Res. Org. Geochem. 25, 7183 (2009) 〔有機地球化学会 30 周年記念事業地球・環境有機分子検索マニュアル No.20〕技術論文アミノ酸（エトキシカルボニル / エチルエステル誘導体）の GC/MS による解析 * , , 山口保彦 ** *** ****・力石嘉人 ****・横山祐典 ** , ***, ****・大河内直彦 ***, ****, ***** （2008 年 12 月 12 日受付，2009 年 4 月 6 日受理）きた（e.g. Meierhenrich et al. 2004）。ただしアミノ 1. はじめに GC/MS によるアミノ酸の分析手順は , 一般的に，（1）試料の酸加水分解，（2）精製と誘導体化，（3） GC/MS による測定で構成される。アミノ酸に揮発性を持たせるために様々な誘導体化法が用いられており，tert-ブチルジメチルシリル化（tBDMS: MacKenzie et al. 1987），トリフルオロアシル / イソプロピルエステル化（TFA/iPr: Engel et al. 1990），ペンタフルオロアシル / イソプロピルエステル化酸同位体組成分析への応用例は少なく，しかもその多くが 15N や 13C のラベル実験の分析であり（e.g. Montigon et al. 2001; Godin et al. 2007），同位体の天然存在度分析に用いられた研究は，我々の知る限り数例が見られるのみである（Sacks and Brenna, 2005; Pan et al. 2007）。本誘導体化の長所としては，20 種のタンパク性アミノ酸のうち，グルタミンやアスパラギン，トリプトファンなど，他の手法では誘導体化が難し（PFA/iPr: Pelz et al. 1998），ピバロイル / イソプロピルエステル化（Pv/iPr: Metges et al., 1996），エいアミノ酸を含む，19 種が誘導体化可能という点トキシカルボニル / エチルエステル化（EtOC/Et: Montigon et al. 2001）などが一般的である。イミノ基に対して反応が進まず，誘導体化ができが挙げられる。例外としてアルギニンは，側鎖のない。また，本誘導体化のもう一つの大きな長所本報で注目するアミノ酸のエトキシカルボニル / エチルエステル誘導体化は，Husek et al. (1991) にとして，処理の簡便さが挙げられる。他の誘導体よって初めて導入され，主に食品・医療などの研水の存在下では反応が進まないなど，処理や準備究分野でアミノ酸の定性・定量分析に用いられてに手間がかかることが多い。一方で本誘導体化は，常温・水層における 1 段階反応である上，反応そきた。地球惑星科学分野では例えば，隕石アミノ酸の D/L 分離の前処理などにしばしば用いられて化法では，複数段階反応や加熱を必要としたり，のものは 5 分ほどで完了する。以上に述べた長所 * GC/MS analysis of amino acids as ethoxycarbonyl ethyl ester ** 東京大学海洋研究所〒 164-8639 東京都中野区南台 1-15-1 Yasuhiko T. Yamaguchi and Yusuke Yokoyama: Ocean Research Institute, The University of Tokyo 1-15-1 Minamidai, Nakano-ku, Tokyo 164-8639 Japan *** 東京大学大学院理学系研究科地球惑星科学専攻〒 113-0033 東京都文京区本郷 7-3-1 Yasuhiko T. Yamaguchi, Yusuke Yokoyama and Naohiko Ohkouchi: Department of Earth and Planetary Science, The University of Tokyo 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0033 Japan **** 独立行政法人海洋研究開発機構海洋・極限環境生物圏領域〒 237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2-15 Yasuhiko T. Yamaguchi, Yoshito Chikaraishi, Yusuke Yokoyama and Naohiko Ohkouchi: Institute of Biogeosciences, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology 2-15 Natsushima-Cho, Yokosuka 237-0061 Japan ***** 東京工業大学大学院総合理工学研究科化学環境学専攻〒 226-8502 神奈川県横浜市緑区長津田町 4259 Naohiko Ohkouchi: Department of Environmental Chemical Engineering, Tokyo Institute of Technology 4259 Nagatsuda, Midori-ku, Yokohama 226-8502, Japan e-mail: [email protected] −71− 山口保彦・力石嘉人・横山祐典・大河内直彦 (a) Protein L--amino acids (a-1) Essential (indispensable) (b) Non-protein amino acids * (a-2) Non-essential (dispensable) iVal 5-ALA * Arg His Ala * Asn 3-ABA 2-AAA * Ile Cys Asp Leu Sar Hyp * Lys Gln Met Glu -Ala * Phe Thr Gly Pro 3-AiBA Orn * 1MH * Trp Val Ser Tyr GABA 3MH （*: Chiral center） Fig. 1. Chemical structures of amino acids: (a-1) essential and (a-2) non-essential protein L-α-amino acids, and (b) typical non-protein amino acids. Abbreviations refer in Table 1. から，アミノ酸のエトキシカルボニル / エチルエ 3. 分析方法ステル誘導体化は今後，有機地球化学を含む様々な地球惑星科学分野の研究（特にアミノ酸の窒素 3.1. アミノ酸の抽出と誘導体化同位体組成分析）で応用が広がっていくことが期アミノ酸の抽出とエトキシカルボニル / エチルエステル誘導体化の分析手順を Fig. 2 に示す。通待される。本報では，その誘導体化法と GC/MS 分析法（同常，試料に含まれるタンパク質に含まれるタンパ定法）を紹介する。GC/MS による同定法の先行研ク質を分析したい場合にはまず，12 規定（mol/l）究としては，25 種類のアミノ酸誘導体化体について報告した Huang et al. (1993) が挙げられるが，塩酸によって酸加水分解（100℃，12-24 時間）することが多い。ただし加水分解の過程でアスパラ本報では新たに 10 種類の非タンパク性アミノ酸ギン・グルタミンはそれぞれアスパラギン酸・グ（Table1 の No.1, 4, 5, 6, 7, 13, 20, 23, 26, 27）を加えルタミン酸に変換されてしまうので，本報の代表た同定法を報告する。 2. 試試料では加水分解は行わず，試料に含まれる遊離体アミノ酸を直接，誘導体化した。まず試料（シ料代表試料として，「ハイパードルフィン」調ロウリガイ，ダイコン，イカナゴ）に含まれる組織液を 1 ml 抽出し，有機溶媒（ジクロロメタン /n- 査潜航（NT08-10，Dive#846）において相模湾ヘキサン）での液 -液抽出により脱脂した。次に，初島沖の冷湧水域から採取されたシロウリガイ（Calypotogena sp.），青森県で栽培されたダイコン水：エタノール：ピリジン：エチルクロロフォルメイトが体積比で 20:10:2.5:1 になるように，試料（Raphanus sativus），瀬戸内海で採取された魚（イカナゴ，Ammodytes personatus）の分析結果を示す。水溶液 1 ml に対しエタノール 500 μl とピリジン 125 μl を加えて軽く振り混ぜた後，エチルクロロ −72− No. Compoud Abbreviation formula Molecular weight Prominent fragment ions (m/z) Level of Retention time identification** (min) underivative derivative Base Others 1 Sarcosine* (2-amino-N-methylethanoic acid) Sar C8H15NO4 89 189 18.7 116 88, 70, 44 2 Alanine Ala C8H15NO4 89 189 19.0 116 189, 88, 72, 44 4 75 175 19.2 102 4 3 Glycine Gly C7H13NO4 (2-amino-2-methylbutanoic acid) iVal C10H19NO4 117 217 20.5 144 188, 116, 98, 72 4 Isovaline* 3-AiBA C9H17NO4 103 203 20.8 130 102, 84, 58 4 5 3-Aminoisobutyric acid* (3-amino-2-methylpropanoic acid) (3-aminopropanoic acid) 89 189 21.2 115 189, 144, 116, 102, 98 4 C8H15NO4 6 β-Alanine* β-Ala 103 203 21.7 102 158, 130, 129, 112, 84 7 2-aminobutyric acid* 2-ABA C9H17NO4 117 217 21.9 144 116, 72 4 8 Valine Val C10H19NO4 129 157 23.2 84 157 4 9 pyro-Glutamic acid p-Glu C7H11NO3 131 231 23.8 158 102, 86 4 10 Leucine Leu C11H21NO4 105 205 24.1 132 175, 129, 101, 86 4 11 Serine Ser C8H15NO5 131 231 24.1 158 102, 86 4 12 Isoleucine Ile C11H21NO4 (4-aminopentanoic acid) GABA C9H17NO4 103 203 24.2 116 158, 130, 112, 102, 86 13 4-aminobutyric acid* 119 219 24.2 129 175, 146, 101, 74 4 14 Threonine Thr C9H17NO5 115 215 24.6 142 98, 70 4 15 Proline Pro C10H17NO4 132 214 25.1 141 174, 102, 69 4 16 Asparagine Asn C9H14N2O4 133 261 28.1 188 142, 116, 74, 70 4 17 Aspartic acid Asp C11H19NO6 (4-hydroxypyrrolidine-2-carboxylic acid) Hyp C10H17NO5 131 231 29.2 158 86, 68 4 18 Hydroxyproline* 149 249 29.6 175 188, 176, 142, 129, 101, 61 4 19 Methionine Met C10H19NO4S 5-ALA C11H21NO4 131 231 29.6 129 186, 158, 140, 101 20 δ-Aminolevulinic acid* (5-amino-4-oxo-pentanoic acid) 147 275 30.7 202 156, 128, 84 4 21 Glutamic acid Glu C12H21NO6 165 265 32.0 176 192, 131, 120, 102, 91, 74 4 22 Phenylalanine Phe C14H19NO4 (2-amino-hexanedioic acid) 2-AAA C13H23NO6 189 289 32.9 216 170, 128, 124, 98 23 2-Aminoadipic acid* 121 293 33.0 220 174, 148, 114, 102, 74 24 Cystine Cys C11H19NO6S 146 246 34.1 84 173, 128 4 25 Glutamine Gln C10H18N2O5 (2-amino-3-(3-methylimidazol-4-yl)propanoic acid) 3MH C12H19N3O4 169 269 36.3 95 196, 180, 96 26 3-Methylhistidine* (2-amino-3-(1-methylimidazol-4-yl)propanoic acid) 1MH C12H19N3O4 169 269 36.6 95 196, 180, 150, 96 27 1-Methylhistidine* (2,5-diaminopentanoic acid) Orn C13H24N2O6 132 304 36.9 142 258, 212, 70 28 Ornithine* 146 318 38.8 156 272, 226, 84 4 29 Lysine Lys C14H26N2O6 155 327 39.8 238 327, 282, 254, 154, 81 4 30 Histidine His C14H21N3O6 181 353 41.7 107 280, 264, 192 4 31 Tyrosine Tyr C17H23NO7 204 304 43.8 130 304, 231, 215 4 32 Tryptophane Trp C16H20N2O4 Peak numbers refer to chromatogram in Fig.2 (Sar, iVal, 2-ABA, GABA, 5-ALA, 2-AAA, Cys, 3MH, 1MH and Orn were obtained by authentic standards, but not found in the samples presented in this paper) and spectra in Fig.3. *: Non-protein amino acid (IUPAC name in bracket) **: All compounds are identified by coincidence in GC retention time and mass spectra with those of authentic standards. Table 1. Summary of retention time and prominent fragment ions for ethoxycarbonyl-amino acid-ethyl esters アミノ酸（エトキシカルボニル / エチルエステル誘導体）の GC/MS による解析 −73− 山口保彦・力石嘉人・横山祐典・大河内直彦フォルメイト 50 μl を加えた。バイアルの栓を固く締めて 10 秒ほどよく振り，常温で 5 分静置した。 Samples * Decarbonated (2mol/l HCl) & dried up by N2 stream (at 100) * HCl hydrolyzed (1ml of 12mol/l HCl at 100 for 12-24h) その後，炭酸水素ナトリウム飽和水溶液を 1 ml 加えた。最後に水 -有機溶媒（ジクロロメタン /n-ヘ * Filtrated (removed solid matter) Defatted (dichloromethane/n-hexane 6:5, v/v, 2mlx3) * Removed impurities (cation-exchange column chromatography) キサン）での液 -液抽出により，アミノ酸のエトキシカルボニル / エチルエステル誘導体化体を得た。 * Dried up by N2 stream (at 100) Amino acids Esterified (sample water/ethanol/pyridine/ethyl chloroformate, 20:10:2.5:1, v/v, at room temperature for 5min) 3.2. GC/MS 分析 Added 1ml of saturated sodium hydrogen carbonate solution GC/MS 分析は，Agilent HP 6890 ガスクロマト Extracted with dichloromethane/n-hexane (6:5, v/v, 2mlx3) グラフ /HP MSD 5973N 質量分析計を用いた。導入法は PTV 法を用い，50 ℃ で 0.2 分間保持し， Ethoxycarbonyl/amino acid/ethyl esters 350℃まで 600℃ / 分で昇温した後，350℃で 10 分間保持した。分析カラムは，J&W HP-5MS（30 m 長，0.25 mm 径，0.15 μm 膜厚）を使用し，40℃で GC/MS & GC/C/IRMS Fig. 2. Extraction and derivatization procedures of amino acids. Asterisks indicates optional processes. 4 分間保持し，90℃まで 10℃ / 分で昇温し，90℃ から 220℃まで 5℃ / 分で昇温した後，220℃で 10 分間保持した。キャリアーガスの流速は，1.4 ml/ Fig.3 (a) Deep-sea clam (Calyptogena sp.) 22 3 31 29 2 12 14 10 15 8 5 6 911 19 32 17 18 30 21 16 Intensity (b) Radish (Raphanus sativus) 25 22 13 8 14 17 11 10 15 16 31 21 19 29 30 29 30 22 (c) Fish (Ammodytes personatus) 32 31 10 14 2 8 6 3 19 15 11 9 12 16 17 32 21 20 25 30 35 40 Retention time (min) Fig. 3. TIC chromatograms of amino acids from (a) deep-sea clam, (b) radish, and (c) fish. Peak numbers correspond to the compound numbers in Table 1 and Fig.4. −74− アミノ酸（エトキシカルボニル / エチルエステル誘導体）の GC/MS による解析分の定流速（constant flow）モードで使用した。ピークとして見られる。 Fig. 3 に，各試料の分析で得られた TIC クロマ酸性アミノ酸であるアスパラギン酸（Fig. 4, No. 17），グルタミン酸（Fig. 4, No. 21），2-アミノアジピン酸（Fig. 4, No. 23）では，[M − 73] + が基本のトグラムを，Table 1 に，同定レベルを示す。アミノ酸のエトキシカルボニル / エチルエステル誘導イオンフラグメントとなる。グルタミン酸ではさらに，[M − 73] + から C2H5OH が脱離して五員環体化体の基本的なマススペクトルは，エチルエステル基が脱離した [M−45]+，エトキシカルボニル構造をとった m/z156 と，さらに ‐ 73 ＋ H+ で生じる m/z 84 が安定であるため，大きなピークとし基が脱離した [M−73] +，エトキシカルボニル基二つが脱離して H+ がアミノ基に付加した [M−145] + て見られる。2-アミノアジピン酸も同様の機構で， m/z170，m/z98 を示す。なおグルタミン酸は，誘導 4. 分析結果などに対応したイオンフラグメントを示す。各ア体化の際にカルボキシル基とアミノ基の分子内縮ミノ酸に特有な開裂も多いので，代表的なものを，以下に簡単に紹介するほか，Fig. 4 では構造式に合により，ピログルタミン酸（Fig. 4, No. 9）を生成する。誘導体化の条件が酸性であるほど，ピログ開裂パターンを示した。詳しい開裂のスキームは， Huang et al. (1993) を参照されたい。ルタミン酸がより多く生じる（Husek et al. 1991）。メチオニン（Fig. 4, No. 19）とシステイン（Fig. 4, 側鎖が C2 以上の脂肪族アミノ酸である，2-アミノ酪酸（Fig. 4, No. 7），バリン（Fig. 4, No. 8），ロイ No. 20）は，硫黄原子の影響を受けた開裂を示す。メチオニンは，硫黄原子で活性化された側鎖末端シン（Fig. 4, No. 10），イソロイシン（Fig. 4, No. 12）は，側鎖と α 位炭素の結合が開裂して，m/z174 のの水素がカルボキシル基に移行して（McLafferty 転位），トレオニンやセリンと同様に m/z175，m/ イオンフラグメントを示す。さらに，エチルエステル基やカルボニル基が脱離した，それぞれ m/ z 129，m/z101 を示す。また，スルフォニウム z129，m/z102 のイオンフラグメントも示す。イソバリン（Fig. 4, No. 4）は，α 位炭素に水素ではなくメチル基が結合しているので，m/z188 を示す。ヒドロキシル基を持つセリン（Fig. 4, No. 11）とトレオニン（Fig. 4, No. 14）は，m/z175，m/z 129， m/z101 を特徴的に示す。m/z175 は，McLaffertytype 転位（水素が転位する特殊な McLafferty 転位；Huang et al. 1993）によってヒドロキシル基のイオン（CH3SCH2+）の脱離によって，m/z61，m/ z188 も示す。システインでは，バリンなどと同様に m/z174 を示すほか，McLafferty 転位によって NH2COOC2H5 が脱離して m/z204 を示す。芳香族アミノ酸である，フェニルアラニン（Fig. 4, No. 22），3-メチルヒスチジン（Fig. 4, No. 26）， 1-メチルヒスチジン（Fig. 4, No. 27），ヒスチジン（Fig. 4, No. 30），チロシン（Fig. 4, No. 31），トリ水素がカルボニル基の酸素に転位して生じ，続いプトファン（Fig. 4, No. 32）では，側鎖の脱離と， McLafferty 転位による NH2COOC2H5 の脱離が起きて C2H5OH が脱離して五員環構造をとると m/z 129 に，さらに C2H4 が脱離すると m/z101 となる。また，やすい。また，トリプトファンでは，特異的に親イオン m/z304 が大きなピークとして見られる。プロリンにヒドロキシル基が置換した構造のヒドロキシプロリン（Fig. 4, No. 18）では，[M − 145] + 塩基性アミノ酸である，オルニチン（Fig. 4, No. 28）とリシン（Fig. 4, No. 29）は，分子内求核置換で生じた m/z86 から，さらにヒドロキシル基が脱水して m/z68 を特徴的に示す。反応機構によって，[M − 73] + から NH2COOC2H5 アミド基を持つアスパラギン（Fig. 4, No. 16）とグルタミン（Fig. 4, No. 25）では，アミド基は誘導が脱離して安定な環構造をとることで，それぞれ m/z142，m/z156 を大きなピークとして示す。また，体化されない。特にアスパラギンでは，誘導体化親イオンから C2H5OH が脱離して環構造をとることで，それぞれ m/z258，m/z272 を示す。の際にアミド基が脱水してシアノ基となるため，親イオンは m/z214 となる。グルタミンではアミドしかしこれらのアミノ酸は，ロイシン（Fig. 4, No. 10）とイソロイシン（Fig. 4, No. 12）のように，基はそのままで，[M − 73] + が五員環構造をとった後に NH2COOC2H5 が脱離した m/z84 が大きな構造異性体であることが多く，そのフラグメントパターンは非常に類似していることが多い。アミ −75− 山口保彦・力石嘉人・横山祐典・大河内直彦 Fig.4 M-45 Common fragment ions for ethoxycarbonyl ethyl ester M-73 M-73+H+ M-45 No.1, Sar M-73 116 44 70 88 189 M-73 Intensity 116 44 72 M M-45 88 189 144 MW=189 9 No.3, Gly M-73 102 74 56 M-45 M 130 175 MW=175 5 No.2, Ala M 144 MW=189 M-45 No.4, iVal M-73 144 188 -72 116 M-145 72 55 98 188 116 m/z MW=217 Fig. 4. Mass spectra of amino acids as ethoxycarbonyl ethyl ester derivatives. Compound numbers correspond to the compound numbers in Table 1 and the peak numbers in Fig. 3. −76− アミノ酸（エトキシカルボニル / エチルエステル誘導体）の GC/MS による解析 No.5, 3-AiBA M-73 130 M-145 58 84 102 M-45 M 158 203 MW=203 No.6, -Ala 115 M-73 102 116 M-45 144 98 70 M 88 189 160 MW=189 174 No.7, 2-ABA Intensity -72 -45 102 129 102 56 74 112 84 129 158 130 M-45 M-73 M 203 174 174 M-73 No.8, Val MW=203 MW=2 2 144 M-145 55 98 102 116 129 72 M 174 MW=217 7 217 No.9, p-Glu M-73 84 M 157 m/z −77− MW=15 5 MW=157 山口保彦・力石嘉人・横山祐典・大河内直彦 No.10, Leu M-73 158 102 M 129 86 Intensity No.11, Ser MW=231 1 M-73 132 M-145 86 60 129 101 74 175 MH+ 102 206 231 174 No.12, Ile MW=205 M-73 158 102 129 M 86 174 No.13, GABA 231 MW=231 1 116 116 86 102 112 M-73 M-45 130 158 M 203 MW=203 No.14, Thr 101 129 M-145 100 74 M-73 102 175 146 MW=219 MW 219 m/z −78− アミノ酸（エトキシカルボニル / エチルエステル誘導体）の GC/MS による解析 No.15, Pro M-73 142 M-145 70 98 114 M-45 M 170 215 MW=215 MW=2 174 No.16, Asn M-145 M-73 69 141 102 No.17, Asp 214 MW=214 M-73 Intensity M 174 188 M-145 142 116 M-45 M 216 261 MW=261 No.18, Hyp M-73 158 68 M-145 M 86 96 186 213 231 MW=231 MW MW=2 2 H+ 175 No.19, Met 61 61 188 129 175 M-73 101 114 142 157 M 176 188 203 249 MW=249 m/z −79− 山口保彦・力石嘉人・横山祐典・大河内直彦 102 No.20, 5-ALA 129 101 102 M-45 M-73 140 186 158 M 231 84 M-73 156 202 128 M-45 183 230 M 275 MW=275 No.22, Phe Intensity 91 91 174 176 176 M-73 102 192 120 131 148 M H+ 265 No.21, Glu MW=231 MW=265 No.23, 2-AAA M-73 216 98 170 124 128 M-45 244 No.24, Cys MW=289 M-73 220 174 102 204 74 132 148 114 204 174 M 248 188 293 m/z −80− H+ MW=293 アミノ酸（エトキシカルボニル / エチルエステル誘導体）の GC/MS による解析 No.25, Gln 84 M-73 173 128 156 183 H+ 96 180 96 180 H+ M-73 M 196 269 MW=269 Intensity No.27, 1MH 95 150 96 M-73 M 180 196 269 MW=269 142 No.28, Orn 142 -89 (231) 70 258 212 157 175 MW=246 95 M 246 No.26, 3MH 229 207 M 304 MW=304 No.29, Lys 156 84 171 199 226 272 M 318 m/z −81− MW=318 山口保彦・力石嘉人・横山祐典・大河内直彦 81 -72 No.30, His 238 M-73 H+ 254 81 154 238 M-45 M 282 327 H+ MW=327 Intensity 154 107 -72 No.31, Tyr 107 179 192 -72 264 192 264 135 179 M-73 280 220 M 307 353 H+ MW=353 130 No.32, Trp 130 M 304 103 215 M-73 215 231 258 H+ m/z −82− MW=304 アミノ酸（エトキシカルボニル / エチルエステル誘導体）の GC/MS による解析ノ酸のエトキシカルボニル / エチルエステル誘導 as tert-butyldimethylsilyl derivatives : Preparation of 体化体の同定は，標準物質の保持時間の情報をあ derivatives in a single reaction. J. Chromatogr. A 387, わせて比較する必要がある。 241-253. 謝 Meierhenrich U. J. , G. M. Muñoz Caro, J. H. Bredehöft, 辞 E. K. Jessberger, W. H. -P. Thiemann (2004) 本稿で用いたイカナゴは，奄美栽培漁業セン Identification of diamino acids in the Murchison ターから提供され，シロウリガイは，小栗一将博 meteorite, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 101, 25, 9182-9186. 士（海洋研究開発機構）から提供されたものである。また，小川奈々子博士，高野淑識博士，柏山 Metges C. C., Petzke K. -J., Hennig U. (1996) Gas 祐一郎博士（海洋研究開発機構）には，アミノ酸 ghromatography/combustion/isotope ratio mass の分析に関して議論していただいた。深く感謝い spectrometric comparison of N-acetyl- and N-pivaloyl たします。本稿の内容は，科学研究費補助金（力 amino acids esters to measure 15N isotopic 石・横山）および環境省地球環境研究総合推進費 abundances in physiological samples: A pilot study （横山）により実施した研究成果の一部を取り纏め on amino acids synthesis in the upper gastro-intestinal tract of minipigs. J. Mass. Spectrom. 31, 367-376. たものである。 Montigon F., Boza J. J., Fay B. (2001) Determination 引用文献 of 13C- and 15N-enrichment of glutamine by gas chromatography/mass spectrometry and gas Engel M. H., Macko S. A., Silfer J. A. (1990) Carbon isotope composition of individual amino acids in the chromatography/combustion/isotope ratio mass Murchison meteorite. Nature 348, 47-49. spectrometry after N (O,S)-ethoxycarbonyl ethyl ester derivatisation. Rapid Commun. Mass. Spectrom. Godin J. P., Faure M., Breuille D., Hopfgartner G., Fay L. 15, 116-123. B. (2007) Determination of 13C isotopic enrichment of valine and threonine by GC–C–IRMS after Pan B. S., Wolyniak C. J., Brenna J. T. (2007) The formation of the N(O,S)-ethoxycarbonyl ethyl ester intramolecular δ15N of lysine responds to respiratory derivatives of the amino acids, Anal. Bioanal. Chem. status in Paracoccus denitrificans, Amino Acids 33, 388, 909-918. 631-638. Huang Z. H., Wang J., Gage D. A., Watson J. T., Sweeley Pelz O., Cifuentes L. A., Hammer B. T., Kelley C. A., C. C. (1993) Characterization of N-ethoxycarbonyl Coffin R.B. 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