actinomycetemcomitans to Samples of a Titanium Alloy Used for

101
明海歯学（J Meikai Dent Med ）37（2）
, 101−113, 2008
インプラント用チタン合金試料への Aggregatibacter
（Actinobacillus）actinomycetemcomitans の付着と
その除染方法に関する研究
谷田部一大1§
児島
暁2
辰巳
大橋
1
順一2
敏雄2
成田
申
宗隆1
基 2
!
明海大学大学院歯学研究科歯学専攻
2
明海大学歯学部口腔生物再生医工学講座歯周病学分野
要旨：骨結合型インプラントは良好な予後を示すことが報告されている一方で，インプラント周囲炎についても報告さ
れている．このインプラント周囲炎の治療法を開発する目的で，汚染されたインプラント体表面の除染方法がいくつか報
告されているが，その方法はいまだ確立されていない．本研究はインプラント体表面の効果的な除染方法の確立を目的と
し，その基礎的検討として，インプラント用チタン合金試料に歯周病原細菌 Aggregatibacter actinomycetemcomitans （A.
a）を付着させ，さらに各種除染方法による機械的，化学的除染効果を比較検討した．インプラント用チタン合金試料を
1％ bovine serum albumin によりコーティングした後に A. a を付着させると，A. a の付着量が最も多かった．除染方法と
して，パウダーフローによる機械的除染の後に，クロルヘキシジンによる化学的除染を行うと効果的に除染された．また
各評価方法によって除染効果に多少の違いが出ることから，除染効果の比較は，複数の評価方法を併用して行う必要があ
ると考えられた．
索引用語：インプラント周囲炎，Aggregatibacter actinomycetemcomitans，付着，インプラント用チタン合金試料，除染方法
Adherence of Aggregatibacter（Actinobacillus）actinomycetemcomitans
to Samples of a Titanium Alloy Used for Implants and the Evaluation
of the Decontamination Methods
Kazuhiro YATABE1§, Junichi TATSUMI2, Munetaka NARITA1,
Satoru KOJIMA2, Toshio OHASHI2 and Kitetsu SHIN2
2
1
Meikai University Graduate School of Dentistry
Division of Periodontology, Department of Oral Biology & Tissue Engineering, Meikai University School of Dentistry
Abstract : It has been reported that osseointegrated dental implants show high predictability of success. On the contrary,
peri-implantitis has been reported in some cases. To find a treatment approach for peri-implantitis, several studies have already investigated various methods for decontaminating the implant surface. However, such methodology has yet to be established. Therefore, the aim of the present study was to develop an effective method for implant surface decontamination.
As a basic study, the adherence of Aggregatibacter actinomycetemcomitans（A. a ）to samples of a titanium alloy used for
implants was first investigated. After that, mechanical and chemical decontamination methods and their effects were evaluated. When the samples were coated with 1％ bovine serum albumin , the amount of adherent A. a was maximized. The
combination of a mechanical cleansing by powderflow and a chemical cleansing by chlorhexidine was the most effective
decontamination method. As some difference in results was obtained by using various evaluation methods, a combination of
them may be necessary for assessing the decontamination effects.
102
谷田部一大・辰巳順一・成田宗隆ほか
明海歯学 37, 2008
Key words : peri-implantitis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, adherence, samples of a titanium alloy used for implants, decontamination methods
緒
言
骨結合型インプラントは 1960 年代後半から歯科臨床
に応用されるようになった．インプラント治療は，その
ント体の撤去を行うことが推奨されている．中でも機械
的清掃や研磨によるインプラント表面の除染は，インプ
ラント体の撤去以外のすべての段階で必要とされる重要
な治療手段と考えられる．
予後についてさまざまな報告があるが，5∼21 年の調査
汚染されたインプラント体表面の除染に対し，プラス
で生存率はいずれも約 90％以上を示しており1−7），予知
チックスケーラー21, 22），超音波スケーラー23），ラバーカ
性の高い欠損補綴の手段として確立されつつある．そし
ップ22），パウダーフロー24）などによる機械的除染方法，
て本治療法は無歯顎患者から，部分欠損患者や歯周病に
クロルヘキシジン25），クエン酸17），リン酸26）などによる
罹患していた患者へとその適応が拡大してきてい
化学的除染方法，あるいはレーザー照射27−32）などの方法
8, 9）
る
．一方で，インプラント治療を行ったことによ
が検討されてきている．また，汚染されたインプラント
り，上部構造の破損やインプラント周囲炎などの問題が
体表面の除染は，機械的除染方法だけでは不十分で，化
生じてきている10）．インプラント周囲炎とは，機能して
学的除染方法を併用すると効果的であるという報告もあ
いるインプラントの周囲組織における支持骨の喪失を伴
る27）．しかし，それらの方法の中でどの除染方法が最も
11, 12）
う炎症性反応
と定義されている．インプラント周囲
効果的であるかという検討については，除染対象のイン
炎は，インプラント周囲に付着した歯周病原細菌により
プラント体の汚染状態が均一でないなど，除染条件が統
引き起こされるといわれており，インプラント周囲炎を
一されていないことから，いまだ結論が出ていない．ま
発症しているインプラント体の周囲からは，Aggregati-
た，除染方法や除染効果を比較検討する研究が現在も継
bacter actinomycetemcomitans , Porphyromonas gingivalis ,
続して行われており33−35），その治療法の確立が急務であ
Prevotella intermedia , Tannerella forsythensis, Treponema
ると考える．
denticola などの歯周病原細菌が多く検出されてい
そこで本研究は，インプラント体表面の効果的な除染
る13−18）．Berglundh らがインプラント治療後 5 年間に生
方法の確立を目的とし，その基礎的検討として，インプ
じた偶発症を調査した結果によると，インプラント周囲
ラント用チタン合金試料への歯周病原細菌の付着条件を
炎の発症頻度は 14.4％以下であったとされている10）．し
検討し，さらに各種除染処理を行い，除染効果の評価方
かし，このインプラント周囲炎は，インプラント治療の
法および除染方法の有効性について比較検討を行った．
適応症の拡大により，今後さらに増加すると考えられ
材料と方法
る19）．
インプラント周囲炎の治療は今までにさまざまな方法
1 ．インプラント用チタン合金試料
が試みられている．Mombelli らは，歯周炎の治療法に
本実験に供したインプラント用チタン合金試料（以
準じた累積的防御治療（cumulative interceptive supportive
下，試料）は，Zimmer Dental（Carlsbad, CA, USA）か
therapy, CIST）を提唱した20）．この治療法では，インプ
ら供与された．試料は，Ti-6 Al-4 V チタン合金板を 10
ラント周囲炎の進行程度によって治療法を追加して行う
×20×1 mm の大きさに切断した後，片面に microtex-
とされており，初めにインプラント表面の機械的清掃と
tured（MTX）処理36, 37）を施した．すなわち，試料表面を
研磨を行い，順次，洗口剤の使用，抗菌薬の投与，切除
被溶解性ブラスト材としてハイドロキシアパタイト粒子
療法や再生療法といったインプラント体保存のための外
を用いて表面をマイクロピッチ状にした後，硝酸による
科的処置を追加して行い，予後不良の場合にはインプラ
残留物溶解処理を施した．この MTX 処理は Zimmer
─────────────────────────────
§別刷請求先：谷田部一大，〒350-0283 埼玉県坂戸市けやき台 1-1
明海大学歯学部口腔生物再生医工学講座歯周病学分野（現所属）
本研究の一部は，明海大学歯学部 2007 年度宮田研究奨励金（E）
の補助を受けて行った．
Dental によって行われた．なお実験には滅菌された試料
を用いた．
チタンへの歯周病原細菌の付着と除染方法
2 ．供試菌株および培養条件
103
に使用した．
歯周病原細菌として Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 43718 株（以下，A. a）を使用した．培
3 ．試料表面のコーティング
養には 37 mg/ml の brain heart infusion
（BHI, Becton Dick-
試料への A. a の付着条件を検討するために，試料表
inson, Franklin Lakes, NJ, USA）に 5 mg/ml の yeast extract
面を以下に示す方法により唾液あるいは bovine serum
（Becton Dickinson）を添加した液体培地を用いた．培養
albumin（BSA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）によ
は 10％ CO2 の好気条件下，37℃ で行った．−80℃ で冷
りコーティングを行った．
凍保存していた A. a を BHI 液体培地中で培養し，分光
1 ）唾液によるコーティング（唾液コーティング群）
光度計（ Ultrospec 4050, LKB Biochrom , Cambridge ,
試料表面のコーティングに用いる唾液は，全身疾患が
UK）により，波長 660 nm で培養菌液の吸光度が 0.5 と
なく歯周病の認められない成人男性 1 人より採取した．
なるまで培養した．この培養菌液 2 ml を 48 ml BHI 液
パラフィンワックスを 30 分間咬ませ，20 ml の刺激時
体培地に播種し，培養菌液の吸光度を経時的に分光光度
唾液を採取した38）．採取した唾液は卓上遠心機（クボタ
計を用いて測定し，片対数グラフにより培養液の増殖曲
線を作成した（Fig 1）．この増殖曲線より，吸光度が
卓上遠心機 2100，クボタ，東京）を用い，2,100×g , 15 分
間遠心分離，上清を 0.45 µ m のフィルター（MILLEX!-
0.5 となるまで培養したものを標準菌液 A とし，0.03 と
HV, Millipore, Billerica, MA, USA）を用い，ろ過滅菌し
なるまで培養したものを標準菌液 B として以下の実験
た後，実験に使用した．試料表面のコーティングは，6
well マイクロプレート（Iwaki Microplate，旭テクノグ
ラス，船橋，千葉）の各 well に，MTX 処理表面が上に
なるように試料を静置し，唾液 3 ml に 12 時間浸漬し
1.0
行った．
2 ）BSA によるコーティング（BSA コーティング群）
0.5
試料表面のコーティングに用いる BSA 水溶液は，各
濃度（0.01, 0.1, 1, 4, 10％）の BSA 水溶液を作製後，0.45
µ m のフィルターでろ過滅菌した後，実験に使用した．
試料表面のコーティングは，6 well マイクロプレートの
各 well に，MTX 処理表面が上になるように試料を静置
し，各濃度の BSA 水溶液 3 ml に 12 時間浸漬し行った．
OD (660 n m)
0.3
0.1
4 ．試料への A. a 付着処理
1 ）標準菌液 A による試料への A. a 付着処理
0.05
コーティングを行わなかった試料（無処理群），唾液
コーティング群および BSA コーティング群の試料をそ
0.03
れぞれ 10 ml の標準菌液 A に浸漬し，10％ CO2 の好気
条件下で，37℃，4, 8, 16, 24 および 36 時間静置培養
し，試料に A. a を付着させた．付着処理終了後，試料
を 10 ml の生理食塩水に 30 秒間浸漬し，非付着性細菌
0.01
0
1
2
3
4
5
Time (hrs)
6
7
8
Fig 1 Growth curve of Aggregatibacter actinomycetemcomitans（A. a ）. Pre-cultured A. a were inoculated into brain heart
infusion（BHI）broth and cultured at 37℃ in an atmosphere of
10％ CO2 for the indicated times . After the culturing , cell
growth was determined by measuring the OD at 660 nm. Each
value represents the means from 5 independent experiments .
The A. a culture was grown in BHI medium until the OD at
660 nm had reached 0.5（standardized A. a culture A）or 0.03
（standardized A. a culture B）
．
を除去した．
2 ）標準菌液 B による試料への A. a 付着処理
無処理群，唾液コーティング群および BSA コーティ
ング群の試料をそれぞれ 10 ml の標準菌液 B に浸漬
し，10％ CO2 の好気条件下で，37℃，4 時間静置培養
し，試料に A. a を付着させた．付着処理終了後，試料
を 10 ml の生理食塩水に 30 秒間浸漬し，非付着性細菌
を除去した．
104
谷田部一大・辰巳順一・成田宗隆ほか
5 ．A. a を付着させた試料に対する除染方法
A. a を付着させた試料に対する除染方法として，以
下の 14 項目を設定した．
1 ）コントロール群（Control）
明海歯学 37, 2008
浄した．
12）パウダーフロー→生理食塩水群（Powderflow→Saline）
重曹粉末噴霧装置により，重曹粉末（ Q-POWDER
1％ BSA により試料表面コーティングを行った後，
15，ヨシダ）を含む水を専用のノズルを使用して 1 分間
試料に A. a を付着させるが，その後除染処理を行わな
噴霧後，50 ml の生理食塩水で 1 分間シリンジ洗浄し
いもの．
た．
2 ）試料群（Sample）
13）パウダーフロー→機能水群（Powderflow→FW）
試料表面にいかなる処理も行わないもの．
重曹粉末を含む水を 1 分間噴霧後，50 ml の電解酸性
3 ）生理食塩水群（Saline）
機能水で 1 分間シリンジ洗浄した．
19 G の注射針（テルモ注射針，テルモ，東京）を付
けた 50 ml のシリンジ（テルモシリンジ!，テルモ）を
14）パウダーフロー→CHX 群（Powderflow→CHX）
用いて，50 ml の生理食塩水で 1 分間洗浄した．
ルコン酸クロルヘキシジン溶液で 1 分間シリンジ洗浄し
4 ）機能水群（FW）
た．
重曹粉末を含む水を 1 分間噴霧後，50 ml の 0.1％グ
50 ml の電解酸性機能水（ハイクロソフト水，Well
CLEAN-TE, OSG コーポレーション，大阪）で 1 分間シ
リンジ洗浄した．
5 ）クロルヘキシジン群（CHX）
6 ．試料への A. a 付着量の測定
試料表面の A. a 付着量の測定はクリスタルバイオレ
ット（CV）染色法により行った．初めに試料表面の A.
生理食塩水で 0.1％に希釈したグルコン酸クロルヘキ
a を 100 µ l の CV 液（グラム・ハッカー染色液蠢，武
シジン溶液（5％ヒビテン液，大日本住友製薬，大阪）
藤化学，東京）で 5 分間染色した．次に，ビーカー内に
50 ml で 1 分間シリンジ洗浄した．
水道水 2 l を入れ，スターラー（40-206 A，池本理化工
6 ）リン酸→生理食塩水群（PA→Saline）
35％リン酸ゲル（Ultra-Etch!, Ultradent Products, South
業，東京）で還流させた条件下で，1 分間水洗した．そ
Jordan, UT, USA）0.24 ml を試料表面に 1 分間処理後，
サー（Micro Mixer model MX-4，三光純薬，東京）で震
50 ml の生理食塩水で 1 分間シリンジ洗浄した．
盪を加え 30 分間脱色した．脱色に用いたエタノール 200
7 ）リン酸→機能水群（PA→FW）
µ l を 96 well プレートにとり，分光光度計（ Titertek
Multiskan Plus, Flow Laboratories, McLean, VA, USA）を
用いて，595 nm における吸光度を測定し，試料表面の
A. a 量を間接的に測定した．
リン酸ゲル 0.24 ml を試料表面に 1 分間処理後，50 ml
の電解酸性機能水で 1 分間シリンジ洗浄した．
8 ）リン酸→クロルヘキシジン群（PA→CHX）
の後，3 ml の 95％エタノールに浸漬し，プレートミキ
リン酸ゲル 0.24 ml を試料表面に 1 分間処理後，50 ml
の 0.1％グルコン酸クロルヘキシジン溶液で 1 分間シリ
ンジ洗浄した．
9 ）ウォータージェット→生理食塩水群（Waterjet→Saline）
7 ．試料表面の A. a 生菌付着数の計測
試料表面の A. a 生菌付着数の計測は培養法により行
った．すなわち，A. a を付着させた試料を，10 ml の PBS
（−）［ダルベッコ PBS（−）粉末，日水製薬，東京］
重曹粉末噴霧装置（QUICK JET，ヨシダ，東京）に
が入った 50 ml のコニカルチューブ（ Becton Dickin-
より，重曹粉末を含まない水を専用のノズルを使用して
son）に入れ，ボルテックスミキサー（タッチミキサー
1 分間噴霧後，50 ml の生理食塩水で 1 分間シリンジ洗
MT-31，ヤマト科学，東京）で 1 分間震盪し，試料から
浄した．
A. a を餝離させた．その希釈液 100 µ l を，BHI 寒天培
10）ウォータージェット→機能水群（Waterjet→FW）
重曹粉末を含まない水を 1 分間噴霧後，50 ml の電解
地に播種し，10％ CO2 の好気条件下で，37℃，48 時間
培養し，colony forming unit（CFU）を計測した．
酸性機能水で 1 分間シリンジ洗浄した．
11）ウォータージェット→CHX 群（Waterjet→CHX）
8 ．SEM による試料表面の A. a 付着状態の観察
重曹粉末を含まない水を 1 分間噴霧後，50 ml の 0.1
実験後の試料を 24 時間自然乾燥させ，SEM（JEOL
％グルコン酸クロルヘキシジン溶液で 1 分間シリンジ洗
JSM-6360 LV，日本電子，昭島，東京）により，加速電圧
105
チタンへの歯周病原細菌の付着と除染方法
1.6
15 kV, 3,500 倍の条件において，試料表面を観察した．
*
*
4
10
*
の分布の観察
除染処理後の試料を 24 時間自然乾燥させ，Electron
1.2
OD (595 n m)
9 ．元素濃度マッピング分析による試料表面の炭素元素
probe microanalyzer（EPMA）（JCMA-733，日本電子）
*
0.8
0.4
を用いて試料表面の炭素元素濃度マッピング分析をし
0
た．すなわち，試料を EPMA で加速電圧 10 kV, probe cur-
Untreated
Saliva
0.01
0.1
1
BSA (%)
rent 80 nA, dwell time 80 ms の条件下で，1 点の beam
area を 20 µ m とし，各試料を 200×250 ピクセル（4×5
mm）ずつスキャンした．元素濃度マップは，EPMA で
得られた結果を炭素元素の重量濃度別に Scion image
（Scion Corporation, Frederick, MD, USA）で画像処理す
ることで作製した．
10．試料表面の炭素元素の定量分析
Fig 2 Effect of surface treatment of the samples with saliva or
BSA on adherence of cultured A. a . Samples were either untreated, coated with saliva or with the indicated concentrations
of BSA for 12 hrs and then soaked in the standardized A. a culture A for 24 hrs. After removal of the non-adherent A. a , the
amount of A. a adhered to the samples was determined by CV
staining as described in Materials and Methods. Each value represents the mean±SD from 5 independent experiments. *Statistically significant difference from Untreated, P ＜0.05, MannWhitney U -test.
除染処理後の試料を 24 時間自然乾燥させ，EPMA
（JCMA-733，日本電子）で，加速電圧 10 kV, probe current
1.6
10 nA, 1 点の beam area を 50 µ m の条件下で，試料表面
1.2
11．統計学的有意差検定
統計学的有意差の検定は Mann-Whitney U -test により
OD (595 n m)
の任意の測定点で炭素元素の重量濃度を測定した．
0.8
*
0.4
行った．
結
果
1 ．試料への A. a 付着方法の検討結果
これまでに，純チタンあるいはチタン合金試料への細
菌の付着条件について検討した報告がいくつか存在す
る29, 39−43）．これらを検索すると，試料をコーティングせ
ずに細菌をそのまま付着させた報告と，試料を唾液40−42）
や 0.01 および 4％の BSA29, 42, 43）でコーティングした後に
0
Untreated
0.01
0.1
1
4
10
BSA (%)
Fig 3 Effect of BSA treatment of the samples by CV staining.
Samples were either untreated, coated with the indicated concentrations of BSA for 12 hrs. After the treatment, the amount of
residual BSA on the samples was determined by CV staining as
described in Materials and Methods. Each value represents the
mean±SD from 5 independent experiments. *Statistically significant difference from Untreated, P ＜0.05, Mann-Whitney U test.
細菌を付着させた報告がある．さらに，細菌の付着時間
についてもさまざまであるため29, 39−43），本研究で使用す
コーティング群および BSA コーティング群の試料に対
る試料への効果的な A. a の付着条件を新たに検討する
して，標準菌液 A により 24 時間 A. a の付着処理を行
必要があった．そこで，A. a を付着させた試料の除染
い，A. a 付着量を比較検討した．実験は各群 5 検体ず
処理を行う前に，基礎実験として，まず試料への A. a
つ行い，結果は測定値の平均値で表した（Fig 2）．その
の付着方法を，試料のコーティング方法と，試料への
結果，無処理群（Untreated）と，唾液コーティング群
A. a 付着処理時間から検討した．
（Saliva）では，試料への A. a 付着量に差はなかった．
1 ）試料のコーティング方法の検討結果
BSA コーティング群では，BSA の濃度が 0.1％から濃
漓コーティングの違いによる試料への A. a 付着量の検
度依存的に A. a の付着量が増加する傾向がみられた．
討結果
なお，無処理群の A. a 付着量と，0.01, 1, 4 および 10％
各コーティング条件の違いによる試料への A. a 付着
BSA コーティング群の A. a 付着量との間に統計学的有
量を，CV 染色法により比較検討した．無処理群，唾液
意差がみられた．また，BSA 自体が試料表面に付着
106
谷田部一大・辰巳順一・成田宗隆ほか
明海歯学 37, 2008
し，CV 染色法の測定値に与える影響を検討するための
る A. a 生菌付着数との間に統計学的有意差がみられた．
対照実験を行った．無処理群および BSA コーティング
以上，試料のコーティング方法の検討結果（Figs 2−
群の試料に対して CV 染色法を行い，測定値を比較し
4）から，A. a 生菌付着数が最も多かった 1％ BSA で試
た．実験は各群 5 検体ずつ行い，結果は測定値の平均値
料表面のコーティングを行い，以下の実験を行うことと
で表した（Fig 3）．その結果，BSA 単独でも若干の吸光
した．
度の増加傾向がみられ，無処理群（Untreated）の測定値
2 ）試料への A. a 付着処理時間の検討結果
と，10％ BSA コーティング群の測定値との間に統計学
漓SEM による試料への A. a 付着状態の観察結果
的有意差がみられた．
試料表面への A. a 付着状態の経時的変化を観察する
滷コーティングの違いによる試料への A. a 生菌付着数
ために，SEM による検討を行った（Fig 5）．A. a を付
の検討結果
着させていない状態では MTX 表面のマイクロピッチ状
各コーティング条件の違いによる試料への A. a 生菌
態が明瞭に認められるが（Fig 5A），A. a の付着増殖に
付着数を，培養法により比較検討した．無処理群，唾液
より経時的に試料表面の凹凸が平滑面に移行する像が観
コーティング群および BSA コーティング群の試料に対
察された（Fig 5B−F）．
して，標準菌液 B により 4 時間 A. a の付着処理を行
い，A. a 生菌付着数を比較検討した．標準菌液 B によ
る試料への A. a 付着処理時間は，増殖曲線（Fig 1）か
A
B
ら，最も増殖率の高い段階で A. a 付着処理を行うため
に 4 時間に設定した．実験は各群 5 検体ずつ行い，結果
は CFU の平均値で表した（Fig 4）．その結果，無処理
群（Untreated）と比較して，唾液コーティング群（Saliva）では，試料への A. a 生菌付着数が少なかった．ま
た 0.01％ BSA コーティング群は，無処理群よりも A. a
菌付着数が増加し，1％をピークに生菌付着数は減少し
4
Sample
の生菌付着数は少なかったが，濃度依存的に A. a の生
C
D
た．なお，無処理群の A. a 生菌付着数と，唾液コーテ
ィング群，0.01 および 10％ BSA コーティング群におけ
2,500
CFU (colonies / plate)
2,000
8
1,500
E
F
*
1,000
*
*
500
0
16
Untreated
Saliva
0.01
0.1
1
BSA (%)
4
10
Fig 4 Comparison of viable cell numbers of A. a on the samples coated with saliva or BSA. Samples were either untreated
or coated with saliva or with the indicated concentrations of
BSA for 12 hrs and then soaked in the standardized A. a culture
B for 4 hrs. After removal of the non-adherent A. a , the viable
A. a were cultured on BHI agar plates for 48 hrs, and then the
number of CFU was determined by counting colonies . Each
value represents the mean ± SD from 5 independent experiments . * Statistically significant difference from Untreated , P
＜0.05, Mann-Whitney U -test.
24
36
hrs
Fig 5 Gradual change with time on the surface of the samples
cultured with A. a . Samples coated with 1％ BSA for 12 hrs
were soaked in the standardized A. a culture A for the indicated
times and then dried naturally for 24 hrs. The surface of the
samples was observed with a SEM as described in Materials and
Methods（original magnification×3,500）
. Samples were left untreated（A ）or soaked in the standardized A. a culture A for 4
（B ）
, 8（C ）
, 16（D ）
, 24（E ）or 36 hrs（F ）
．
チタンへの歯周病原細菌の付着と除染方法
A
2.5
OD (595 n m)
2.0
*
*
107
B
*
1.5
*
*
1.0
Sample
C
0.5
0
Untreated
4
8
16
24
Control
D
E
36
Time (hrs)
Fig 6 Time-dependent increase in the adherence of A. a on the
samples. Samples coated with 1％ BSA for 12 hrs were soaked
in the standardized A. a culture A for the indicated times. After
removal of the non-adherent A. a , the amount of A. a adhered
to the samples was determined by CV staining. Each value represents the mean±SD from 5 independent experiments. *Statistically significant difference from Untreated, P ＜0.05, MannWhitney U -test.
Saline
F
FW
G
PA→Saline
滷CV 染色法による試料への A. a 付着量の検討結果
I
CHX
H
PA→FW
J
PA→CHX
K
試料表面への A. a 付着量の経時的変化を比較するた
めに，CV 染色法により試料への A. a 付着量を測定し
た．実験は各群 5 検体ずつ行い，結果は測定値の平均値
で表した（Fig 6）．その結果，経時的に A. a の付着量
が増加する傾向がみられ，24 時間でピークに達した．
Waterjet→Saline
L
Waterjet→FW
M
Waterjet→CHX
N
無処理群（Untreated）の A. a 付着量と，4, 8, 16, 24 お
よび 36 時間における A. a 付着量との間に統計学的有意
差がみられた．中でも A. a 付着量が最も多かったのが
24 時間であったため，標準菌液 A による A. a の付着
処理時間は，24 時間とした．
2 ．A. a を付着させた試料に対する除染方法の検討結
果
上記実験から得られた A. a 付着方法により，A. a を
付着させた試料に対する各種除染効果の有効性について
検討を行った．
1 ）除染処理後の試料表面の SEM による観察
標準菌液 A により 24 時間 A. a を付着させた試料に
対する各種除染効果について，SEM により検討を行っ
た．Sample は試料表面にいかなる処理も行わないもの
（Fig 7A），Control は，試料に 1％ BSA による表面のコ
ーティングを行った後に A. a を付着させ観察したもの
である（Fig 7B）．この Control と同一条件の試料に対
Powderflow→Saline
Powderflow→FW
Powderflow→CHX
Fig 7 SEM observations of the surface of the samples after decontamination. Samples after decontamination were dried naturally for 24 hrs, and their surfaces were then observed by SEM
as described in Materials and Methods（original magnification×
3,500）. Sample without any treatment, showing a microtextured
（MTX）surface（A ）, Control sample coated with 1％ BSA and
soaked in the standardized A . a culture A for 24 hrs（ B ）.
Twelve kinds of decontamination method were performed（CN ）: Saline（C ）
, FW（D ）
, CHX（E ）
, PA→Saline（F ）, PA→
FW（G ）, PA→CHX（H ）, Waterjet→Saline（I ）, Waterjet→
FW（J ）
, Waterjet→CHX（K ）, Powderflow→Saline（L ）, Powderflow→FW（M ）, Powderflow→CHX（N ）. Residual A. a
and culture were observed on Saline（C ）and Waterjet→Saline
（I ）
. Samples were almost decontaminated by each decontamination method（C-N ）. Comparison of samples showed alteration
of the MTX surface by Powderflow→Saline（L）
, Powderflow→
FW（M ）, and Powderflow→CHX（N ）. FW, functional water ;
CHX, chlorhexidine ; PA, phosphoric acid.
して，各除染処理を行った（Fig 7C−N）．各除染処理し
た試料では，Control と比較して，試料表面に明らかな
流されたものと考えられた．Saline（Fig 7C）および Wa-
違いが認められ，Sample により近い像が観察された．
terjet→Saline（Fig 7I）では，試料表面に A. a および培
これは試料表面に蓄積した A. a および培地成分が洗い
地成分が残留し，完全には洗い流されていない像がみら
谷田部一大・辰巳順一・成田宗隆ほか
A
明海歯学 37, 2008
B
60.0
5wt％
4wt％
3wt％
2wt％
1wt％
24wt％
18wt％
12wt％
6wt％
0.1wt％
50.0
3.0
2.5
wt %
108
2.0
1.5
Saline
F
FW
G
PA→Saline
I
CHX
H
PA→FW
J
PA→CHX
Powderflow→FW
Powderflow→CHX
Powderflow→Saline
Waterjet→FW
Waterjet→CHX
PA→CHX
Waterjet→Saline
PA→FW
CHX
PA→Saline
0
FW
0.5
E
Saline
D
Sample
C
1.0
Control
Control
Sample
Fig 9 EPMA detection of amount of carbon on the surface of
the samples after decontamination. Samples after decontamination were dried naturally for 24 hrs. The amount of residual carbon on the surface of the samples was determined by EPMA to
evaluate the decontamination effects. EPMA gives the levels of
carbon in wt％. Twelve kinds of decontamination method, as
described in the legend of Fig 7, were performed. Each value
represents the mean±SD from 5 independent experiments.
K
対する各種除染効果について，各試料表面の有機物の残
留程度を比較する目的で，元素濃度マッピング分析によ
り検討を行った．これは試料表面の炭素元素の重量濃度
Waterjet→Saline
L
Waterjet→FW
M
Waterjet→CHX
を測定し，試料表面に残留した炭素元素濃度の分布を色
分けして表すもので，有機物の分布状態により各種除染
N
効果を検討した（Fig 8）．Sample（Fig 8A）には炭素元
素はほとんど分布しておらず，A. a を付着させた Control
（Fig 8B）には炭素元素が多く分布していた．この Control
と同一条件の試料に対して各除染処理を行った（Fig 8C
Powderflow→Saline
Powderflow→FW
Powderflow→CHX
Fig 8 Decontamination effect evaluated by mapping of elemental carbon. Samples after decontamination were dried naturally for 24 hrs, and mapping of elemental carbon on the surface
of the samples was done by using an EPMA as described in
Materials and Methods. Sample without any treatment（the scale
in the next indicates the level of elemental carbon）
（A）
. Sample
was coated with 1％ BSA and then soaked in the standardized
A. a culture A for 24 hrs , after which it was left untreated
（Control）
（the scale in the next indicates the level of elemental
carbon）（B ）. Samples were coated with 1％ BSA and then
soaked in the standardized A. a culture A for 24 hrs, after which
they were treated by the various decontamination methods described in the legend of Fig 7（C-N ）
．
−N）．その結果，Control と比較して，すべての群にお
いて炭素元素の分布が減少していた（Fig 8C−N）．Waterjet→FW（Fig 8J）および Powderflow→FW（Fig 8M）
では炭素元素の分布はほとんど認められなかった．Saline
（Fig 8C），CHX（Fig 8E）および PA→FW（Fig 8G）
では，Sample（Fig 8A）と比較するとやや炭素元素が多
く分布しており，Waterjet→CHX（Fig 8K）および Powderflow→CHX（Fig 8N）ではより多くの炭素元素が検
出された．
3 ）除染処理後の試料表面の定量分析
標準菌液 A により 24 時間 A. a を付着させた試料に
対する各種除染効果について，試料表面に残留した有機
れた．Powderflow→Saline（Fig 7L），Powderflow→FW
物に含まれる炭素元素の重量濃度の定量分析を行い比較
（Fig 7M），Powderflow→CHX（Fig 7N）では，試料の
検討した．実験は各群 5 検体ずつ行い，結果は重量濃度
MTX 表面が削られ，平滑になった像がみられた．
2 ）除染処理後の試料表面の元素濃度マッピング分析
標準菌液 A により 24 時間 A. a を付着させた試料に
の平均値で表した（Fig 9）．Sample には炭素元素が少
なく，A. a を付着させた Control では炭素元素が最も多
く検出された．各除染処理を行った結果，Control と比
チタンへの歯周病原細菌の付着と除染方法
2.0
109
3,000
CFU (colonies / plate)
2,000
OD (595nm)
1.5
1.0
0.5
300
250
200
150
100
Fig 10 Effects of various decontamination methods on adherence of cultured A. a . The amount of residual A. a on the samples after various decontamination methods was determined by
CV staining to evaluate the decontamination effect . Twelve
kinds of decontamination method, as described in the legend of
Fig 7, were performed. Each value represents the mean±SD
from 5 independent experiments.
較して，すべての群において炭素元素が減少した．FW,
Powderflow→FW
Powderflow→CHX
Powderflow→Saline
Waterjet→FW
Waterjet→CHX
PA→CHX
Waterjet→Saline
PA→FW
CHX
PA→Saline
FW
Saline
Sample
0
Control
Powderflow→FW
Powderflow→CHX
Powderflow→Saline
Waterjet→FW
Waterjet→CHX
PA→CHX
Waterjet→Saline
PA→FW
CHX
PA→Saline
FW
Saline
Sample
Control
50
0
Fig 11 Effects of various decontamination methods on the
number of viable adherent A. a . The amount of residual viable
A. a on the samples after treatment by various decontamination
methods was determined by counting CFU, as described in the
legend of Fig 4, to evaluate the decontamination effect. Twelve
kinds of decontamination methods, as described in the legend of
Fig 7, were performed. Each value represents the mean±SD
from 3 independent experiments.
5 ）除染処理後の試料表面の A. a 生菌付着数
Waterjet→Saline, Powderflow→Saline および Powderflow
標準菌液 B により 4 時間 A. a を付着させた試料に対
→FW における炭素元素の重量濃度は，Sample と同程
する各種除染効果について，試料表面の A. a 生菌付着
度であった．また，FW, CHX, PA→Saline, Waterjet→Sa-
数の計測により検討を行った．実験は各群 3 検体ずつ行
line, Powderflow→Saline, Powderflow→FW および Pow-
い，結果は CFU の平均値で表した（Fig 11）．各除染処
derflow→CHX による除染処理後の試料表面の炭素元素
理を行った結果，Control と比較して，すべての群にお
の重量濃度と，Sample の重量濃度との間に統計学的有
いて A. a 生菌付着数が減少した．Saline, FW, PA→Sa-
意差はみられなかった．したがって，これらの除染方法
line, PA→FW, Waterjet→Saline, Powderflow→Saline では
によって，Sample に近い状態まで試料表面が除染され
生菌の付着がみられた．一方，CHX, PA→CHX, Waterjet
たと考えられる．
→FW, Waterjet→CHX, Powderflow→FW および Powder-
4 ）除染処理後の試料表面の A. a 付着量
flow→CHX では生菌の付着がみられなかった．また，PA
標準菌液 A により 24 時間 A. a を付着させた試料に
→CHX, Waterjet→Saline, Waterjet→FW, Waterjet→CHX,
対する各種除染効果について，CV 染色法により試料表
Powderflow→FW および Powderflow→CHX による除染
面の A. a 付着量を測定し検討を行った．実験は各群 5
処理後の A. a 生菌付着数と，Sample の値との間に統計
検体ずつ行い，結果は測定値の平均値で表した（Fig
学的有意差はみられなかった．したがって，これらの除
10）．Powderflow→Saline, Powderflow→FW, Powderflow
染方法によって，Sample に近い状態まで試料表面が除
→CHX で A. a の付着量が最も少なく，次に，Waterjet
染されたと考えられる．
→Saline, Waterjet→FW, Waterjet→CHX で A. a の付着量
が少なかった．Saline, FW, CHX, PA→Saline, PA→FW,
PA→CHX では，A. a の付着量が多かった．また，Water-
考
察
本研究に用いた試料表面は，市販の MTX 処理表面を
jet→Saline, Waterjet→CHX, Powderflow→Saline および
したインプラント体と同様の構造をしている．MTX 処
Powderflow→CHX による除染処理後の A. a 付着量と，
理表面は，ブラスティング‐酸複合処理（Sand-blasted,
Sample の値との間に，統計学的有意差はみられなかっ
Large-grit, Acid-etched；以下，SLA）表面であり，SLA
た．したがって，これらの除染方法によって，Sample
処理後の表面粗さは 18∼23 µ m といわれている44）．SLA
に近い状態まで試料表面が除染されたと考えられる．
表面は現在行われているインプラント体表面処理の代表
的なものの 1 つであり45），本研究における除染効果は
110
谷田部一大・辰巳順一・成田宗隆ほか
明海歯学 37, 2008
Zimmer Dental 社製以外の多くの SLA 表面をしたイン
Persson らは，イヌにインプラント周囲炎を発症さ
プラント体に適応できると考える．また，実際に臨床に
せ，抗菌薬を投与し，外科的な掻爬を行い，併せてイン
使用されている表面構造をもつチタン合金板を使用する
プラント体表面を生理食塩水で洗浄したところ，SLA
ことで，これまでは困難であった除染効果の比較検討を
表面のインプラント体において 84％の再骨結合が生じ
より詳細に行うことが可能であると考えられた．
たとしている50）．しかし，本研究では生理食塩水による
A. a はインプラント周囲炎の病巣から検出される主
洗浄効果は低く，他の化学的除染効果のある薬剤による
要な細菌であり46），付着能が強いこと，本実験を一部好
洗浄が必要であると考える．田中は，インプラント周囲
気条件で行う必要があるため，好気条件でも生育が可能
の除染に電解酸性機能水を用いたところ，インプラント
な通性嫌気性菌であるという理由から選択した．
周囲細菌数の減少にクロルヘキシジンと同程度の効果が
Steinberg らは，唾液またはヒトアルブミンで表面処
あったことを報告している51）．本研究において，電解酸
理したチタンおよびチタン合金への A. a の付着量は表
性機能水は生理食塩水よりも高い化学的除染効果を認め
面処理しなかった場合と比較して有意に少なかったと報
たが，クロルヘキシジンに比べるとその効果は低かっ
告している41）．本研究においては，唾液により表面コー
た．クロルヘキシジンは，国内では口腔粘膜への使用に
ティングした試料への A. a 付着量と，表面処理を行わ
制限があるが，インプラント体表面の除染方法として国
なかった試料への A. a 付着量にほとんど差はなかった
際的に汎用されており25, 35），クロルヘキシジンによるイ
（Fig 2）．また BSA により表面処理した試料への A. a
ンプラント体表面の除染効果を過去の研究結果と比較す
の付着量は，BSA の濃度によって変化した．アルブミ
るために，本研究の洗浄方法として選択した．Schou ら
ンはチタンやチタン合金に吸着する唾液タンパク質であ
は，インプラント体表面の除染には，生理食塩水を浸し
り47），表面に形成されたアルブミン層は，細菌の付着を
た綿球とクロルヘキシジンを浸した綿球で交互に清拭す
48）
阻害する可能性があることや，アルブミン層の存在は
るのが簡便で効果的であるとしており25），クロルヘキシ
負に荷電した細菌と，正に荷電したチタン表面との間の
ジンは本研究においても強い殺菌効果を認めた．なお，
静電気的な反応を抑制することで，付着を阻害する物質
クロルヘキシジンによる除染では，元素濃度マッピング
として作用し，チタン表面への細菌の付着を減少させる
分析および定量分析において，他の除染方法と比較し
ことが報告されている49）．本研究では，試料への A. a
て，試料表面に炭素元素の残留が多くみられた．これは
付着量はほぼ BSA の濃度依存的に増加したが（ Fig
クロルヘキシジンに含まれる炭素元素が試料表面に残留
2），試料への A. a 生菌付着数は，BSA 濃度 0.01％で減
したものと考えられる．Kozlovsky らは，純チタン表面
少し，0.1％から 1％までは濃度依存的に増加し，1％
へのクロルヘキシジンの残留性と殺菌作用について研究
をピークとして，4％から 10％までは減少傾向を示し
を行い，クロルヘキシジンが純チタン表面に残留するこ
た（Fig 4）．生菌付着数が BSA 濃度の違いによって二
とにより，持続的な殺菌作用を発揮したと報告してい
相性を示した原因については，4％および 10％ BSA に
る38）．一方，試料表面にクロルヘキシジンが残留するこ
よりコーティングした試料表面においては，A. a の付
とにより，その後の再骨結合が阻害される可能性も考え
着が促進されたことにより，A. a の増殖が過剰となっ
られる52）．Strooker らは，in vivo において，インプラン
た結果，死滅した菌数が増加し，結果として生菌付着数
ト周囲を 35％リン酸ゲルで化学的に清掃した場合と，
が減少した可能性や，高濃度の BSA によりコーティン
カーボンファイバーキュレットとラバーカップにより機
グした試料表面では生菌の付着が阻害されたなどの可能
械的に清掃した場合を比較し，35％リン酸ゲルを用い
性が考えられるが，詳細については不明である．しかし
た場合に有意に殺菌効果が高かったとしている26）．しか
本実験条件では試料への A. a 生菌の付着における BSA
し，本研究においては，化学的除染効果は低い結果とな
の至適濃度は 1％であったと考えられる．また，A. a
った．この理由としては，ゲル状のリン酸は，表面形状
の増殖曲線から，標準菌液 B による試料への A. a 付着
が複雑な試料表面に十分に浸透しなかったことが考えら
処理時間を 4 時間に設定した．しかし試料への A. a 付
れた．この裏づけとして，本研究で使用した 35％リン
着処理時間が 4 時間では，試料に A. a が十分に付着し
酸ゲル 0.24 ml を 10 ml の生理食塩水に溶解した溶液
ていなかった可能性があり，試料への A. a の付着が十
に，A. a を付着させた試料を 1 分間浸漬したところ，
分であれば，各除染効果により明瞭な差がみられた可能
生菌の残留は一切みられなかった（データは示していな
性が考えられた．
い）．パウダーフローは試料表面の異物除去効果が高い
チタンへの歯周病原細菌の付着と除染方法
一方で，試料の表面性状を変化させたことが過去に報告
24, 29, 33）
111
えられた．また各評価方法によって除染効果に多少の違
，本研究においても試料の表面性状の
いが出ることから，本研究で用いたように，複数の評価
変化がみられた．また，重曹粉末の残留の可能性も指摘
方法を併用して除染効果を比較する必要があると考えら
されており
33）
されている．重曹粉末の残留によってどのような影響
れた．さらにその他の評価方法として，リアルタイム
があるかは今後の検討が必要である．また重曹粉末を含
PCR 法を用いた細菌数の測定や，生菌量と死菌量を測
まないウォータージェットでは，試料の表面性状の変化
定できる市販のキットなどの利用も今後検討する必要が
はみられなかったが，試料表面の異物除去効果は低いと
あると考える．
考えられる．Schwarz らは，汚染されたインプラント体
表面の除染は，機械的除染方法だけでは不十分で，化学
結
論
的除染方法を併用すると効果的であるとしている27）．本
本研究においては，パウダーフローによる機械的除染
研究においても，ウォータージェットやパウダーフロー
方法とクロルヘキシジンによる化学的除染方法の併用に
による機械的除染方法に，電解酸性機能水やクロルヘキ
より，インプラント体表面の効果的な除染が行えると考
シジンによる化学的除染方法を併用すると高い除染効果
えられた．また除染効果の比較は，複数の評価方法を併
が得られることがわかった．とくに，パウダーフローに
用して行う必要があると考えられた．
よる機械的除染方法に，クロルヘキシジンによる化学的
除染方法を併用した方法は，本研究において検討した方
法の中では最も有効な除染方法であると考えられる．
本研究は in vitro で A. a 単独菌種のみを付着させた
ため，実際に口腔内に形成されるバイオフィルムや石灰
化物の除去効果については今後検討が必要であると考え
る．すなわち，フローセルを用いた還流培養法や，複数
の菌種を共培養する方法により，口腔内に形成されるバ
イオフィルムにより近い状態を再現できる方法53）につい
ても今後検討が必要であると考えられた．
稿を終えるにあたり，御指導，御校閲を賜りました明海
大学歯学部機能保存回復学講座歯科生体材料学分野中嶌
裕教授，明海大学歯学部口腔生物再生医工学講座微生物学
分野大森喜弘教授に深甚なる謝意を表します．最後に，
御援助頂きました歯周病学分野教室員の先生方に厚く御礼
申し上げます．さらに，本研究を遂行するにあたり，試料
を提供していただいた Zimmer Dental 社ならびに株式会社
インプラテックスに感謝します．
なお，本論文の要旨は日本歯周病学会 50 周年記念大会
（東京）において発表した．
引用文献
評価方法については，SEM による観察だけでは除染
効果の客観的評価は困難であると考えられた．炭素元素
濃度マッピング分析および炭素元素の重量濃度の測定で
は，試料表面に残留した細菌と培地だけではなく，除染
に使用したクロルヘキシジン中の炭素元素も検出した可
能性があると考えられ，炭素元素の分布と除染効果は必
ずしも一致しない可能性があると考えられた．CV 染色
法は，グラム陰性菌が CV に染色された後に，エタノ
ールにより脱色される性質を利用した細菌量の評価方法
である54）．本研究では，A. a 単独菌種を用いたこと，A.
a がグラム陰性菌であることなどの理由から，試料表面
に付着残留した A. a の生菌，死菌合わせた菌量の定量
的な評価に本方法を用いた．また，CV は A. a だけで
はなく，BSA に対しても一部染色性を示したことか
ら，試料表面の付着物全体の除染効果の判定を行うこと
が可能であった．すなわち CV 染色法によって，機械
的除染効果も判定することができたと考えられた．培養
法は，試料表面の A. a 生菌付着数を評価するために用
いた28）．すなわち各除染方法の殺菌効果を評価すること
により，各除染方法の化学的除染効果を判定できたと考
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（受付日：2008 年 4 月 22 日
受理日：2008 年 5 月 23 日）

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