Title Author(s) Citation Issue Date サメ肉腐敗の微生物化学的研究：第2報尿素分解細菌の分離及び其のUrease Activityについて木村, 喬久北海道大學水産學部研究彙報 = BULLETIN OF THE FACULTY OF FISHERIES HOKKAIDO UNIVERSITY, 6(4): 310-316 1956-02 DOI Doc URL http://hdl.handle.net/2115/22938 Right Type bulletin Additional Information File Information 6(4)_P310-316.pdf Instructions for use Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP サメ肉腐敗の微生物化学的研究第 2報尿素分解細菌の分離及び共の UreaseActivityl [ Cつい℃ 木村喬久 (~I.:背'J;豆大学水産学部水産細菌学教主的 Studiesi ntheBa c t e r i o l o g i c a l ChemistryofSbarkMuscleSpoi 1age I I . Ont b ei s o l a t i o no fur 回 s p l i t t i n gb a c t e r i aandt h e i rurea 田 a c t i v i t y Takahisa KIMURA Abstract ，theauthorhasi 鉛 l a t e du r e as p l i t t i n gb a c t e r i af r o ms p o i l i n gs h a r k I nt h ep r e s e n twork ， andob 相 v e dt h e i ru r e a 総 a c t i v i t ya n do t h e rc h a r a c t e r s . m u s c l e u l t sc a n民 s u m m a r i z e da sf o l l o w s : The陀 s 1 ) Twentyt h r e es t r a i n s(K1-K23)w e r ei s o l a t e db ye n r i c h m e n tt e c h n i q u ew i t hm e d i aa s . showni nT a b l e1 2) F i v es t r a i n s(K6，8，9，10，13)h a ds t r o n g e ru r e a s ea c t i v i t i e st h a nt h eo t h e rs t r a i n s . 3) Amongt h e s e5s t r a i n s ， o n l yo n e(K8)wasa b l et ogrowonmediumu s i n gu r e ao n l ya s n i t r o g e ns o u r c e . 4) I n3s t r a i n s(K6，8，10)amongt h o s e5s t r a i n s ，t h es t r e n g t ho fu r e a s ea c t i v i t ywasn o t nt h eo t h e rh a n d，i nt h e2s t r a i n s(K9，13)，t h e i n f l u e n c e dbye x i s t e n c eo fu r e ai nmedium，o s t r e n g t ho ft h eu r e a s ea c t i v i t yi n c r e a a d . 前報 1) に於て著者等はサメ肉の腐敗に於ける細菌群の消長及びサメ肉抽出液の u r e a s e活性の菱化を観察して，サメ肉の腐敗に於ける尿素分解の大部分が細菌の酵素によるものであり，叉細菌組成の愛化と u r 回. s e活性との聞には密接な関係があるだろうと推論した。サメ肉の腐敗に於ける尿素分解の大部分が尿素分解細菌によるものであろうと云う事はすでに清水内高橋 3)，木俣t等によっても報告されているところであり }D;妥当であると考えられる。然しながらサメ肉に於てどの緩な種類の細菌によりどの様な条件の時に最も活援に尿素の分解.が行われるか，叉腐敗生3 主物，防腐剤は勿論，此等細菌の生活環境の物迎的.化学的条件の s e活性叉は u r e a s e形成能力にどの様な影響を及ぼすか等の点に就ては殆んと明らかでない。著者菱化が U陀 a は以上の点を究明する事を終極の日的として，先ず本報に於ては腐敗過程に於けるサメ肉より後に述べる様な方法で，比絞的尿素分解に関係の深いと思われる細菌2 0 余株を分離し，各下宮の u r e a s e活性を測定比絞し，叉二三の性質を観察して若干の結果が得られたので報告する。fi，J 細菌の u r e a s e活性に関する研究は古く M u s a c l u sが尿中の尿素分解作用が 1 k f j c r o c o c c u su r e a eによる事を明らかにしてから多くの研究が報告されており，最近に於ても S t u a r t 等ラ及び F e r g u s o n中めによる B a c i l l u sρr o t e u sの u r e a s e活性， E v e l y n 等 7)によるB t ' u c e l l aの u r e a s e活性に関する研究等が報告されている。然し.之等の研究の多くは b a c t e r i aの u r e a s e により一定の細菌を他から区別する目的即ち分類学上の目的で行われたものが多い様に恩われる。 I 供書式首の分離及び分離菌の=三の性質実験方法 i)分灘方法:前報の研究の実験 E に用いた試斜について同隊の方法，即ち，鮮度の良好なホシザメ ( 1 k f u s t e l u smanazo BLMI!K~)R) を可及的に空中細菌の汚染を防いで調理肉挽して， lQgずつ殺菌綿栓ブラ -310 一 1 9 田〕木村: サメ肉の微生物化学的研究 E o スコに分け， 15-20 Cに貯蔵した試料を一定日数毎に無菌 h o m o g e n i z e rにて乳状となし，常法に従い設菌 8) 生理的食塩水で適当に稀釈し，次に述べる様な E n r i c h m e n tt e c h n i q u e able (こより細菌を分離した。即ち T 1に示した 3種の液体培地に上記試料乳液定量:を接種し 3 00Cで培養を続けると，通常24-48 時間にて混 A 濁が認められるので，その一白金耳を同一組成の Table 1 . Compositionofmedia Medium1 MediumI I Urea 30g K2HP04 0.5g C6H507Ca3 10g (Agar 20g) Water l000ml pH 7 Urea 20g . O.lg CaCI B e e fe x t . 5g NaCl O.lg K2HP04 19 培地に継代培養する。 2代目以後は菌の増殖が速 Medium1 I I 0 数時間毎に 2回継代を繰返した後，かである故 1 NH.Cl 6g 同一組成の固形靖地を用いて常法通り平板分離を MgS04 0.2g 行った。向此の様な方法によれば殆んと大部分は KH2P04 3g 同一若しくは 2種程度のコロニーとなる。叉Table Na2HPOi 6g 1に示す 3種の培地引用いた理由は先ダ medium 4g I及び Eに発育する細菌は一般に尿素細菌と云わ崎 G l u c o れているものであり，叉 mediummに発育する細 O叫￨(Agar2 附 MgS04 0 . 3 g IWater 1000ml 南は・般に n o ne x a c t i n gb a c t e r i aと云われ， N源 (Agar 2 0 g ) : pH 7 として栄養的に厳しくない菌で，いずれも比較的 Water 1000ml 尿素分解に関係が深いと思われる事によるもので pH 7 ある。叫 i i )分離閣の二三の性質としては先ず各閣の形態を常法により観察し，叉各I 宥の上記 3培地及び普通寒天培地に対する発育を斜間培養法により観察した。実験結果以上の様な方法により分離した細菌は T a b l e2に示す如く B a c i l l i1 2 株， C c c c i11 株の計'23 : 株で，此の中 mediumIにより分敵したものが KI-K3の3 株， mediumIIにより分離したものが K4-K16の1 3 株， medium lIJにより分離したものが K17-K23までの 7株である。以上 23 株の細菌は T a b l e2に示した様にいずれも普通寒天培地に良く発育し，前記 3培地に対する発育を観察した結果を同じく T a b l e2に示した。即ち N源として尿素のみ含有する medium1には K1，2，3，5，8 ，1 2 及び K22の 7株より発育し得なかったが， N源 e e fe x t r a c t をも含む mediumr rには若干の例外を除いて大部分が発育し得る，叉 N源として尿素の外に E として NH4Clのみを含む r n e d i u mm には約字数の細菌が発育した。 E 分離細菌の urease活性実験方法 i) 特殊培地による定性的測定: 実験 1に於て分離した細菌 K1-K23の23 株を S c h e i d e r 的の方法に従ぃ，指示薬として， m e t a c r e s o ls u l f o n - p h t h a l e i n を含む字国体の尿素含有特殊培養基に接種し， 3QoCにて 2 4 時間及び4 8 時間培養し，尿素の分解による指示薬の変化から u r e a 釘活性を観察した。即ち，指示薬の愛色が表面から培地の字分目までを越えるものを(H)，変色が字分目まで及ばぬものをく+)，表面だけのものをく土)， ~化のないものをく一〉とする。街尿素のみを除外した同一培地を用いて培養せるものを対照とした。 i i )Warburg検圧計による洗様商体浮滋液 ureaa活性の定量的測定: 各分離細菌を b n u i l l o n a g a r及び 2 % 尿素添加 b o ui 1 lo n 也g a rに接種し，3QOCで22-24 時間培養を行い常法用いて水を b l a n k とし透過率がに従い集菌し冷水にて 3回洗糠後光宜上ヒ色計により目立 (C)フィルターを J 30%となる様冷水に懸濁せしめ，これを酵素液として下記の如き条件で尿素の分解により生ずる CO2の量を Warburg検圧計により一定時間俸に測定し，此の量を u r e a s e活性とした。測定条件は，温度3QOCで -311- C V I ，4 北大水産糞報主室洗糠菌体穆滋液 0 .5m!，終末濃度 0.067M，p h o s p h a t eb u f f e rpH6 . 9，1 .1m! 側室 2 M 尿素溶液く終末濃度 0.4M，約 2%)0.4m! 副室 2 O %KOH，0.4m!くO. 測定用〉であり，すべての測定は自家呼吸による Oょの消費及び C02の増加を補正した。倫個々の細菌 u陀 a s eの最適同一であると考えられず，現に内野等[0、の報告によれば数種の純白百 u r e a s eの最適反tD ;pHを測定反応条件カ1 3 株の個々の最適反応条件をあらかじめ測定すし，少しずつのずれが認められたと述べているが，分離細菌2 る事は技術上困難であり，叉木研究の現段階に於てはそれまで厳密な測定を必要としないと恩われたので，木実験に於ては上記の如く Sumner等[1)が得た万豆結品 u r e a s eの最適条件である終末尿素濃度2 . 5 ， 9 五， p h o s - ] ) h a t eb u f f e rpH6 . 9をすべての菌株に適用した。叉予備実験によれば各菌株により多少の相違があったが， 450m μ ，フィルター . 10mmキューペットで，透過率30%の漆遊液は 1m!中に d r yc e l l1 .8mgを含み，此の濃ち濁度と吸光度とは直線的関係にあり B e e rの法則が成立した。度の前後に於て湾滋液中の d r yal1重量周1 Table2 . Ge 江町a lc h a r a c t e r softhei s o l a t e db a c t e r i a r 1m I Boui 1 1 o n ーー K1 2 3 4 5 C C C B C I I I I I I I 3 3 3 1 5 6 7 8 9 1 0 C C B C B I I I I I I I I I I 5 5 1 5 1 1 11 11 1 2 1 3 1 4 1 5 C C B B B I I 1 1 1 1 I I I I 2 1 24 24 24 2 1 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 B B B B B 1 1 I I I 5 1 1 7 1 7 2 8 C C B 1 1 1 I I I I I I 1 1 1 1 1 1 I I I 2 8 1 2 くA) Form ，B-Bacilli' C-Coαi (B) Usedmediumf o rt h ei s o ! a t i o n ー『曙一・一〉4 8 h r . 2 4 a h g r J a r4 8 1 1 r . ￨ + + ￨土￨土士 + 土士 + 1+ 士士一 -1 + . 1+ + 十十士 + + 十 ± + + 士十士十十 → ー + 士 → ー + 士 + + 十 → ー ++ + + + 十 → ー + + } ± 土 + 1 土十士士 ± + ++1++ ++1+十 + + + 1++ I+ 十一 + 士 = = I 1 + 十+ ++ ++ + + : t : 1+ 十十十十十 + 十十十 + 十十十 ++ ++ 十 + 十十 ++ +十 ++ 士土 →- ++ ++ ++ 十十 + + + + → ー十￨十十十 + 十+ 十十 + 士 → ー十 + 十十 ++ 十十 ± 十 + 十 + + 十+ 十十土 + 十十 + + くC) Dayso fi s o ! a t i o n ++a b u n d a n t，+m o d e r a t e，士 s l i g h t，- n e g a t i v e -312 ー 1 9 5 6 J 木村: サメ肉の徴生物化学的研究 E Table3 .S c h e i d e rt e s tofthei s o l a t e d bact 巴r i a lur ，聞記 S t r a i n N o . Urea c o n t . Urea f r e e 実験結果以上の方法により各分離菌の u r e a s e . 活性を定性的に観察した結果は T a b l e3に示した様に. u 陀a s e 活性が(+ 1 ) と判定されるものは K9の 1株のみで. (+)と判定されるものは 3株. (土〉と判定されるものが若干認められた。然し此の結果のみでは確実な判定が困難の如く思われたので，前述の方法により各菌の b o u i l l o n a g a r 及び 2 % 尿素添加士 b o u i l l o n a g a r上に発育せる菌体の u陀 a s e活性を定量的に測定した結果は Fig.1に示す如くである。 E n r i c h m e n t I を用いて分離した K6.8 .9 . mediumとして mediumI 1 0 .1 3の 5株は特異的に活性が強く，他の菌株に於ては特に注目すべき活性が認められなかった。叉この結果から見て明らかな如く二三の例外を除き一般に尿素添加培地に発育した国体は普通培地に発育したものに比し若干活性度が 3の 2菌株に於ては顕著であ増大しており，特に K9及び 1 る。以上の事実は各菌の QC()2( d r yc e 1 1 1mgが 1時間反応して生ずる CO2の量，本実験に於ては最初の 1 0 分間の反応により生じた CO2の量から計算により求めた〉を求めてみれば更に明らかに観察されるくFig.2)次に対照として当教室保存菌種の中一般に腐敗細菌と呼ばれている B a c . ++ + + ー ++ m e s e n t e r i c u sr u b e r 及ひ: P s 邸，時間o n a sf l u o r e s e n sMlGUよA 叉古くから尿素細菌の代表的菌株と云われている B a c . a l el2) が相直 u r e a s eの研究 t a s t e u r ; ;(MfQUJiJl) 及び G に用いた M ; c r o c o c c u sl y s o d e i k t i c u sの尿素添加培地に発土十一士 2 1 2 2 2 3 + 十育した国体の u r e a s e活性を前同様の方法により測定した結果は F i g . 3に示す如くである。即ち Microcoausl y s o d e - i k t i c u sのみは中程度の活性を示したが，他の 3菌は殆んと ++ c o l o r i m e t r i cr e a c t i o n( y el 1owt op u r p l e ) 注目さるべき活性を示さなかった。然し此の活性度も前述十士 d i f f u s i n gf r o mt h e surfaωandb e y o n d の 5菌株の中比較的活性の低かった K9株に相当する程度 h a l ft h el e n g t ho ft h emedium 1B a c .μs t e u r i iの間生が弱いと云う事は意外 d i f f u s i o nf r o ms u r f a c ea n dn o tb e y o n d であった。 # h a l ft h eJ e n g t h な事実であるが木市は東大応用後生物研究所より分譲され c o J o r i m e t r i cc h a n g ea ts u r f a c e たもので分類学上玉しい菌株であるにもかかわらず尿素添 n oc h a n g e 加培地に数度前培養を行っても活性の増大が認められず，分譲を受けた以前に既に酵素活性が変異したものではないかと考えられる。考察以上の実験結果から明らかな如く比較的尿素分解に関係が深いのではな v 、かと云う予想のもとに分離した細菌. 2 3 株の中特に u r e a s e活性の強かったものは 5株のみで他は殆んど注目すべき活性が認められず，此等 5 株はすべて E n r i c h r n e n tr n e d i u mとして mediumI Iにより分離されたもので K師長を除く他の4 株は N源として尿素のみの medium1には殆んど発育を示さなかった事と，叉 E n r i c h r n e n tmediumとして medium工により分離された 3株及び他の mediumにより分離されたものの中 mediumIに発育可能だった 4株の計 7株 -313- ( V I ，4 - じオ大 7 1 < .産実報 ;;乙ィつ m l / ーーで 4 0~ K18 2 0ト命宅三 = = = = - C4 二 ιv 。 l 4 C t 。 ; こ l z 去二二 i J K6 。 ~Kl:-一一一一・お0 2 0ト / 、 3 06 09 0 I~O 1~0 320l 伺~ K20 2 8 0 ・L-....I..- 2 4 0 ゆ 9 01 2 01 5 0 3 0 6 IK21 仰ト 2 0 0 outF1 ; : ピィート-ー. 2 0 。勺。 609Mio1m0 炉ー 4 0 o 3 泡 6 0 9 01 2 01 5 0 IK7 4 0ト 2 0~.) ( ~ 30 6 09 01 2 01 5 0 m ν 2ァイ ι7 8 0 IK23 ' ー ' 幽ーーー品 o1 2 ( 11 S t . 6 09 mm. Kl0 K9 K8 3 6 0 2 0 0 OHWOU 6 '200 崎町W 2 4 0 : t 2 8 0 。向1 2 4 0 円 () 2 0 0 u 自 1 6 0 1 2 0 1 2 0 凶 1 6 0 1 6 0 1 2 0 1 2 0 8 0 8 0 8 0f 8 0 4 0 4 0 4 0 4 0 。 3 0 6 09 01 2 01 5 0 。 3 0 60ω1201 5 0 Time •• 3 2 0 ・・ 2 8 0 3 6 0 ι 3 2 0 晶 2 8 0 一 ' ・ . ' / . ' aEa ynU 肉 4azay 3 2 0 ， " 一 3 6 0 // 3 2 0 P .ιe ，，，，， . . ・ . • 3 6 0 K13 ，， . ム . . .. a三。 3 06 0 9 01 2 01 5 0 。 3 0 6 09 01 2 01 5 0 mm. . Theu F i g .1 r e a 田 a c t i v i t yo fc e l ls u s p e n t i o no ft h ei 田 l a t e db a c t e r i at h a t wase s t i m a t e da t1 0m i n u t si n t e r v a l si nr e a c t i o nb yW a r b u r g ' s a p p a r a t u sa tpH7.1a n d30C • t h ec eJ lg r e w002 %u r e ac o n t a i n i n gb o u i l l o na g a r othecellgrewonu陀 a-freebouilIonagar 0 -314ー 1 9 5 6 J 木村: ザメ肉の微生物化学的研究 E 則一即一回一則一同一同一附 2 0 0 A 1 6 0 i f : 一一-4 -唱え同 O υ凶 1 2 0 8 0 B c D 3 0 6 0 9 0 1 2 0 1 5 0 Timemin. 舘 a c t i v i t y F i g .3 . Theurea o fc e l lof 4speci回 of p r e s e r v e dc u l t u r e swhich o n grewon2%町田 c t a i n i n gb o u i l l o nagar 民2 2 K23 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 o n 6 0 0 7 0 0 (Urease) . TheQCO.(urea 記)ofthei s o l a t e db a c t e r i a F i g .2 T h e s ew e r ec a l c u l a t e df r o mt h ei n i t i a l1 0m i n u t e sr e a c t i o n . • t h ec e I Ig r e wo n2%u r e ac o n t a i n i n gb o ui l I o na g a r otheceIIgrewonurea-freebouiIIonagar QC02 T h e s er e s u l t sw e r ee s t i m a t e d i nF i g .1 . くA)M i c r o c o c c u sl y s o a e i k t i c u s (B)B a c .m e s e n t e r i c u sr u b e r くC)B a c .向 s t e u r i i(MIQU~JL) (D)P se 臨加n onasi l u o r e s c e n s M l(}ULA の中 K8株を除く他のI 若株には殆んど活性が認められなかった事から N源として尿素のみを含む培地に発育し得る細菌と云えども必ずしも u r e a s e活性が強いとは限らず大多数は尿素を増殖に利用する際分解と云う過程を取らず他の方法により直接利用するものではないかと考えられる。木俣等13)及びZo b e I I 等 14)は海洋に於ける尿素分解細菌に関する研究を行い尿素分解細菌は次の 3型に分類されると指摘している。即ち a) N源として尿素のみでも充分発育を遂げるが強力なる尿素分解作用を営まぬもの b) N源として尿素のみでも充分発育し且つ旺盛な尿素分解を行うもの c) N源として尿素のみが存在する場合には全〈叉は殆んど発育しないが他の有機分解物が共存すれば充分発育し一旺つ旺盛な尿素分解を行うもの，等である。併し著者等の分離した前述の 5株の中 K8株はめに属するものと恩われ叉 K6，9，1 0，1 3の 4株はのに又 K1，2，3，5，14，22はめに属するものではないかと考えられる。然し前記 5株はいずれも全然尿素を含まぬ培地に発育した菌体でも相当の U陀 a s e活性が認められ，特に K6，8，1 0の 3株は尿素を含む培地に発育した菌体も，含まぬ培地に発育した菌体も殆んど同程度の活性を示し発育の際の存在には殆んど無関係の ← 3仔ー ( V I， 4 北大水産糞報如くであり，此等の菌株に於ては u r e a s eは構成酵素的に生産されるものではないかと考えられる。一方 K9， 1 3の 2株に於ては尿素を含む培地に発育した菌体は明らかに活性が増大を示しており特に K9株に於ては著 s eが適応的に増大されたものであろうと考えられる O いずれにしろ腐敗過程にしく，此等 2菌株に於て U陀 a s e活性の強い細菌 5株を分離する事が出来，此等の活性は Fig.3に示す様な於げるサメ肉から特異的に u犯 a 他の一般腐敗細菌のそれに比しはるかに強力であると云う事実から考えて此等の細菌がサメ肉の腐敗に於ける尿素分解に主要な役割をなしているだらうと云う事は当然考えられる事で，今後此等の細菌の u r e a s eの特 r e a s e生産にどの様な影響を及ぼすかを究明する事により板鰍類魚異性並びに生活環境の物理化学的条件が u 肉の ammonia発生機構解明の一助となり得ると考えられる。要約前報に引続き腐敗進行過程に於けるザメ肉より T able1に示す 3磁の培地を J H v. 、 Enrichmenttechnique により比較的尿素分解に関係の深いと思われる細菌23 株を分続し.その U陀 a s e活性を観察せるに 23 株の細菌の中 K6，8，9，1 0，1 3の計 5株が特異的t こ活性が強く，此の 5種の中 N源として尿素のみの培地に発育し得たものは K8の 1株のみであった。叉 K6，8，1 0の 3株に於ては培地中の尿素の存在にその活性度は殆ん r e a s eは構成酵素的に形成され，叉 K9，1 3の 2株に於ては培地に尿素を添と影響されず此の 3株に於ては u 加する事により活性度が増大し，此等に於ては適応的に形成するものと考えられる。いずれにしろ此の様な活性度の高い菌種はサメ肉腐敗に於ける尿素分解の主要な役割をなすであらうと推察した。終りに臨み，i$:報告の御校関を賜った本学谷川教授，直接実験の御指導を賜った本学故長尾助教唆，菌株 ( B a c .μ s t e u 1 ' i iMIQUFL)の分識を賜った東京大学応用微生物研究所飯塚助教授並びに実験の一部を担当された本学学生川村善迭の諸氏に深甚の謝意を表する次第である。 f l . j 木研究費の一部は文部省科学研究助成金に依るものであり，教に感謝の意を表する。文献 1 ) 木村喬久・長尾清 ( 1 9 5 5 )北大水産急報 5 ，3沼. 2) 清水豆・日引重幸く1 9 5 1 ) 日水誌 1 9，139. 9 5 1 ) 日水誌 1 5 ，7 7 7 . 3 ) 高橋豊雄・問中武夫く1 .( 1 9 5 3 )R e s .I n s t .F似， I d .& i.，KyotoU n i v .5 ，5 5 . 4) Kimata，M.& Hata，Y .A .& VanS t r a t u m，E .& R u s t i g i a n，R .(1~45)]. Baa.4 9 .437. 5 )S t u a r t，C .E .(1943)].La b .C l i n .Med.2 8 ，1 7 1 5 . 6) F e r g u s o n，W.W.& Hook，A 7 ) E v e l y n，S .& J u a n i t a，W.( 1 951)].B a c t .6 2 ，5 9 1 . 1 9 5 2 )千葉大学腐敗研究報告5， 7 9 . 8 ) 佐竹一夫・林誠・安藤宗八・竹内秀夫・藤田久稔 ( c h e i d e r ，M.D.& Gunderson. M.F.(1946)].Bact.5 2 ，3 ' 回. 9 ) S 1 0 ) U t z i n o ，S .& Imaizumi，M.& Nakayama，M. ( 1 9 3 8 ) ] .B i o c h e m .2 7 ，2 5 7 . .J .& Holloway ，G.R.(1928)].Biol.Chem.7 6 ，149. 1 1 ) Sumner B 司 ∞ . 1 2 )G a l e，E .F .& Helen，M.R .E .( 1 9 4 2 )B iochem.].3 6 ，6 1 3 ) 木俣正夫・畑幸彦 ( 1 9 2 7 ) 日本海区水産研究所創立三週年記念論文集 1 3 5 . 1 4 ) Z o b e l l，C .E .& Fetham ，C .E .( 1 9 3 5 )S c i e n c e8 1，234. -316 ー