VOL.40 721 緑膿 菌 の コロニー性 状 と増殖抑 制物 質 NO.6 各種 の 臨床 分 離 菌 の コロニ ー レベ ル に お け る生物 学 的 性状 (III)緑 膿 菌 の単 一菌 株 に共存 す る感性 細胞 によ る多剤耐性 細胞 の増 殖抑制 小林 西 寅 吉吉1,2)・ 長 谷 川 美 幸1)・ 内 野 卯 津 樹1) 田 実1,2)・五 島 瑳 智 子2) 1)三 菱 油化 ビー シー エ ル 化学 療 法研 究 室 。 2)東 邦 大学 医 学部 微 生物 学 教 室 (平成3年10月31日 Pseudomonas broth中 aeruginosaの に お け る増 殖 は,こ 受 付 ・平成4年3月3日 臨 床 分 離 株(No.1株)の 受 理) 薬 剤 耐 性 細 胞 のMueller-Hinton の 菌 株 中 に共 存 す る感 性 細 胞 に よ っ て抑 制 さ れ る こ とが 各 種 の 検 討 に よ っ て 確 認 され た 。 この 抑 制 作 用 に 関 与 す る物 質 は感 性 細 胞 培 養 時 に 産 生 され,培 放 出 され る 。 この 抑 制 因 子 は易 熱 性(56℃,30分)で,Paeruginosaの の み 特 異 的 に 抑 制 作 用 を示 す が,他 地中に 一 部 の菌株 の増殖 に の ブ ドウ糖 非 発 酵 菌 の 増 殖 に 対 し て は ま っ た く影 響 し な い 。 この 物 質 の 本 体 と そ の 作 用 に つ い て 引 き続 き検 討 中 で あ る 。 Key words:Paeruginosa,drug-resistant 前 報 に お い て,我 cell,drug-susceptible 一lactamase産 生 能,そ 耐 性 細 胞(No.1- 種 々 の 混 合 条 件 に お け るMICの P.aeruginosa の他 の生 物 学 的性 inhibitor 剤 感 性 細 胞(No.1-S)と R)の よ び 緑 膿 菌2)の い く つ か の 臨 床 分 離 菌 の 中 にserotype, coagulase型,β 3)薬 々 は 各 種 の 呼 吸 器 感 染 症 の 起 炎 菌1)お cell,growth No.1よ 測定 りPIPC,CFSお よびCAZ 状が異 な る コロニ ー が共 存 す る こと を報 告 した。 さ ら に こ な ど の 抗 緑 膿 菌 性 β-ラ ク タ ム 薬 お よ び ア ミ ノ配 糖 体 の種 の コ ロ ニ ー 間 で は,各 薬 に,耐 種 の薬 剤 に対 す る感 受 性 に も顕 37℃,20時 我 々 は 緑 膿 菌 に つ い て の そ の 後 の 検 討 に お い て,Pseudomonas aeruginosa (No.1-S)が,共 No.1か 性 の コ ロ ニ ー お よ び感 性 の コ ロ ニ ー を選 択 採 取 し,そ れ ぞ れMueller-Hinton 著 な相 違 が あ る こ と を 認 め た 。 ら分 離 さ れ た 感 性 細 胞 存 す る 多 剤 耐 性 細 胞(No.1-R)の 増 broth(Difco)中 間 培 養 し た 。 こ れ ら を 同brothで た2×105CFU/mlのP.aeruuginosa に,2×101,2×103お No.1-S懸 uginosa 感 受 性 値 の 関 連 に つ い て も検 討 した の で そ れ ら の 結 果 を 報 各 試 験 薬 剤 が800∼0.025μg/mlの2倍 No.1-R懸 濁 液 を そ れ ぞ れ 混 合 し,た る よ う に調 製 し た 。35℃,18時 I.材 1)試 料 お よび方法 験 菌株 既 報2)の と お り分 離 し たP.aeruginosa 菌 薬 感 性)お よ びNo.1-R(耐 性)を 菌 は 呼 吸 器 感 染 症 患 者 の 喀 疾 よ り分 離 さ れ た も の で あ し た。 ま た 対 照 そ れ ぞれ 単 独 の (CFS,武 イ ク ロ プ レ ー トを 用 い,1ウ cin(SISO,山 *東 京 都 板 橋 区志 村3-30-1 行 った。 No.1か ら得 られ た 感 性 細 胞 と 耐 性 細 胞 を そ れ ぞ れ,105:103CFU/ml,105:105 本 グ ラ ク CFU/mlお よ び103:105CFU/mlの Mueller-Hinton 本 シ ェ リ ン グ),sisomi- 之 内 製 薬),ofloxacin(OFLX,第 製 薬)。 ェ ル100μ1で 剤 耐 性 細 胞 と感 性 細 胞 の 共 存 時 の 両 細 胞 の増 a)Paeruginosa 山 化 学),cefsulodin 田 薬 品),ceftazidime(CAZ,日 ソ),gentamicin(GM,日 測 定 し た。 こ れ ら の 測 定 は,日 殖 次の各薬 剤 を用 いた。 Piperacillin(PIPC,富 よ びNo.1-Rを 本 化 学 療 法 学 会 標 準 法 の 微 量 液 体 希 釈 法3)に 準 じ,マ 4)薬 用抗 菌薬 間 培 養後 菌 の発 育 の と して,No.1-Sお る。 2)使 だち に 希 釈 系列 とな 認 め られ な か っ た 最 小 濃 度 をMICと 場 合 も 同 様 にMICを No.1-S(抗 用 い た。 こ の 濁 液 よ び2×105CFU/mlの1Raer- 殖 を抑 制 す る こ と を 認 め た。 ま た 両 細 胞 の 共 存 比 率 と 薬 剤 告 す る。 で 調製 し 一 brothに 比率 にな るよ う 調 製 し,37℃,18時 間培 養 し,培 養 液 を適 宜 希 釈 し て 両 細 胞 の 生 菌 数 を 寒 天 平 板 法 を用 い て 測 定 し そ の 結 果 をcolony forming unit CHEMOTHERAPY 722 (CFU)で 示 し た 。 対 照 と し て,両 105CFU/m1を 細胞 をそれ ぞれ し,Table1の 単 独 で それ ぞれ接 種 した場 合 の生 菌 数 薬 剤 のMIC値 を 同 様 に 測 定 し た。 b)次 行 い,0,2,4,8,24時 間 後 に経 時 的 に 両細 胞 の 生 菌 数 を 測 定 し た。 ま た 同 一 条 件 下 で,培 感 性 細 胞 に 対 し て2MIC(耐 地 にPIPCが 性 細 胞 に 対 し て1/4 な る よ う に 調 製 し,同 様 に 経 時 的 生 菌 数 を 測 定 し た 。 さ ら に 両 細 胞 培 養 液 中PIPC濃 crococcus Disc法 luteus 度 は,M歩 ATCC 9341を 検 定 菌 と した 薄 層 に よ るBioassay法 で 測 定 し た。 な お 測 定 ポ イ ン トは,生 菌 数 測 定 時 と 同 じ く経 時 的 に測 定 した 。 5)P.aerugginosa No.1の 薬 剤感性 細 胞 の産 生 す 1992 よ う に種 々 の 比 率 で 接 租 した と きの 各 の 変 化 を検 討 した 。 まず,OFLXは に 上 記 同 様 に 翻 製 し た 菌 液 を37℃ で 培 養 を MIC)と JUNE 両 細 胞 に 対 す るMICが25∼50μg/ m1で,MICは 接 種 条 件 の す べ て に お い て 変 化 しな か っ た 。 しか し,GMお 細 胞 のMICが ∼800μ9/m1と よ びSISOで は感 性 細 胞 と耐性 そ れ ぞ れ0.78∼1.56μ9/m1お よび200 大 き な 差 が あ り,感 性 細 胞106CFU/ m1に 耐 性 細 胞 を10℃FU/m1の 添 加 でMICは 急激に 上 昇 し た。 こ れ は耐 性 細 胞 の 両 薬 剤 に対 す る 高 い 耐性 度 を 反 映 し た も の と 考 え ら れ る。 こ れ に 対 し て PIPC,CFSお よ びCAZで は 耐 性 細 胞 の こ れ ら の薬 剤 に 対 す る 耐 性 度 は,感 性 細 胞 の そ れ の4∼8倍 と比 較 的 低 く,接 種 菌 量 中 の 耐 性 細 胞 の 比 率 の 増 加 に伴 っ る耐 性 細 胞 お よ び 各 種 ブ ド ウ糖 非 発 酵 菌 の増 殖 抑 制 物 て,MIC値 質 の検 討 定 時 接 種 菌 量 中 の 耐 性 細 胞 の 比 率 が 増 加 す る と,P P.aeruginosa No.1の をMueller-Hinton 薬 剤 感 性 細 胞(No.1-S) brothで37℃,20時 培 養 液 を4℃,5,000rpm,10分 上 清 を0.45μmの aeruginosa 間 培 養 後, No.1に られ た 2)P.aeruginosa 胞 の増 殖 の 抑 制 で ろ 過 滅 菌 を行 い,試 験 液 と した 。 この 試 験 液 の 一 部 a)抗 は56℃,30分 P.aeruginosa aeruginosa 間 熱 処 理 し た。 こ れ ら の 試 験 液 にP No.1の 薬 剤 耐性 細 胞 お よび そ の他 の緑 対 す るMICは れin No.1の No.1に 共 存 す る 両 細 胞 が,そ 37℃,20時 brothに 的 に 生 菌 数 を 測 定 して 判 定 し た 。 果 1)P.aeruginosaの との 関 係 P.aeruginosa No.1は,薬 1. MICs of six co-existed 剤 感 性 細 胞 と多 剤 耐 性 antimicrobial at different CFU/mlに 増 殖 し,両 認 め られ な い。 次 に,感 細 胞 が 共 存 す る株 で あ る 。 そ れ ぞ れ 両 細 胞 を分 離 培 養 Table 間 培 養 後 に109CFU/m1に ま た 耐 性 細 胞 の み を105CFU/m1接 薬 剤感 性 お よび 耐性 細 胞 の共 存 比 率 とMIC値 通 り,Mueller-Hinton 感 性 細 胞 の み を105CFU/ml接 37℃,18時 II.結 agents for Pseudomonas 胞103CFU/m1を 種 し て も ほ ぼ10, 細胞 そ の もの の増 殖 に相違 は 性 細 胞105CFU/m1と 耐 性細 同 時 接 種 す る と,感 性 細 胞 は18時 間 培 養 後 に109CFU/mlに aen4ginosa 種 し た 時, ま で増 菌 す る。 No.1 when まで 増 殖 す る が,耐 性 細 胞 resistant and susceptible cells rates (MIC: ug/m1) S1): Susceptible cell R2): Resistant cell Agar method dilution れぞ vitroで どの よ う な 増 殖 態 度 を示 す か とい う点 に 検 討 を 加 え た 。Fig.1の れ ぞ れ の 増 殖 の 有 無 を経 時 感 性 細 胞 に よ る耐 性 細 菌 薬 の 存 在 しな い 条 件 膿 菌 属 と各 種 ブ ド ウ糖 非 発 酵 菌 の 標 準 菌 株 を 接 種 し, 間 培 養 し,そ 耐性細 胞 の耐性度 を反 映 した 値 を と る 。 リ ポ ア 社) 間 遠 心 し,得 ミ リポ ア フ ィル タ ー(ミ は緩 や か に 上 昇 し た 。 す な わ ち,MIC測 VOL. 40 NO. Fig. 1. Counts of drug-susceptible aeruginosa a) Fig. No. b) S: R=105: 103 2. Growth without は接 種 し た10℃FU/m1か and 1 at different curve aeruginosa 量 接 種 し た場 合 で も同 様 性 細 胞 を105 CFU/m1の 接 種 で は,両 細 胞 と 同 程 度 に 増 殖 し た。 こ の 結 果 か ら,感 性 細 胞 の 優 勢 時 に 耐 性 細 胞 の 増 殖 が 抑 制 され 以 上 の3条 件 で 両 細 胞 を 接 種 し た 際 の 生 菌 数 の変 化 示 し た。 Fig.1の18時 それ ぞ れ 裏 付 け るgrowth curveが c) S: R=103: and resistant 1 during mixed 105 cells culture b)PIPCの 存 在 下 で 感 性 細 胞 の 増 殖 を一 時 阻 止 す る条件 PIPCを MICに 感 性 細 胞 に 対 し て2MIC(耐 相 当)の 性 細 胞 の1/4 濃 度 に 添 加 し,両 細 胞 の 接 種 量 を 種 々 に 変 化 し て,そ れ ぞ れ の増 殖 パ タ ー ンを観 察 し た。 2MICのPIPCは る と判 断 し た 。 をFig.2に No. of Pseudomonas cells. a drug. な 傾 向 が 認 め ら れ た。 さ ら に 感 性 細 胞 を103CFU/ も108∼10℃FU/mlと cells of both S: R=105: 105 ら増 殖 し な い。 さ ら に両 細 胞 を そ れ ぞ れ105CFU/m1同 resistant inocula of drug-susceptible of Pseudomonas m1,耐 723 緑膿 菌 の コロニー性状 と増 殖抑制 物質 6 が,培 感 性細胞 の増 殖 を完全 に抑制 す る 養 液 中 で 耐 性 細 胞 の 増 殖 に 伴 っ て 分 解 を受 け 間培 養後 の結果 を る 。Fig.3-a)で は,PIPCに 得 られ た。 細 胞 の増 殖 が 抑 制 さ れ,そ よ っ て 培 養 初 期 に感 性 れ に 伴 い耐 性 細 胞 は 著 しい CHEMOTHERAPY 724 a) S:R=105:103 Fig. 3. Growth Pseudomonas b) S:R=105:105 (105CFU/ml)接 c) curve of drug-susceptible aeruginosa No. 1 during presence of piperacillin cells, 1/4 MIC). 増 殖 が み ら れ る 。Fig.3-b)の JUNE (susceptible 1992 S;R=103=105 and resistant cells of mixed culture in the cells, 2 MIC; resistant 両細 胞 をほ ぼ同量 種 し た 条 件 で は,PIPCに よ る感 性 細 胞 の 増 殖 抑 制 が み られ る培 養 初 期 で は耐 性 細 胞 の増 殖 が や や 阻 止 さ れ,PIPCの 分解 の進 行 と ともに増殖 傾 向 を強 め た。Fig.3-c)の よ う に耐 性 細 胞 の 接 種 量 を感 性 細 胞 の そ れ よ り も多 くす る と,耐 性 細 胞 の 増 殖 は培 養 初 期 か ら よ り顕 著 と な っ た 。 以 上 の 成 績 か ら,耐 性 細 胞 と感 性 細 胞 を接 種 菌 量 の 種 々 の 組 み 合 わ せ で 接 種 し た場 合,両 細 胞 の 増 殖 パ タ ー ン か ら,Fig .2に 示 し た 抗 菌 薬 無 添 加 時 の 結 果 を 確認 した。 3)P.aeruginosa No.1の 感 性細 胞 の培 養上 清 液 の耐 性 細 胞 の増 殖 抑 制 作 用 Fig. 4. of 前 述 の 通 り,感 性 細 胞 と耐 性 細 胞 を 混 合 培 養 す る Inhibition of growth Pseudomonas natants from of drug-resistant aeruginosa broth cultures No.1 by of susceptible cells supercells. と,耐 性 細 胞 の 増 殖 が 感 性 細 胞 に よ り抑 制 さ れ る傾 向 が 認 め られ た 。 こ の 原 因 を検 討 す る た め,ま ler-Hinton brothで 感 性 細 胞 を37℃,20時 そ の 遠 心 上 清 ま た は そ の56℃,30分 細 胞 を接 種 した 。37℃,24時 Fig.4の ずMuel間 培 養 し, 熱 処 理 液 に耐 性 間 それ ぞれ培 養 した。 通 り,熱 処 理 上 清 液 中 で は,耐 性 細 胞 は よ く増 殖 し た 。 しか し,無 処 理 上 清 液 中 で は耐 性 細 胞 って,同 株 に共存 す る耐性 細胞 の増 殖 が阻止 され るこ とが判 明 した。 この物 質 の本体 につ いて は,引 き続 き 検 討 中で あ る。 4)P.aeruginosa No.1の 感 性細 胞 の培 養 上清 液 の各種 ブ ドウ糖 非発 酵菌 の増 殖 にお よぼ す影響 前述 の感 性細 胞 の培養 上清 中 の耐性細 胞 の増殖 抑制 感受 性細 胞 物質 が,他 の 緑膿菌 属 お よび ブ ドウ糖 非発 酵菌 の増殖 に影響 を与 え るか どうか を検 討 した。 その結 果No.1 -R株 を阻止 す る よ うな現 象 は ま った く認 め られ ず, の増 殖 に よ っ て 培 地 中 に 産 生 さ れ た 易 熱 性 の 物 質 に よ 用 い た試験 菌 の発 育 に は まった く影響 を与 えな い事 実 の 増 殖 は 接 種 後8時 間 ま で 完 全 に 抑 制 さ れ,8時 間以 降 ほ ぼ 接 種 した 水 準 の生 菌 数 ま で 回 復 し た。 こ の 結 果 か ら,P.aeruginosa No.1の VOL.40 725 緑膿 菌 の コロニー性状 と増 殖抑 制物 質 NO.6 た は プ ラ ス ミ ドの 導 入 に よ る細 胞 形 質 の転 換,ま たは 異 な っ た性 状 を も つ 同 一 菌 種 の 混 合 感 染 の 可 能 性 が 考 え られ る 。 今 回 は ま ず,P.aeruginosa 性 細 胞 と耐 性 細 胞 が,各 MIC値 No,1中 に 共 存 す る感 種 の抗 菌薬 の本菌 株 に対 す る に ど の よ う な影 響 を お よ ぼ す か と い う問 題 を 検 討 し た。 そ の 結 果,MIC値 は耐 性 の程 度 お よび 耐 性 細 胞 の比 率 に 対 応 し た値 を と る こ とが 明 ら か に な っ た。 またP.aeruginosa No.1の 相 互 作 用 を 検 討 し た が,耐 増 殖 に 対 す る両 細 胞 の 性 細 胞 の増 殖 は 感 性 細 胞 の 増 殖 に よ っ て抑 制 さ れ る傾 向 が み ら れ た。 一 般 に 薬 剤 耐 性 株 の 発 育 速 度 は感 性 株 よ り遅 い と言 わ れ て い る が,我 々 の 検 討 で はP.aeruginosa No.1中 の耐性細 胞 の発 育 速 度 は感 性細 胞 の それ と相 違 しな い。 しか し,感 性 細 胞 は培 養 液 中 に 耐 性 細 胞 の 発 育 を抑 制 す る 易 熱 性 の 物 質 を 産 生 す る こ と を 認 め た。 こ の 物 質 は, Fig. 5. Growth mentative tures curves rods of various in supernatants of drug-susceptible aeruginosa non-glucose from cells broth fercul- 特 定 の 緑 膿 菌 に 特 異 的 で,そ の他 の ブ ドウ糖 非 発 酵 菌 の 発 育 に は 影 響 を お よぼ さ な い。 こ の 本 体 に つ い て は 引 き続 き検 討 中 で あ る 。 of Pseudomonas P.aeruginosa No.1. No.1を 含 め て この菌種 の一 部 の菌 株 に 共 存 す る耐 性 細 胞 と感 性 細 胞 は,感 性 症 の過 程 に が 得 られ た 。 何 らか の影 響 を お よ ぼ す 可 能 性 が 考 え られ る。 III.考 察 文 さ き に我 々 は,臨 床 材 料 よ り分 離 され た 各 種 の 病 原 1) 菌 に は,生 物 学 的 性 状 が 異 な る コ ロ ニ ー が 共 存 す る菌 株 が 存 在 す る こ と を 報 告 し た1,2)。そ の 結 果,こ うな 菌 株 に よ る感 染 症 で は疫 学 的 な 問 題,抗 択上 の 混 乱,臨 床 効 果 とinvitro評 状 と薬 剤 感 受性,(I) 呼吸 器 感 染症 分 離菌 に つ い て。Chemotherapy 39: 129∼137, 1991 の よ 菌 薬 の選 2) 価 結果 の不 一致 な どの 原 因 と な る 可 能 性 が あ る こ と を 指 摘 し た。 特 に P.aeruginosaで は,同 β-lactamase産 の よ うな コ ロニ ー 間 で は 生 能 や 各 種 の薬 剤 に対 す る感 受性 が 相 違 す る 。P.aeruginosaの 同 一 菌 株 にserotypeの な る細 胞 が 共 存 す る原 因 と し て は,フ 異 ァ ー ジ の感 染 ま 小 林寅 詰, 長谷 川 美幸, 西 田 実, 五 島瑳 智 子: 各 種 の 臨床 分 離 菌 の コ ロニー レペ ル にお け る生物 学 的 性 状 と薬 剤 感 受 性,(II) 緑 膿 菌 につ い て。Chemotherapy 39: 753∼760, 1991 一 菌 株 の コ ロ ニ ー でserotype の 異 な る も の が 共 存 し,こ 献 小林 寅 詰, 長谷 川 美幸, 西 田 実, 五 島瑳 智 子: 各 種 の 臨床 分 離菌 の コ ロニー レペ ル にお け る生物 学 的 性 3) 微 量 液体 希釈 に よ るMIC測 定 法 (微量 液体 希釈 法) -日 本 化 学 療 法学 会 標 準 法- 。Chemotherapy 38: 103∼105, 1990 CHEMOTHERAPY 726 BIOLOGICAL CHARACTERISTICS BACTERIA (III) JUNE OF CLINICAL AT THE COLONY ISOLATES 1992 OF LEVEL INHIBITION OF GROWTH OF MULTIDRUG RESISTANT CELLS BY SUSCEPTIBLE CELLS CO-EXISTING IN A SINGLE ISOLATE OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA Intetsu Kobayashi") Miyuki Hasegawa", Utsuki Uchino", Minoru Nishida") and Sachiko Goto2) Chemotherapy Division, Mitsubishi-Yuka Bio Clinical 1) Laboratories, 3-30-1, Shimura, Itabashi-ku, Tokyo 174, Japan 2) Department of Microbiology, School of Medicine Toho University Minimum typical inhibitory isolate mined and of resistant the resistant the in cells cells growth in an 3TC, For but inhibited growth negative bacteria was to susceptible inoculum and susceptible reason, unstable of some tested. degree the the degree in of heating of six drugs serotypes resistance MIC P. of the of the resistance of aeruginosa factor was at 56•Ž for P. aeruginosa, the in No. 1 in the broth was did a single varied each in aeruginosa drug. the mixed and to by was the other of the ratio number species of between investigated. cells susceptible factor a deter- drug-susceptible broth the the interaction culture culture inhibit inoculum The inhibited 1, were according Furthermore, not No. drug-susceptibilities, cells drugs minutes. but Pseudomonas to produced 30 for and values Mueller-Hinton inhibitory isolates of different of cells cells to of cells. drug-resistant the (MICs) colonies regard to and of inoculated. at forms compared drug-resistant The concentrations , which cells specifically of gram-
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