326 マウス骨髄細胞の Candida albicans 発育阻止能に及ぼす サイトカインの増強作用の評価法の検討 帝京大学医学部微生物学1），同 第二外科2），帝京大学医真菌研究センター3） 諸藤慎一郎1）2） 安部 茂1）3） 丹生 茂1） 斧 康雄1） 山口 英世3） 冲永 功太2） （平成 12 年 10 月 19 日受付） （平成 13 年 1 月 9 日受理） Key words： Candida albicans , bone marrow cells , G-CSF , GM-CSF , anti-Candida activity 要 旨 日和見感染の予防および治療法としての抗菌化学療法の効果が不充分な場合，特定のサイトカイン， 特に G-CSF をはじめとするコロニー刺激因子自身または，その産生誘導活性をもつ化合物は，Candida albicans（以下 C. albicans と略）その他の日和見菌による感染に対する予防および治療に有用と考えられ る．そうした免疫増強活性をもつ化合物の簡便，迅速でしかも高感度の評価系ならびに探索系を開発す ることを目的として，マウス骨髄細胞（BMC）の C. albicans 発育阻止能を増強する活性を指標とする in vitro 測定法を検討した．各種条件下で比較検討した結果，G-CSF とともに 24 時間前培養したシクロフォ スファミド処置マウス由来の BMC を E T 比 160 で用いた場合に最も高感度に応答し，0.005ng ml の低 濃度で C. albicans 発育阻止能の増強がみられた．同様の効果は GM-CSF でも，0.05ng ml 以上の濃度でみ られた．従って，本法は C. albicans 発育阻止能の増強という点で G-CSF や GM-CSF の免疫増強の評価な らびに探索に有用と考えられる． 〔感染症誌 序 文 固形癌，血液疾患などに対する抗癌化学療法や 75：326∼332，2001〕 した易感染患者の感染防御能を高めるためのサイ トカインなどによる免疫療法の併用が期待されて 臓器・骨髄移植などの集学的医療は副作用によ いる．しかし，サイトカイン自体を使用すること， り，患者の骨髄機能を抑制して易感染状態を招く 安全性および医療経済性の点で問題があることか 結果，日和見感染症対策が重要な課題となる．な ら，より有用性の高い新たな免疫療法薬の早急な かでも侵襲性 Candida 症をはじめとする重篤な深 開発が要望されている．それにもかかわらず，深 在性真菌症に関しては，既存抗真菌薬の予防的ま 在性真菌症，その他の日和見感染症に適用可能な たは治療的投与が奏功しない例が少なくない．こ 免疫療法薬の研究開発が必ずしも進展しておら の不完全な抗真菌化学療法の改善策として，低下 ず，その一因は簡便性と感度がすぐれた有効性評 別刷請求先：（〒173―8605） 東京都板橋区加賀 2―11―1 帝京大学医学部微生物学教室 諸藤慎一郎 価システムが確立されていないことにあると考え られる． われわれは多くの深在性真菌症に対する生体防 感染症学雑誌 第75巻 第4号 白血球の抗真菌活性とサイトカイン 御機構として重要な役割を担う好中球，マクロ ファージなどの食細胞の真菌発育阻止能を増強す る作用を高感度に測定する簡便な in vitro アッセ イ系をすでに考案しており，これを免疫療法薬検 327 ornia. USA 製；M-CSF と略） ． 使用菌株としては臨床分離株である Candida albicans TIMM1768 2）を用いた． （2）骨髄細胞（BMC）の調製 索に応用することを検討してきた1）2）．このアッセ ICR 雌性マウス（5 週齢）の大腿骨を採取し，両 イ系では成熟した白血球の真菌発育阻止能を指標 端を切り落とした後に大腿骨一本当たり PBS 2ml としているが，未熟な幹細胞から成熟した食細胞 で骨髄内を洗い流して BMC を集めた．一方，既 に分化・増殖する全過程を含めた食細胞機能増強 （塩野義製薬社，大阪 報4）5）に準じて，マウスに CY 作用を指標とするほうがより適切と考えられる． 製） を 200mg kg 腹腔内投与し，3 日後に大腿骨か 事実，幹細胞を含む骨髄細胞（以下 BMC と略）は ら BMC を採取した．トリパンブルー染色法を用 Candida albicans（以下 C. albicans と略）発育を阻止 いて生細胞数を測定し，2.5％FCS 添加 RPMI1640 する免疫増強作用を測定するエフェクター細胞と 培地で所定濃度に調整した後，実験に用いた． して使用できることが報告されている3）．近年，さ （3）培養および測定法 らにシクロフォスファミド（以下 CY と略）などに 96 穴マイクロプレートに BMC 100µl と試験物 よる免疫抑制処置を受けた動物の骨髄細胞中に出 質 50µl を含む培地で 37℃，主に 24 時間前培養し 現する未熟な幹細胞が分化・増殖誘導作用を含む た．その後，Candida albicans TIMM1768 株を 500 over-all の食細胞機能増強作用測定に適している 細胞 50µl となるように添加した．この 時 の エ 4） ことが示唆されている ．これらの知見に基づい フェクター細胞（E）および標的細胞（T）として， て正常マウス及び CY を腹腔内に投与したマウス それぞれ用いた BMC と Candida の比（E T 比）は から採取した BMC（それぞれ N-BMC および CY- 0，80 および 160 とし，各マイクロプレートを 37 BMC と略）からの食細胞の分化・誘導活性と合 ℃，16 時間保温した．本条件下では，Candida 細胞 わせて，その C. albicans 発育阻止能を増強する活 の大半は菌糸形で発育し2）6），発育量の測定を既 性を測定する方法を考案し，試験物質として各種 報2）に基いて行った．すなわち，0.125％SDS にて サイトカインをもちいて，その有用性を検討した． BMC を 除 去 し て 0.05％ の Crystal violet で 染 色 材料と方法 し，洗浄後，酸性イソプロパノールで Crystal vio- （1）培地・試薬・使用菌株 let を抽出し，抽出液の OD 値（OD590―620nm）を測 RPMI1640（日 水 製 薬 社 製）に 20mM HEPES 定した．試験物質存在下での Candida 発育率は， を添加し，カナマイシンおよびペニシリンを加え Candida を単独で培養した時の発育量を 100％ と た．それにウシ胎児血清（fetal calf serum，Biocell して OD 値より算出した．結果は各条件で，4∼6 Laboratories ， Inc . California USA 製 ； FCS と コ以上の測定値の平均値及び，その標準偏差を示 略） を 2.5％ の濃度に添加し， これを培地とした． した．また独立の実験を 2 回以上実施し，その結 試薬としては以下のものを用いた． Escherichia coli lipopolysaccharide（DIFCO Lab. Michigan USA 製；LPS と 略） ，recombinant human granulocyte colony-stimulating factor（キ リ 果の再現性を確認した． 結 果 （1）正常マウス由来 BMC の C. albicans 発育阻 止能に及ぼす前培養時間の影響 ンビール研究所より分与，G-CSF と略） ，recom- G-CSF の存在下で培養した BMC が分化・増殖 binant mouse granulocyte-macrophage colony- することはよく知られているが7）8），本研究では stimulating factor（GM-CSF Genzyme Corpora- BMC の C. albicans 発育阻止能に G-CSF がいかな tion，Massachusetts. USA 製；GM-CSF と 略） ， る影響を与えるかを前培養時間を変えて検討し recombinant mouse macrophage colony-stimula- た．正常 BMC を G-CSF を含む培地中で 0，3 ま ting factor（Santa Cruz Biotechnology. Inc，Calif- た は 24 時 間 前 培 養 し た 正 常 BMC に C. albicans 平成13年 4 月20日 328 ;;;;; ;; ;; ;;;; ;;; ; ;; ; 諸藤慎一郎 他 140 140 120 120 Relative growth of C. albicans（ %） Relative growth of C. albicans（ %） Fig. 1 （Left）Effects of G-CSF on C. albicans growth inhibition by normal mousederived bone marrow cells not preincubated （Right）Effects of G-CSF on C. albicans growth inhibition by normal mouse-derived bone marrow cells preincubated 3 hours 100 80 60 40 20 100 80 60 40 20 0 0 80 160 80 Effector to target ratio 1 µg/ml G-CSF 0.5ng/ml 1 µg/ml Untreated control Untreated control LPS G-CSF 5ng/ml G-CSF 0.5ng/ml 細胞を添加，16 時間混合培養した後，BMC の C. albicans 発育阻止能を測定した．陽性対照として は同時に白血球の C. albicans 発育阻止能増強作用 をもつことが知られている6）LPS を用いた． 前培養なしの条件下での結果を Fig. 1 に示す． 無処置対照にくらべて LPS は C. albicans 発育阻 止能増強効果を示したが，0.5 または 5ng ml の GCSF で は 有 意 な 影 響 は み ら れ な か っ た．正 常 BMC を試験物質とともに 3 時間前培養した場合 の結果も同様であった．しかし Fig. 2 に示すよう に，24 時間前培養した場合は，0.5 または 5ng ml の G-CSF は，BMC の C. albicans 発育阻止能を明 かに増強した．特に E T 160 比での相対 C. albi- 100 80 60 40 20 0 80 cans 発育率は無処置対照培養細胞では 55％ に対 し，G-CSF 0.5ng ml 添加培養細胞では 10％ に低 下した． G-CSF 5ng/ml Fig. 2 Effects of G-CSF on C. albicans growth inhibition by normal mouse-derived bone marrow cells preincubated 24 hours Relative growth of C. albicans（ %） LPS 160 Effector to target ratio 160 Effector to target ratio LPS 1 µg/ml G-CSF 0.5ng/ml Untreated control G-CSF 5ng/ml 以上の結果より，G-CSF の効果を検出するに は，24 時間の前培養の条件が好適であることがわ かった． （2）CY 投与マウス由来 BMC（CY-BMC）の C. albicans 発育阻止能に対する G-CSF の効果 正常マウス BMC と CY 投与マウス BMC の両 者を用い，様々な濃度の G-CSF に対する応答性を 比較するために，各々の BMC について，各種濃度 感染症学雑誌 第75巻 第4号 ;;;;; ;;;;;; 白血球の抗真菌活性とサイトカイン 329 Fig. 3 （Left）Effects of G-CSF on C. albicans growth inhibition by normal mousederived bone marrow cells preincubated 24 hours （Right）Effects of G-CSF on C. albicans growth inhibition by CY-treated mousederived bone marrow cells preincubated 24 hours 100 Relative growth of C. albicans（ %） Relative growth of C. albicans（ %） 100 80 60 40 20 0 80 60 40 20 0 80 160 Effector to target ratio 80 160 Effector to target ratio G-CSF 0.05ng/ml G-CSF 0ng/ml G-CSF 0.0005ng/mll G-CSF 0.5ng/ml G-CSF 5ng/ml G-CSF 0.005ng/ml G-CSF 0.05ng/ml G-CSF 10ng/ml G-CSF 20ng/ml G-CSF 0.5ng/ml G-CSF 0ng/ml の G-CSF 存在下で，24 時間前培養を行い，C. al- した．そこで，他のサイトカインの C. albicans 発育 bicans 発育率を測定した．Fig. 3（左）に示すよう 阻止能を検討した．GM-CSF は E T 160 の場合に に，E T 比 160 で正常マウス BMC の対照培養は は GM-CSF でも 0.05ng ml 以上の濃度で約 60％ 50％ の C. albicans 発育率を示すのに対し，その半 の C. albicans 発育率がみられた（Fig. 4（左） ） ． 分 1 2 以下 に C. albicans 発 育 を 抑 制 す る G-CSF （4）CY 投与マウス BMC での M-CSF の効果 の濃度，すなわち C. albicans 発育率を 25％ 以下に M-CSF でも同様の検討を行った．3.8×102ng 低下させるのに G-CSF の濃度は 0.5ng ml 以上で ml 以上の濃度で約 40％ の C. albicans 発育率がみ あることが示された．一方，G-CSF 0.05ng ml 以下 られたが，38ng ml 以下では明確な効果はみられ の濃度では明確な効果はみられなかった． なかった（Fig. 4（右） ） ． Fig. 3（右）に CY-BMC に対する G-CSF の効果 考 察 を示す．CY-BMC では 0.005ng ml 以上の G-CSF 本研究により，BMC は G-CSF 存在下で 24 時間 の存在により，E T 比 160 の場合のみならず，E 前培養することにより強い C. albicans 発育阻止能 T 比 80 の場合においても，その C. albicans 発育 を示すこと，特に CY-BMC では 0.005ng ml とい 阻止能の増強がみられた．これらの結果，G-CSF う低濃度の G-CSF で C. albicans 発育阻止能の増 は正常マウス BMC の場合（0.5ng ml）より 100 強を示すことがわかった．BMC の C. albicans 発 分の 1 の濃度（0.005ng ml）で CY-BMC の C. al- 育阻止活性については，Nozawa ら3）の報告を除 bicans 発育阻止能を明確に増強したことを示す． き，ほとんど報告されていないが，好中球につい （3）CY-BMC での GM-CSF の効果 ては報告されており，それらが G-CSF の存在によ G-CSF は CY 投与マウス BMC と 24 時間前培 り，増強される場合も知られている．Yamamoto 養することで鋭敏に C. albicans 発育阻止能を増強 ら8）は，ヒト末梢血好中球の C. albicans 発育阻止能 平成13年 4 月20日 330 ; ;;; ; ; ;; ;;;; 諸藤慎一郎 他 Fig. 4 （Left）Effects of GM-CSF on C. albicans growth inhibition by CY-treated mouse-derived bone marrow cells preincubated 24 hours （Right）Effects of M-CSF on C. albicans growth inhibition by CY-treated mousederived bone marrow cells preincubated 24 hours 200 Relative growth of C. albicans（ %） Relative growth of C. albicans（ %） 200 150 100 50 150 100 50 0 0 80 160 Effector to target ratio GM-CSF 0ng/ml GM-CSF 0.05ng/ml 80 160 Effector to target ratio GM-CSF 0.005ng/ml M-CSF 0ng/ml M-CSF 3.8ng/mll GM-CSF 0.5ng/ml M-CSF 38ng/ml M-CSF 380ng/ml GM-CSF 5ng/ml が 1ng ml 以上の G-CSF の存在下で増強される 9） M-CSF 3800ng/ml （0.005ng ml）の G-CSF で C. albicans 発育阻止能 こと， Roilides ら は， 5ng ml 以上の G-CSF が， の増強がおこった．CY-BMC は未熟な幹細胞が存 ヒト好中球による Candida albicans の菌糸状発育 在し，多糖体などに，すみやかに反応することが 阻止作用を増強することを示している．これらの 知られている4）．この結果もそれと対応している 有効性を示す G-CSF 濃度は本報告で示した，正常 と推定される．細胞群が G-CSF に応答し，更に C. マウス BMC での有効濃度（0.5ng ml）に近い．正 albicans 発育阻止能の増強を示すのかを明らかに 常マウス BMC 中には，かなり分化し，それ自身で すべく，培養前後の細胞像について詳細に検討す C. albicans 発育阻止能を有する好中球があると考 る必要があるだろう． えると，この有効濃度の一致は説明できる．事実， 内田ら6）は CY 投与マウスでは少量の G-CSF が 成熟好中球を前培養なし に 活 性 化 す る LPS に C. albicans 感染の防御に働くことを，また Sato- よって正常 BMC の抗 C. albicans 活性が増強した naka ら11）は G-CSF 産生が関与すると考えられる 結果（Fig. 1）もこの考え方を支持するであろう． 腸球菌加熱死菌製剤 FK-23 の C. albicans 感染防 この C. albicans 発育阻止能の増強のメカニズムに 御能が CY 投与マウスでのみ顕著にみられること ついては現時点では不明である．ただし，Palma を報告している．正常マウスにくらべて CY 処置 10） ら は好中球の C. albicans 発 育 阻 止 能 の LPS に マウスでは少量の G-CSF による C. albicans 感染 よる増強は，好中球から分泌されるラクトフェリ 防御能がより顕著に増強されるという所見は，本 ン等の抗真菌物質の増加が一因となることを報告 研究において示された CY-BMC の高い G-CSF 感 しており，そのような機序が上記の前培養なしで 受性によって説明されよう．さらに，ベスタチン の活性化に関係しているかもしれない． が，CY 投与マウスではより少量の投与で C. albi- CY-BMC で は 0.5ng ml の 100 分 の 1 の 濃 度 cans 感染を防御できることを示した Aoyagi ら12） 感染症学雑誌 第75巻 第4号 白血球の抗真菌活性とサイトカイン の成績は CY-BMC が G-CSF と構造的にも薬理学 的にもまったく異なる低分子免疫増強物質に対し ても高感度に応答する可能性を示唆している． CY-BMC は G-CSF のみならず，少なくとも低 濃度の GM-CSF の存在下に お い て も C. albicans 発育阻止能の増強がみられた．GM-CSF の C. albicans 発育阻止能増強作用は，BMC についてはほ とんど報告されていないが，ヒト好中球に対して はいくつかは報告されており，Blanchard ら13）お よび Richardson ら14）はそれぞれ 2.5pg ml 以上と 4ng ml 以上の GM-CSF が C. albicans 発育阻止能 を増強すると報告している．またマウス好中球と マウス GM-CSF を組み合わせた実験系は Tansho ら6）が 1.5∼6.5ng ml の GM-CSF 濃度で好中球の Candida 発育阻止能を増強することを報告してい る．このように好中球に対する GM-CSF の in vitro での効果は報告者または用いた実験系の違い によって，大きくことなるものの，CY 投与マウス 由来の BMC を用いた本研究において GM-CSF の最小有効濃度が 0.05ng ml であったことは，こ の測定系が GM-CSF に対しても好中球を用いた 系と同程度かまたはそれ以上の高感度を示す可能 性をうかがわせる． 一方，M-CSF の効果については高濃度に添加す る必要があり，その理由は不明であり，今後，さ らに検討が必要であろう． この測定法は BMC を食細胞へ分化・誘導させ C. albicans 発育阻止能を増強するサイトカインや 薬剤を高感度に検出すると考えられる．今後，こ の方法を用いて G-CSF や GM-CSF の産生誘導に 関与するような新たな免疫療法剤の検索および評 価が可能になるものと期待される．事実，一部の 漢方製剤投与血清についても評価ができた． 本論文の要旨は第 100 回日本外科学会総会，第 74 回日 本感染症学会総会で発表した． 文 献 1）安部 茂，山口英世：真菌感染に対する生体防御 能．日本医真菌学雑誌 2000；41：77―81. 2）Abe S, Satoh T, Tokuda Y, Tansho S, Yamaguchi H：A rapid colorimetric assay for determination of leukocyte mediated inhibition of mycelial growth of Candida albicans . 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In Vitro Assay Method for Augmention of Anti-Candida Activity of Murine Bone Marrow Cells by Cytokines Shinichiro MOROFUJI1）2）, Shigeru ABE1）3）, Shigeru TANSHO1）, Yasuo ONO1）, Hideyo YAMAGUCHI3）& Kota OKINAGA2） Teikyo University School of Medicine, 1）Department of Microbiology and Immunology, 2） Second Department of Surgery, 3）Teikyo University, Research center for Mycology It is important to develop a sensitive assay method for evaluation of immunomodulating candidates including granulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）which may augment host defense function against opportunistic infections. Effects of CSFs on anti-Candida activity of bone marrow cells （BMC）obtained from normal or cyclophosphamide-treated immunocompromised mice（CY-mice） were investigated. When BMC from CY-mice were preincubated for 24 hours in the presense of more than 0.005 ng ml of G-CSF, anti-Candida activity was enhanced at 160 of effector（BMC）to target（C. albicans ）ratio , whereas anti-Candida activity of BMC from CY-untreated mice was not changed at concentrations less than only by more than 0.5 ng ml of G-CSF. Similar enhancement of activity was also observed in the presense of more than 0.05 ng ml of granulocyte-macrophage colony stimulating factor（GM-CSF）in this assay using BMC from CY-mice. These findings suggest that this in vitro assay method can evaluate the activity of G-CSF and GM-CSF to augment leukocyte’ s anti-Candida activity. 感染症学雑誌 第75巻 第4号
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