実験手法と、その適用について簡単にご紹介致します。鶴留一也主任研究員谷学ランチョンセミナー Biolin Scientific K.K. 2015年9月12日 © Copyright Biolin Scientific 2014 1. 2. 3. 4. 心機能安全性評価の現状電気生理学的実験手法とは心機能評価における電気生理学実験新たな技術が変える安全性評価の未来 © Copyright Biolin Scientific 2014 1. 2. 3. 4. 心機能安全性評価の現状電気生理学的実験手法とは心機能評価における電気生理学実験新たな技術が変える安全性評価の未来 © Copyright Biolin Scientific 2014 薬物の影響による不整脈発生 • 心電図におけるQT間隔延長とTorsades de Pointesへの移行正常心電図 QT間隔延長とTorsades de Pointes Fermini and Fossa (2003) Nature Reviews Drug Discovery 4 QT間隔延長の影響を与える市販薬 Fermini and Fossa (2003) Nature Reviews Drug Discovery 5 米国市場から撤回された薬品薬物分類撤回時期 Terodiline 尿失禁治療薬 1991 Sparfloxacin 抗生物質 1996 Terfendine 抗ヒスタミン薬 1998 Astemizole 抗ヒスタミン薬 1999 Grepafloxacin 抗生物質 1999 Cisapride 消化管機能改善薬 2000 Droperidol 鎮静剤 2001 Levomethadyl オピオイド依存症治療薬 2003 • 全てhERGチャネル機能への影響からくる崔不整脈効果による Presentation by ChanTest Corp. CEO at 4th ChanTest user meeting 2014 より改変 6 現在の安全性評価テスト • ICHガイドライン2005年策定 S7B (QT間隔延長の薬学的臨床前評価) E14 (QT/QTc間隔延長と崔不整脈作用の臨床的評価) • 狙い特に危険な副作用経路を防ぐ薬物のQT/QTc間隔延長作用 Torsades de Pointes (心室性頻脈の一種) などの致死性崔不整脈へのリスク  薬物のQT延長を引き起こす能力を調べる • 実施内容  Ikr電流(hERGチャネル)への影響評価(in vitro）  心電図 (臨床)でのQT/QTc評価試験電気生理学的実験にて実施 7 1. 2. 3. 4. 心機能安全性評価の現状電気生理学的実験手法とは心機能評価における電気生理学実験新たな技術が変える安全性評価の未来 © Copyright Biolin Scientific 2014 電気生理学の基本原理 • • • • 生体の電気的活動現象を電極により捉える実験対象の生物、電極、アンプにより構成される回路とフィルターにより、ノイズとシグナルを分離し、知りたい情報を得る対象とする実験規模に対応した手法が存在 9 様々な測定方法と得られるデータのスケール電気生理学的実験手法 • 電場電位記録(Field potential、 EEG) • シングル/マルチユニット細胞外電位記録(extracellular) • 細胞内記録 (intracellular)： ‒ 微小電極法 ‒ ホールセルパッチクランプ • パッチクランプ ‒ Cell attached mode ‒ Inside-out ‒ Outside-out 実験スケール、測定対象 • 皮質・脳部位規模の活動 • 局所回路の活動、単一細胞の出力 • 単一細胞での入出力 • イオンチャネル単位の分子機能 10 パッチクランプ法の様々な形態 A, B, D: チャネル単体の電流を見る C, E: 細胞全体の電流の出入りを見る C, E+単一チャネル強制発現系培養細胞: 同一チャネルを通した細胞全体の電流の出入りを見る脳科学辞典 https://bsd.neuroinf.jp/wiki/パッチクランプ法 11 イオンチャネル • • • • • • ニコチン性アセチルコリン受容体チャネル複数のサブユニットから構成ある特定のイオン種を通過させる穴を持つ穴は通常閉じており、刺激により開閉する電位依存性とリガンド依存性が存在細胞の分子生物学不活性化機構が存在ただし、あらゆることに例外あり第4版 (Alberts 他編) 第11章 Laviolette and van der Kooy (2004) Nature reviews neurosci. 12 イオンを動かす二つの力 • 濃度勾配：濃度が濃い方から薄い方へ（拡散法則） • 電位勾配：陽イオンは電位が高いほうから低い方へ（オームの法則）濃度勾配と電位勾配が逆向きでつりあう状態＝平衡状態濃度勾配が一定とすると・・・ ܴܶ ‫ܣ‬௢ ‫ܧ‬஺ ൌ ݈݊ ‫ܣ‬௜ ‫ܨݖ‬ 平衡状態となる電位差＝平衡電位 K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ - 濃度勾配 K+ 電位勾配哺乳類骨格筋 (静止電位:-90mV, 活動電位: +35mV) K+ K+ + ネルンストの式イオン細胞内 (mM) 細胞外 (mM) 平衡電位 (mV) Na+ 12 145 +65 (ENa) K+ 155 4 -95 (EK) Cl- 4 120 -87 (ECl) K+ イオンチャネル (曽我部編、共立出版) 序章 13 電気活動時のイオンの挙動神経細胞の活動電位 V: 膜電位 gNa: Na+コンダクタンス gK: K+コンダクタンス主にNa+チャネルが開く→膜電位はENaへ近づく主にK+チャネルが開く→膜電位はEKへ近づく細胞の電気的振る舞いは • 開いたチャネルのコンダクタンスと、 • そのチャネルを通るイオンの平衡電位（濃度分布）に従う From Neuron to Brain 4th edition (Nicholls 他編) Chapter 6 14 イオンチャネル病 • 心臓 ‒ QT延長症候群 (hERG, KvLQT1, Nav1.5, Cav1.2) ‒ ブルガダ病 (Nav1.5) • 脳・神経系 ‒ てんかん (Nav1.1, Nav1.2) ‒ 良性家族性新生児けいれん (Kv7.2, Kv7.3) ‒ 家族性偏頭痛、反復発作性失調症2型、脊髄小脳失調症6型 (Cav2.1) • その他 ‒ 嚢胞性線維症 Cystic Fibrosis (CFTR) 15 イオンチャネルによる生理機能操作 • 光遺伝学: チャネルロドプシンを利用し、光によって神経細胞を興奮・抑制する • グルタミン酸受容体チャネル: チャネルを通過する電流量が減少すると、シナプス前細胞からの伝達物質放出量が増加する • ASIC: pH感受性の陽イオンチャネル • TRPチャネルファミリー：温度、圧力、カプサイシン等感覚に関連するリガンドに反応する 16 1. 2. 3. 4. 心機能安全性評価の現状電気生理学的実験手法とは心機能評価における電気生理学実験新たな技術が変える安全性評価の未来 © Copyright Biolin Scientific 2014 心筋細胞の電気生理学神経科学分野心臓電気生理学分野 • 電場電位記録(Field potential、 EEG) • 心電図 (ECG) • シングル/マルチユニット細胞外電位記録(extracellular) • 臨床電気生理学的検査 • 細胞内記録 (intracellular)： ‒ 微小電極法 ‒ ホールセルパッチクランプ • 心筋細胞への微小電極法 • パッチクランプ ‒ Cell attached mode ‒ Inside-out ‒ Outside-out • 心筋発現チャネル電流測定による非臨床安全性検査 18 心臓に発現するチャネルタンパク心筋の活動電位と電流電流を担うチャネル INa : Nav1.5 主に内向き電流 ICa,L: Cav1.2 ICa,T: Cav3.1,Cav3.2 Ito1: Kv1.2,Kv1.5,Kv4.2 Ikur: Kv1.5 主に外向き電流 Ikr: hERG Iks: KvLQT1+minK IK1: Kir2.1,Kir2.2 Hoekstra et al., (2012) Front. Physiol. 時間経過と電流量のバランスが大事 • • • • • • • • 19 心臓の機能とイオンチャネル心筋が正常な電気活動を行うには・・・各イオンチャネルが、適切なタイミングで、適切な電流量を流すことが肝要！ • 閾値の変化がないか？ • 持続時間が長く/短くなっていないか？ ‒ 不活性化のタイミング • 電流量に変化はないか？ ‒ ピーク電流量 ‒ チャネルのコンダクタンス ‒ 移動した総電荷量これらの解析を、心筋に発現する各イオンチャネルに対して行う Nav1.5, Cav1.2, Kv1.5, hERG, KvLQT1+minK etc… 20 創薬における心機能評価 A, B, D: チャネル単体の電流を見る C, E: 細胞全体の電流の出入りを見る C, E+単一チャネル強制発現系培養細胞: 同一チャネルを通した細胞全体の電流の出入りを見る脳科学辞典 https://bsd.neuroinf.jp/wiki/パッチクランプ法自動パッチクランプシステムとの組み合わせにより、実験の自動化と高速化 21 1. 2. 3. 4. 心機能安全性評価の現状電気生理学的実験手法とは心機能評価における電気生理学実験新たな技術が変える安全性評価の未来 © Copyright Biolin Scientific 2014 検査による誤った評価を無くし、創薬の効率化と安全性の両立を目指す危険性の過大評価過小評価 • QT延長を引き起こすが、TdPや致 • hERG電流には影響を与えないも命的な不整脈には至らないのの、カリウム電流に対し刺激頻度依存性の影響があり、運動時な • hERG電流の減少が認められるが、どに重度の不整脈を引き起こす実際にはQT延長を引き起こさない • 多くの化合物が不適切な評価で危険と診断され、有望な薬剤候補がなかなか開発されない • 開発後期の臨床段階あるいは発売後に重篤な副作用が見つかり、多大な労力・費用をかけた開発が中止あるいは販売停止となる 23 CiPA Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay ICHガイドライン2005年策定 • S7B 主にQT延長に着目 • E14 新たなガイドラインの策定へ向けた議論より本質的な検査方法の模索 →CiPAを構成する三つの柱心毒性評価法の問題点と改善への国際的な議論 • CiPA Initiatitive ‒ FDA, HESI, CSRC, SPS (USA) ‒ Health Canada (Canada) ‒ EMA (EU) ‒ NIHS, PMDA, JiCSA, CSAHi, JSPS (日本) • In Vitroでの多種の心筋発現イオンチャネルへの薬物による影響検査 • In Silicoによる心臓の電気的活動への影響のシミュレーション • In Vitroでの人幹細胞由来心筋細胞への薬物の影響検査 24 iPS細胞由来心筋細胞での取り組み JiCSA: Japan iPS Cardiac Safety Assessment http://jicsa.org/index.html CSAHi: Consortium for Safety Assessment using Human iPS Cells http://csahi.org/index.html 25 iPS細胞由来心筋細胞での取り組み JiCSA: Japan iPS Cardiac Safety Assessment Nakamura et al., (2014) J. Pharmaol. Sci. CSAHi: Consortium for Safety Assessment using Human iPS Cells Asakura et al., (2015) J. Pharmacol. Toxicol. Methods 26 iPS細胞由来心筋細胞での取り組み Hoekstra et al., (2012) Front. Physiol. 27 iPS細胞由来心筋細胞での取り組み Hoekstra et al., (2012) Front. Physiol. 28 iPS細胞由来心筋細胞での取り組み Gibson et al., (2014) J. Pharmacol. Toxicol Methods 29 iPS細胞由来心筋細胞での取り組み Gibson et al., (2014) J. Pharmacol. Toxicol Methods 30 シミュレーションによる包括的な心機能評価 UT-Heart 東京大学久田、松浦、岡田先生のグループ最近の論文 Okada et. al., (2015) Sci. Adv. http://advances.sciencemag.org/content/1/4/e1400142 http://www.sml.k.u-tokyo.ac.jp/index.html 31 シミュレーションによる包括的な心機能評価心臓機能の包括的な再現→より実用的な薬物影響評価が可能 cisapride Okada et. al., (2015) Sci. Adv. verapamil Torsades de pointes 32 心機能評価において電気生理学の果たす役割 • ヒトiPS細胞由来心筋細胞を用い、細胞の実際の電気的活動に対する影響を調べる ‒ ヒト心筋細胞に実際に発現するイオンチャネルと細胞組織を直接試験 ‒ 患者由来の心筋細胞を用い、個人毎の影響を評価 • 心筋細胞に発現する各種イオンチャネルの基礎データ取得 ‒ 創薬研究において安価で高速な試験系により、簡易な選別 ‒ In Silicoで利用可能なマルチチャネルのデータを提供し、シミュレーションの精度向上ハイスループットで信頼性の高いデータの取得が前提となる 33 自動パッチクランプシステムと培養細胞 • • • • ハイスループット (QPatch 16-48同時記録) 自動細胞調整、ホールセル記録ギガオームシール形成による、高いデータクオリティデータベースと半自動解析機能により、大量のデータの取り扱いが可能自動パッチクランプシステムと培養細胞 Qcells (optimized) • CHO Kv1.5 • CHO hERG DUO • CHO Cav1.2 • CHO Nav1.5 • HEK Nav1.5 • CHO KvLQT/MinK Nav1.5 hERG Cav1.2 35 CiPA Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay 心筋発現イオンチャネルの電流に対する機能的影響のデータ In Silicoによる心筋細胞挙動のシミュレーション崔不整脈作用のスコアリングによる、新規化合物・薬物の包括的な評価 • より詳細な不整脈発生機序に基づく正確な影響評価 • 現実の不整脈リスクに即した順位付けによる比較 • 従来の評価活動からのスムーズな移行人iPS/ES細胞由来心筋細胞での実験データ 36