じっけんレシピ〒140-0002東京都品川区東品川2-2-24天王洲セントラルタワー4Ｆ Tel: (03) 5796-7330 Fax: (03) 5796-7335 e-mail: [email protected] 細胞の凍結保存法以下のプロトコールは-80℃フリーザーを使用した細胞凍結保存法です。ECACCでは通常プログラムで制御されたフリーザーを使用しており、これが一番細胞を凍結させるのに信頼性の高い方法なのですが、多くの研究室にはコストがかかりすぎる場合がありますので、以下の方法を推奨します。もし多数の細胞株を定期的に保存する必要性がある場合はプログラム化されたフリーザーを使用するのが良いでしょう。必要な機器、試薬 • 凍結保存剤（通常は 90% FBS, 10% DMSO もしくはグリセロール。ECACCデータシートで適合する溶媒を確認する） • 70% (v/v) エタノール • PBS(-)： Ca2+/Mg2+不含PBS：製品番号 D8537 （1x溶液） • 0.25% トリプシン-EDTA （ハンクス緩衝液）：製品番号 T4049（0.25%溶液） • DMSO：製品番号 D2650 • 凍結保存用バイアル（クライオチューブ）：製品番号 SIAL0659、SIAL0663など • 凍結保存用容器：製品番号 C1562 • 遠心分離機 • 血球計算盤（ヘモサイトメーター）：製品番号 Z359629 • マーカーペン（シグマラボマーカー）：製品番号 S5894 S5769 など • 駒込ピペット • 遠心管立てや凍結チューブ立て手順凍結保存用容器：製品番号C1562 （製品にバイアルは含まれません） 1. 顕微鏡で細胞密度を確認し、同時にバクテリアやカビのコンタミがないか観察します。 2. 対数増殖期の細胞が一番凍結に適しています。接着性細胞の場合は80-90%コンフルエントの状態で凍結するのが一番よいでしょう。 3. 接着性細胞（半接着を含む）はトリプシン-EDTAを使用し、懸濁液の状態にします（プロトコール 1.3, 1.4参照）。懸濁液は加えたトリプシンと等量以上の培地を加えてください。懸濁液の状態のまま使える細胞株もあります。 4. 懸濁液から少量(100-200 μL)を採り細胞をカウントします（プロトコール１.6 血球計算盤を用いた細胞数の数え方参照）。このときの細胞生存率は90%以上が凍結保存に好ましい状態といえるでしょう。 5. 残りの懸濁液を遠心します（150 x g 、5分間）。新しい培地に再懸濁した細胞に対し2-4 x 106 cells/mLになるように細胞凍結保存剤を加えていきます。 6. 凍結保存用バイアルに細胞名、継代歴、及び凍結した日付などをマーカーで記載し、1 mLずつ分注します。 7. バイアルを密封して凍結保存用容器（製品番号 C1562）などに入れ、-80Cで凍結保存します。 8. 凍結保存されたチューブは液体窒素タンク用のホルダーに取り付けて液体窒素タンクに手早く収納します。お問い合わせ先：製品の技術的なご質問 [email protected] 価格・在庫のご質問 [email protected] 2013.07 じっけんレシピ〒140-0002東京都品川区東品川2-2-24天王洲セントラルタワー4Ｆ Tel: (03) 5796-7330 Fax: (03) 5796-7335 e-mail: [email protected] ポイント • もっとも凍結保存剤として汎用されているのはジメチルスルホキシド (DMSO) ですが、DMSOは全ての細胞株の凍結保存に適していません。HL60株などは分化誘導を引き起こします。このような場合には代替としてグリセロールが使われる場合が多いのですが、詳しくは細胞株に添付されていたECACCデータシートで確認しましょう。 • ECACCの凍結培地はほとんどの細胞株に推奨できます。その他一般的に使用されるものは70% 基本培地, 20% FBS, 10%DMSOの組成ですが、全ての細胞株に使用できる訳ではありません。ルーチンで使用する前に必ず自分の細胞に適しているのか確認しましょう。 • 凍結の前に細胞の状態を必ず確認しましょう。細胞の状態が良好で、対数増殖期であることが一番凍結に良い条件です。この状態にするには細胞が100%コンフルエントにならないよう注意して、培地は凍結する24 時間前までには取り替えておきましょう。凍結培地は上記のように作製できますが、調製された凍結用の細胞凍結保存液も販売しています。製品名製品番号細胞凍結培地-DMSO(1x) Cell Freezing Medium-DMSO 1× C6164 細胞凍結培地-DMSO (血清不含)（１x） Cell Freezing Medium-DMSO Serum free 1x C6295 細胞凍結培地-グリセロール(1x） Cell Freezing Medium-Glycerol 1× C6039 以下は製品番号C6164、C6295またはC6039の細胞凍結保存液を使用した場合の細胞凍結プロトコールです。詳しい手順は前ページの凍結保存法も参照してください。 1. 細胞凍結保存液を融解し、氷上におきます。 2. 接着細胞の場合は、トリプシンやその他の剥離剤ではがします。対数増殖期の細胞が一番凍結に適しています。 3. 細胞を遠心し（遠心分離：10 分, 250 x g, 2-8 ℃ ）、古い培地は出来るだけ取り除きます。 4. 106 ～ 107 cells/mLになるように細胞凍結保存液を加え懸濁させます。ミエローマ細胞やハイブリドーマの場合には細胞密度が高い方が良い結果が得られます。 5. 細胞をクライオチューブ（製品番号 SIAL0659 SIAL0663など）に入れ、凍結が始まるまで5分間ほど氷上におきます。 6. 通常の実験室のプロトコールに沿って細胞を凍結させてください。凍結された細胞の融解方法。詳しい手順はプロトコール1.2 細胞融解方法もご参照ください。 1. 細胞の入ったクライオチューブを液体窒素タンク、もしくはドライアイスから取り出し、ピンセットでチューブのフタ部分を保持して37℃の水浴につけます。 2. 細胞懸濁液1 mLに対し、新しい培地10 mLの割合で希釈します。 3. 穏やかなピペッティング後遠心し細胞をペレット状にして上清を吸い取ってください。 4. 新しい培地で細胞を懸濁し、適切な容器に移して培養します。お問い合わせ先：製品の技術的なご質問 [email protected] 価格・在庫のご質問 [email protected] 2013.07