ダイエタリーサプリメン卜に使用される大豆抽出物とエチニルエストラジオールの複合エストロゲン活性誌名食品衛生学雑誌 ISSN 00156426 川添, 禎浩那賀, 和奈著者石橋, 弘志小原, 智未有薗, 幸司橋本, 香織北篠, 康司鈴木, 隆巻/号 51巻3号掲載ページ p. 101-109 発行年月 2010年6月農林水産省農林水産技術会議事務局筑波事務所 Tsukuba Office, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat J u n e2 0 1 0 1 0 1 報文ダイエタリーサプリメントに使用される大豆抽出物とエチニルエストラジオールの複合エストロゲン活性 (平成 2 1年 9月 1 4日受理) 川添禎浩1 . * 有薗幸司2 那賀和奈l 橋本香織l 石橋弘志2 北僚康司1 小原智未2 鈴木隆l CombinedEstrogenicActivityo fSoybeanExtractUsedi na DietarySupplementandEthinylE s t r a d i o l . ，KazunaNAKA1，H i r o s h iI S H I B A S H I2，TomomiOBARA2， S a d a h i r oKAWAZOE1* K o j iARIZON02，K a o r iHASHIMOT01，Y a s u j iHOJo1andTakashiSUZUKl1 epartmento fFoodS c i e n c e sandN u t r i t i o n a lH e a l t h，KyotoP r e f e c t u r a lU n i v e r s i t y : 1D a p a n ; 1 5Shimogamo，Kyoto606-8522，J F a c u l t yo fEnvironmentalandSymbioticS c i e n c e s，P r e f e c t u r a lU n i v e r s i t yo fKumamoto: a p a n ; 3-1-100Tsukide，Kumamoto862-8502，J * Correspondinga u t h o r 2 Weexaminedt h ecombinede s t r o g e n i ca c t i v i t yo fsoybeane x t r a c tusedi nad i e t a r ys u p p l e mentande t h i n y le s t r a d i o l( E E )c o n t a i n e di nano r a lc o n t r a c e p t i v e .O l i v eo i l( c o n t r o l )，soybean e x t r a c t( 0 . 0 0 3 6o r0 . 3 6g/kgc o r r e s p o n d i n gt od o s e so ft o t a li s o f l a v o n eo f0 . 8 3o r83mg/kg r e s p e c t i v e l y )，EE( 1o r10μg/kg)，andsoybeane x t r a c t +EEwerea d m i n i s t e r e dt oo v a r i e c t o m i z e d CD-1micebyo r a lgavagef o r4c o n s e c u t i v ed a y s . Soybeane x t r a c t( 0 . 0 0 3 6o r0 . 3 6g / k g )andEE ( 1μ g/kg)d i dn o ti n c r e a s et h er e l a t i v eu t e r i n eweight . Ther e l a t i v eu t e r i n eweighto ft h esoybean 10 μg/kg)groupwass i g n i f i c a n t l yh i g h e rthant h a to ft h e e x t r a c t( 0 . 0 0 3 6o r0 . 3 6g / k g )+EE( .Ther e l a t i v eu t e r i n eweighto ft h esoybeane x t r a c t( 0 . 3 6g / k g )+EE( 10μ g/kg)groupwas c o n t r ol a l s os i g n i f i c a n t l yh i g h e rthant h a to ft h eEE( 1 0μg/kg)g r o u p .Soybeane x t r a c tshowede s t r o g e n i c s .Coadministrationo fEEwithsoybeane x t r a c t a c t i v i t yf o rhumane s t r o g e nr e c e p t o r( h E R )ーαands . i n c r e a s e dt h ee s t r o g e n i ca c t i v i t yf o rhER-αand( R e c e i v e dSeptember1 4，2 0 0 9 ) x t r a c t ; ダイエタリーサプリメント d i e t a r ys u p p l e m e n t ; エチニル Keyw o r d s : 大豆抽出物 soybeane t h i n y le s t r a d i o l ; エストロゲン活性 e s t r o g e n i ca c t i v i t y エストラジオール e 緒宅三T E司近年，生活習慣病に対する不安や健康管理の高まりなどから，数多くの健康食品が新聞・雑誌等の広告で宣伝さしょう症予防や更年期障害の緩和を目的として，それを抽出錠剤化した， I 健康食品」のいわゆるダイエタリーサプ D S )がある.また，これとは別に，大豆イソフリメント ( れ，またドラッグストアの庖頭に並べられている.一方，ラボンを関与成分とし，骨の健康に役立つと示唆されてい健康食品の有用性に関する情報は多いものの，安全性に関る「特定保健用食品J(清涼飲料水，豆乳飲料)などにもする情報は極めて少ない状況にある.特に，健康食品の過 ) 内閣府食品安全委員会は， I 特定保健応用されている 3 剰摂取と長期摂取，医薬品との併用に関する情報は少なく，これらについての関連情報が必須とされる 1) 用食品」で大豆イソフラボンが過剰に摂取される可能性を大豆成分のイソフラボンはエストロゲン活性を示す植物の大豆イソフラボンのアグリコンの摂取を 1日 30mgと性エストロゲンである 2) イソフラボンについては，骨粗設定し，乳幼児等のハイリスクグループに対しては摂取を勧めていない * 1 *連絡先京都府立大学食保健学科:干 6 0 6 8 5 2 2京都市左京区下鴨半木町 1 5 2 熊本県立大学環境共生学部:干 8 6 2 8 5 0 2熊本市月出 3 1 l 1 0 0 考慮し，閉経前の女性に対しては「特定保健用食品」から一方，植物性エストロゲンを含む DSに関して，ホルモン剤や経口避妊薬(ピル)との併用による相互作用の可能 *'食品安全委員会大豆イソフラボンを含む特定保健用食品の安全性評価の基本的な考え方 2 0 0 6年 5月. P'~ 1 0 2 食衛誌性が指摘されている 4) これより，エストロゲン活性を持 Vol .5 ， 1N O.3 mmoljLリン酸緩衝液， pH2 . 5( 2 0: 8 0 )を，ゲニスチン，つ大豆イソフラボンの DSと，同様の活性を持つピルとのダイゼイン，グリシティン，ゲニステインの分離に対して併用による影響が懸念される. は，アセトニトリル 20mmol/Lリン酸緩衝液， pH2 . 5 そこで，大豆イソフラボンの DSに使用される大豆抽出 E E )の複合エ物とピルの成分エチニルエストラジオール ( ストロゲン活性を検討した. まず，市販の大豆イソフラボンの DSに含まれるイソフ ( 2 5 :7 5 )を用いた.流速はl.0mL/min，検出波長を 254 nm，試料注入量を 10μLとした. 上記の条件で，市販の DSおよび大豆抽出物に含まれるイソフラボン類のダイジン，グリシチン，ゲニスチン，ダラボンの量を調べ，その結果から i nv i v oで検討を行う際イゼイン，グリシテイン，ゲニステインを，標準溶液の検の大豆抽出物の投与量を決定した. 抽出物と EEの複合エストロゲン活性の検討を行った.以 y=12585.104X，r=l .000，グリシチン: y=11844.707X ，r=0.996，ゲニスチン y=1 9 2 0 4 . 1 9 3 X，r=0.997，ダイゼイン Y=38324.288X，r=l .000，グリシティン Y=1 7 2 7 5 . 7 8 7X，r=0 . 9 9 8，ゲニステイン: Y=34305.641X ，r =0.999) を用いて分離定量し，総イソ下に，詳細を報告する. フラボン量を求めた. 次に大豆抽出物と EEの複合エストロゲン活性を卵巣摘出マウスを用いる子宮肥大試験で検討した. さらに，酵母 t wo-hybrid法による i nv i t r o試験で大豆量線(ダイジン 3 . 卵巣摘出マウスを用いた子宮肥大試験実験方法動物実験は京都府立大学動物実験委員会の承認を受け 1 . 材料と試薬 h a r l e sR i v e rJapan社た. 7週齢の CD-1雌性マウスを C 1特定保健用食品」で市販の大豆イソフラボンの DS ( より購入した.マウスはアノレミニウム製のケージに入れはない)は，すべて京都市内で購入した. DSに使用され (1ケージ 4~5 匹)，床敷 (White る大豆抽出物(大豆イソフラボン含有素材，大豆旺芽抽出製を用いた.オリーブオイル， EE，ゲニステイン，グリシ 2時間周期の明暗サイクルの下， Japan社製)を敷き， 1 室内 ( 2 3: t2C )において飼育した.床敷は 3，4日に一度交換した.飼料は卵巣摘出手術まで固形飼料(船橋 F 2，ティン，グリシチンは和光純薬工業(株)製，ゲニスチン，船橋農場)を与え，飲料水は蒸留水を自由摂取させた. ダイゼイン，ダイジンはフジッコ(株)製を用いた.その他 DSに使用される大豆抽出物に含まれるイソフラボン類の分析結果から，市販の DSのイソフラボンのヒトの 1日摂取目安量 ( 5 0mg/60kg当 0 . 8 3mg/kg)に相当する量の物，イソフラボン 20%含む粉末)はタマ生化学工業(株) の試薬は特級試薬または高速液体クロマトグラフィー用を和光純薬工業(株)より購入した. 2 . HPLCによるイソフラボン類の分析市販の大豆イソフラボンの DSおよび DSに使用される Flake，C h a r l e sR i v e r 0 総イソフラボンを含む大豆抽出物の量を算出し，それをマウスへの低濃度 ( 0 . 0 0 3 6g/kg，総イソフラボン 0 . 8 3mg 大豆抽出物のイソフラボン類(イソフラボン配糖体とイソを含む)の投与量とした.また， 1日摂取目安量の 1 00 フラボンアグリコン)を菊池らの方法5 ) で抽出し HPLC 倍に相当する量の総イソフラボンを含む大豆抽出物をマウ試験溶液を調製した.粉砕した試料 2gに 80%メタノースへの高濃度 ( 0 . 3 6g/kg，総イソフラボン 83mgを含ル溶液 50mLを加え，ホモジナイザーで十分に撹祥 ( 5 0 む)の投与量とした.なお， DSのイソフラボンのヒトの rpm，3min)し，ろ紙(アドパンテック東洋(株)製 NO.5 1日摂取目安量 50mgは，今回，イソフラボン類の分析に用いた市販の DSのパッケージの表示の中で，最も高い量(イソフラボン配糟体とイソフラボンアグリコンの割合は表示されていなし、)である. A) でろ過した.なお，溶液の混濁が著しい場合は高速遠 1 5， 000rpm，1 5min，25C ) を行った.残直に心分離 ( 0 80%メタノール溶液 50mLを加え，撹梓し以下同様の操作を繰り返した.ろ j夜は 40 C 以下で 2~3mL になるまで 0 EEの投与量について，未成熟ラット(経口投与)や卵エパポレーターで減圧濃縮し， 80%メタノール溶液で 1 0 巣摘出ラット(皮下投与)を用いた EEのエストロゲン様 mL定容とした.それをメンブランフィルター ( 0. 45μm) でろ過したものを HPLC試験溶液とした.イソフラボン )および EEのマウスへの影響を作用の評価に関する実験 6 標準溶液は，ダイジン，グリシチン，ゲニスチン，ダイゼ μg/kg/day前後の量が用いられている.これらを参考にして本実験における EEの投与量は 1μg/kg/dayを基準 1 0 μ とした.よって， EE低濃度 (1μg/kg)，EE高濃度 ( g/kg)を投与量とした. 7週齢の CD-1マウスの卵巣を摘出した.術後は植物性 P h y t o e s エストロゲンを極力少なくした NIH-07PLD( t r o g e nLowD i e t ) (オリエンタル酵母工業(株)製)にイン，グリシティン，ゲニステインのそれぞれをメタノールに溶解し 5~300μg/mL に調製したものを用いた. HPLCの装置は(株)島津製作所製の LC-6A型高速液体クロマトグラフ， SPD-6A型 UVスペクトロフォトメト ugai(株)製のリック検出器， C-R6Aクロマトパック， S U-62050型カラムヒーターを用いた.カラムは GLS c i n i s i lQ C18(5μm，4 . 6m mi . d .X 250mm) e n c e s社製の U を用いた.カラム温度を 40Cに設定した.移動相はダイジン，グリシチンの分離に対しては，アセトニトリルー20 0 )， 8 ) においては調べた実験 7 1μg/kg/day前後および 1 0 よって飼育した.卵巣が確実に摘出できたかどうかを，腫 0日で発情休止が続いてスメアを採取して判断し，術後 1 産誌!した .11日1 &から，オリーブオイル(コいることを E J u n e2 0 1 0 大豆抽出物とエチニルエストラジオールの複合エストロゲン活性 1 0 3 ントロー jレ)，大豆抽出物低濃度，大豆抽出物高濃度， EE 酵母細胞壁融解酵素 ( zymolyase20T，生化学工業(株) 低濃度，大豆抽出物低濃度と EE低濃度の併用，大豆抽出製)を物高濃度と EE 低濃度の併用の 6 群(1群 4~6 匹)を設 NaH2 P04 ，1 0mmoljLKC ，l 1mmoljLMgS0 )で溶解し 4 定し，それぞれ 4日間連続経口投与した.また， EEを高た溶液と βーガラクトシダーゼ測定用化学発光用キット Zbu仔e r( 6 0 mmoljL Na2HP04，40 mmoljL 濃度にして同様に 6群を設定し，それぞれ 4日間連続経 (AuroraGal-XEk i t，ICN社製)の反応試薬を 5:3で混口投与する実験も行った.最終投与の翌日に屠殺，合した溶液 80μLを添加し，静置培養 ( 3 7C，1h r )した. Thigpenらの方法的に従って子宮を摘出し，内液除去後の子宮重量 ( b l o t t e dw e i g h t )を測定した.体重に対する子宮重量の比として相対子宮重量を求めた.エストロゲン i o その後，プレートを発光測定装置 (AB2100，ATTOB Instrument社製)にセットして，化学発光用キットの発 AuroraGal-XEk i t，ICN社製)を添加光促進液 50μL( 活性は，子宮肥大に伴う相対子宮重量の増大を指標とし -ガラクトシダーゼ量を測しながら，発光強度を計測し，s f こ . 4 . 酵母 two-hybrid法によるエス卜ロゲン活性試験 DSに使用される大豆抽出物からイソフラボンを菊地ら )で抽出し，さらに βーグルクロニダーゼで酵素処理の方法5 定した.エストロゲン活性の強さは，大豆抽出物から得らし，エーテル抽出を行い，酵母 t wo-hybrid法によるエス 0 れた試験溶液および EEの濃度ごとに化学発光強度を求 T j B )として算出した. め，対照に対する化学発光強度比 ( 5 . 統計処理卵巣摘出マウスを用いた子宮肥大試験のデータは平均値 t a tView5 . 0(SASI n s t i t u t eI n c . ) ±標準誤差で示し， S トロゲン活性試験のため試験溶液を調製した. 試料 2gに 80%メタノール溶液 50mLを加え，ホモジを用いて統計処理を行った.相対子宮重量に関する多群のナイザーで撹伴 ( 5 0rpm，3m i n )し，ろ紙でろ過した.残比較において，一元配置分散分析を行い有意差が認められ漬に 80%メタノール溶液 50mLを加え，撹梓し以下同様た場合 Tukey-Kramer検定を行った.危険率 5%で有意 00 の操作を繰り返した.ろ液は 80%メタノール溶液で 1 mL定容とした.その 2mLを取り，窒素気流下で濃縮乾 -グルクロニ固し，超純水 200μLに溶解した.それを，s 差ありとした. 酵母 t wo-hybrid法によるエストロゲン活性試験のデーイオテスト研究所(株)製) 1mLで酵素処理 ( 3 7C，24h r ) タは平均値±標準偏差で示し， P rism5 . 0b(GraphPad n c，)を用いて統計処理を行った.用量反応曲 Software，I 線から各試験溶液の 50%有効濃度 (EC 5 0値)を算出し後，ジエチルエーテル 5mLで抽出し，遠心分離 ( 3， 000 た. ダーゼ含有の酢酸緩衝液(グルファターゼセット，日本バ 0 rpm，3~5 m i n )した.ジエチルエーテル画分を窒素気流下で濃縮乾固し， DMSO200μLに溶解し，試験溶液とし結た. 1 . 市販の大豆イソフラボンの DSおよび DSに使用さ酵母 t wo-hybrid法によるエストロゲン活性試験は， Nishikawaら1 0 )によって作製され，白石ら 11)から分与さ h E R α あるいはれたヒトエス卜ロゲンレセプター ( hER-s) 導入酵母 Y190株を用いて，既報に従って行った11)， 1 2 ) . hER導入酵母 Y190株では， h E R α あるいは hER-sと酵母転写因子 GAL4の DNA結合領域の融合タンパク質， GAL4転写活性化領域とコアクチベーター果れる大豆抽出物のイソフラボン類含有量イソフラボン類の標準溶液，市販の大豆イソフラボンの DSおよび DSに使用される大立抽出物から調製された試 ig，1に示した. 験溶液の HPLCクロマトグラムを F また， DSと大豆抽出物のイソフラボン類の含有量を Table1に示した. DSのイソフラボン類の含有量は， 4製品についてダイ TIF2の融合タンパク質がそれぞれ発現している.これらジンの融合タンパク質は，エストロゲンの存在下のみで相互作 0.514~2.17 ，夕、、イゼイン用することが知られているため，レポーター遺伝子である 0 ， 025~0.664，ゲニステイン β ガラクトシダーゼの発現量を測定することによりエストて総イソフラボンは 4 ， 99~15.0 mgjgであった.総イソ 2 .4 6~5.77 ，グリシチン1. 97~7.95 ，ゲニスチン: 0.015~0.099 ，グリシティン: 0.003~0.016 mgjg ，そしフラボン量は，各 DSのパッケージの表示にあるイソフラロゲン活性を評価できる. 実験は，まず，凍結保存していた酵母をトリプトファン 3 0C，およびロイシンを除いた培地に接種後，振とう培養 ( 0 ボン量(1錠当りのイソフラボン量など)から換算したイソフラボン量 (mgjg)とほぼ一致していた. 1 7h)し，対数増殖期のものを試験用酵母液とした.試験用酵母液は，分光光度計で濁度 (OD595nm)を測定し，量を調べたところ，ダイジン一定濃度になるように調整した.次に，発光測定用黒色ニスチン大豆抽出物に含まれる 6種類のイソフラボン類の含有 122，グリシチン 6 0 . 6，ゲ 3 8 . 3，ダイゼ、イン: 2 . 0 4，グリシテイン 6 . 3 0， 0 . 2 4 0mgjg，そして総イソフラボンは 230 96ウェルプレート(スミロン， SumitomoB a k e l i t eネ土ゲニステイン製)に，大豆抽出物から得られた試験溶液と EE(hER-a: mgjgであった. 3 1~500 pmoljL，hER-s:156~2 ，500 pmoljL)を 20μL ず、つ単独あるいは併用添加した.さらに，試験用酵母液 60μLを添加し，混合後，静置培養 ( 3 0C，4h r )した. 0 2 . DSに使用される大豆抽出物と EEの併用投与が卵巣摘出マウスの相対子宮重量に及ぼす影響卵巣摘出マウスに， DSに使用される大豆抽出物(低濃 F 縄開 104 食衛誌 J X O O Vol .5 ， 1 NO.3 I s o f 1 a v o n es t a n 伽 d s 也i n D a i o 5 l O D a i d z e i n O e n i s t e i n 0 5 l O 1 5 2 0 25 3 0 R e t e n t i o nt i m e( m i n ) D i e t a r ys u p p l 叩 1 四 G回 i s t i n t D a i d z i n O l y c i 住3 O e n i s 旬i n 。 ↓ 0 5 Re t e n t i o nt i m e( m i n ) 5 l O l O 1 5 2 0 25 3 0 S o y も阻岡田d ー -Oenistin D a i d z i n O l y c i t i n 旬並 O e n i s o 5 。 ↓ 5 1 0 伺 t i o nt i m e( m i n ) R e t l lO 1 5 2 0 25 3 0 F i g .1 . HPLCchromatogramso i e t a r ysupplementandsoybeane x t r a c t fi s o f l a v o n es t a n d a r d s，d HPLCc o n d i t i o n sa r ed e s c r i b e di nt h emethodss e c t i o n . Table1 . I s o f l a v o n ec o n c e n t r a t i o n si nd i e t a r ysupplementsandsoybeane x t r a c t I s o f l a v o n ec o n t e n t(mg/g) Sampl巴 D a i d z i n ヴ 4 ヴ FDnb tFO A q t 32542 qL I ヴ Soybeane x t r a c t 1i 円 4 q O A告 11 D i e t a r ysupplements No. G l y c i t i n G e n i s t i n D a i d z e i n 4 . 7 1 1 .97 3 . 6 2 7 . 9 5 6 0 . 6 1 . 12 0 . 5 1 4 1 .6 1 2 . 1 7 3 8 . 3 0 . 0 2 8 0 . 0 1 5 0 . 0 5 1 0 . 0 9 9 2 . 0 4 T o t a li s o f l a v o n e c o n t e n t ( m g / g ) G l y c i t e i n G e n i s t e i n 0 . 6 6 4 0 . 0 2 5 0 . 3 6 5 0 . 0 6 1 6 . 3 0 0 . 0 0 5 0 . 0 0 3 0 . 0 1 5 0 . 0 1 6 0 . 2 4 0 9 . 6 7 4 . 9 9 11 .4 1 5 . 0 230 Valuesa r emeanso ft h r e et r i a l s 度( 0 . 0 0 3 6gjkg)，高濃度 ( 0 . 3 6gjkg)) と EE低濃度(1μ 投与は，コントロールに対して相対子宮重量が，それぞれ gjkg)を，単独あるいは併用で投与した実験と，大立抽出 1 . 1 倍， 1 .3倍増加した.よって，相対子宮重量は大豆抽物(低濃度，高濃度)と EE高濃度(10 μ gjkg)を，単独出物の濃度増加に伴い増加する傾向があった. あるいは併用で投与した実験の相対子宮重量を Fig.2に示した. Fig.2Aの EE低濃度の場合，大豆抽出物低濃度，高濃 Fig.2Bの EE高濃度の単独投与は，コントロールに対して相対子宮重量が1.4倍増加し，有意な増加であった. また，大豆抽出物低濃度と EE高濃度，大豆抽出物高濃度度あるいは EE低濃度の単独投与は，コントロールに対しと EE高濃度の併用投与も，コントロールに対して相対子て相対子宮重量が増加しなかった. しかし，大豆抽出物低， 1 .9倍増加し，どちらも有意宮重量が，それぞれ1.5倍濃度と EE低濃度，大豆抽出物高濃度と EE低濃度の併用な増加であった.さらに，大豆抽出物高濃度と EE高濃度大豆抽出物とエチニルエストラジオールの複合エストロゲン活性 June2010 1 . 4 1 . 2 2202H20ML 0. 4 0 . 2 o ( 8 ) EE( 1 0 μg / k g ) 0 . 8 一﹄ OH202H50区 0 . 8 0 . 6 1 . 8 642 一﹄ 3BE}Ego-poz 。u a u sBE)Eazsoz ( A ) EE(1μg/kg) 0 . 6 0. 4 0 . 2 。Con!rol SoybeanSoybean o y b e a nS o y b e a n C o n ! r o lS o y b e a nS o y b e a n E E S E x t r a c t E x t r a c t E x ! r a c ! E x ! r a c ! 0 . 0 0 3 6 3 6 0 . 0 0 3 6 0 . 3 6 g/kg g/kg +E E o y b e a nS o y b e a n E E S E x ! r a c ! E x ! r a c ! 0 . 0 0 3 6 0 . 3 6 E x ! r a c ! E x ! r a c ! 0 . 0 0 3 6 0 . 3 6 目 g/kg 105 g/kg g/kg +E E g/kg g/kg +E E g/kg +E E f f e c to fsoybeane x t r a c tande t h i n y le s t r a d i o l( E E )onr e l a t i v eu t e r i n eweighto fovariectomizedmice F i g . 2 . E ( A ) :R e s u l to fa d m i n i s t r a t i o no fsoybeane x t r a c t+EE1μg/kg. ( B ) :R e s u l to fa d m i n i s t r a t i o no fsoybeane x t r a c t+ EE lOl 1g /kg. Valuesa r e means: tSEfrom4-6mice.* :Significant 1y d i f f e r e n tfrom c o n t r o l (p<0 . 0 5 ) .非 S i g n i f i cant 1yd i 妊e r e n tfromEEa l o n eω<0.05) 4 0 1 2 0 ・一司 EE63pmol/L+SE 一合一ーE E1 2 5p m o l / L+S E 喝d 6 0 -<トー E E2 5 0p m o l / L+S E -・一一 E E5 0 0p m o l / L+S E J O 4 内 Z Z ー一合一 E E3 1p m o l / L+S E 4 内 E 80 ( 8 )hER-s O 内 S o y b e a nE x ! r a c !( S E ) -->e 。帥 O 内 } b FbnuRunu 豊100 (A)hER・α ( 白戸) EggEZJQ恥。。一刃包 { 1 5 ち 4 0 0 1 0 喝・4 帽 0 0 : : 2 ・ -EE3 1 3p m o l / LS E ー → ーE E6 2 5p m o l / LS E + + a ーーE E1 2 5 0p m o l / L+S E -→ーー E E2 5 0 0p m o l / L+S E F 5 0 0 1 . E 0 6 S o y b e a nE x ! r a c !( S E ) -->e 一一合一ーE E1 5 6p m o l / L+S E 1 . E 0 5 1 . E 0 4 1 . E 0 3 Logc o n c e n t r a t i o n ( D i l u t i o nr a t eo fsoybeane x t r a c t ) 1 . E 0 6 心5 1 . E ・ 0 4 1 . E Logc o n c e n t r a t i o n ( D i l u t i o nr a t eo fsoybeane x t r a c t ) 1 . E 0 3 F i g . 3 . E s t r o g e n i ca c t i v i t i e so fmixtureso fsoybeane x t r a c tande t h i n y le s t r a d i o l( E E )onhumane s t r o g e nr e c e p t o r( h E R ) αandsusingt h ey e a s ttwo-hybridassay ( A ) :R e s u l t sf o rhERα(B):R e s u l t sf o rhER-s. Valuesa r ep r e s e n t e da st h er a t i oo fchemiluminescence(CLN) i n t e n s i t y(T/ B )ofβgalactosidase. Valuesa r emeans: tSDfromthreeorfourindependentexperimentswitheach determinationmadei nt r i p l i c a t e . の併用投与は， EE高濃度に対しでも相対子宮重量が1.3 倍増加し，有意な増加であった. 3 . DSに使用される大豆抽出物と EEの併用が hER-α あるいは hER-.β のエス卜ロゲン活性に及ぼす影響 EE単独の用量反応曲線は示していないが，同様に EE の EC5 0値を算出したところ，hER-α では 630pmoljL， hER-sでは 3600pmoljLであった. EEは hER-sよりも hER-α に対して， 5 . 7倍強いエストロゲン活性を示した. DSに使用される大豆抽出物から得られた試験溶液とこれらを併用添加した場合， hER-α(Fig.3A)および EEを， hER-α あるいは hER-sを組み込んだ酵母を用い hER-s( F i g .3B)ともに， EEの各濃度において併用添加て， two-hybrid法によりエストロゲン活性を測定した. した大豆抽出物の濃度増加に伴い TjBは増加した. EE 各処理濃度で単独・併用添加した際の TjBの変化を Fig. の各濃度における大豆抽出物の併用添加の EC5 0値を算出 3に示した. 用量反応曲線から，大豆抽出物単独の EC5 0値を算出し，hER-s たところ，hER-α(Fig.3A)では希釈率 3.6X10-4 5 (Fig.3B)では1.6X 10- であった.大豆抽出物は hER-α よりも hER-sに対して， 23倍強いエストロゲン活性を示した. したところ，hER-α では， EE31pmoljLにおける大豆抽出物の併用添加の場合を除き， 1 .8X 1O -4~2.1 X 10-4 の範囲にあり，大豆抽出物を単独添加した場合の EC50値 ( 3 . 6X 10-4)より低値を示した.一方，hER-sでは1. 2X 1O -5~ 1 .5X 10-5の範囲にあり，大豆抽出物を単独添加 )より低値を示した. した場合の EC5 1 .6X 10-5 0値 ( F ' - 1 0 6 食衛誌 Vo. l5 ， 1N o.3 考察ンの合計量)を算出してみると， 3 5 . 9，4 3 . 9，1 4 . 9mgjg 乳ガンや前立腺ガンは代表的なホルモン依存性ガンであとなり，本研究で調べた市販の DS中の総イソフラボン量る14) これらのことから，エストロゲン活'性を持つ物質を 3製品の表示の 1日摂取目安量は，イソフラボンとして 50mg (錠剤 )， 60mg (錠剤 1g )，50mg (錠斉Ij2g ) である 1 .26g とされおり，本研究の DSの表示の 1日摂取目安量 50 mgに近いため，イソフラボンを摂取する量に関しては，摂取するにあたって，摂取方法によっては乳ガン等のリス両者は大きな違いはないと考えられる. り，それぞれエストロゲンやアンドロゲンに依存して増殖することが知られている 13) また，乳ガンについてはエストロゲンが結合する核内レセプターであるエストロゲンレセプターの遺伝子の発現が充進していることが知られていクを高める可能性があると推論される. よりも約 1~9 倍高い値となる.ただし，また， 3製品の表示に基づくイソフラボン量を算出するそこで，本研究はエストロゲン活性に焦点を絞った検討 5 0mgj錠剤1.26g )，60mgjg ( 6 0mgj錠と 40mgjg ( を行った.研究で用いた EEはエストロゲンアゴニストで )， 25mgjg ( 5 0mgj錠剤 2g ) となり，分析に基剤 1g ) また，イあり，子宮肥大試験で子宮重量を増加させる 6 づく総イソフラボンに比べて，それぞれ1.1， 1 .4，1 .7倍高ソフラボンもエストロゲン活性を示し 2)，食品安全委員会い. しかし，極端に大きな差ではないので，少なくとも分の「大豆イソフラボンを含む特定保健用食品の安全性の考析に基づく 6種類のイソフラボン類の含有量の合計は製え方」の報告においても，イソフラボンは生体内でエスト品のイソフラボン量として反映していると思われ，本研究ロゲンレセプターに結合し，生体作用を発揮することかの結果と大きな違いはないと考えられる. ら，安全性の評価はエストロゲンレセプターを介する作用 1 を指標として検討されている * 大豆抽出物に含まれる 6種類のイソフラボン類を分析して含有量を調べたところ，総イソフラボン量は 230 なお，厚生労働省は食品安全委員会の報告を受けて， mgjgであった ( T a b l e1 ) .そこで，この結果を用いて，大「大豆イソフラボンを含む特定保健用食品等の取扱いに関豆抽出物と EEの複合エストロゲン活性を i nv i v oの卵巣する指針」によって， I 特定保健用食品」および「いわゆ摘出マウスを用いる子宮肥大試験で検討したところ，相対る健康食品」からの大豆イソフラボンの適切な摂取量を，子宮重量は，大豆抽出物(低濃度，高濃度)あるいは EE イソフラボンのアグリコンとして 1日 30mgを超えない低濃度の単独によって増加しなかったが，大豆抽出物(低ように設定するよう指導することを通知している * 2 濃度，高濃度)と EE低濃度を併用したところ増加する傾一方，イソフラボンの有効性については，ヒトの成人に向を示した ( F i g . 2 A ) .EEが高濃度の場合，大豆抽出物のおいて骨粗しょう症，更年期障害，循環器疾患，ガン(乳濃度に依存して有意に増加し，大豆抽出物と EEの両方がガン，子宮体ガン，前立腺ガン)などに対して改善や予防高濃度の場合は EE高濃度に対しでも有意に増加した 5 ) また，大豆食品などを常食する効果が期待されている 1 ( F i g . 2 B ) .これらのことから，大豆抽出物と EEを併用し日本人は乳ガンなどが少ないことを，欧米に比べイソフラた場合の複合エストロゲン活性は，大豆抽出物の濃度増加ボンの摂取量が多いことに関連づけて報告されている 16) に伴って増加するものと考えられた. 大豆製品・イソフラボンの摂取と乳ガン発生率の減少の関なお，今回の実験で用いた大豆抽出物の濃度は，低濃度係を示す厚生労働省多目的コホート研究を用いた世界初の p o s i t i v ed a t aも発表されている 17) イソフラボンについ (0.0036gjkg)と高濃度 ( 0 . 3 6gjkg)であり，経口投与の期間は 4日間である.この実験条件下， EEとの複合エスては生体影響に関する相反する知見がある中で総合的な評トロゲン活性は大亘抽出物の濃度増加に伴って増加した価が必要とされている. が，大豆抽出物の低濃度と高濃度は 100倍の違いがある. 市販の大豆イソフラボンの DS含まれるイソフラボン類 EEについても，実験では EE低濃度(1μgjkg)と EE高の含有量を調べたところ，合計した総イソフラボン量は 4 1 0 μ gjkg)を用いており， EE低濃度から大豆抽出濃度 ( ( T a b l e1 )，各 DS のパッケージの表示のイソフラボン量とほぼ一致してい物との複合エストロゲン活性が増加する傾向にあるが，製品で 4.99~15.0 mgjgの範囲であり EE低濃度と EE高濃度は 1 0倍の違いがある.したがった.よって，測定した 6種類のイソフラボン類の含有量て，その聞の濃度増加に伴う反応の増加状況が不明であの合計は DSのイソフラボン量に反映できると考えられる.さらに，投与期聞を延長した場合の反応の変化も不明た. 石見ら 18)は，国内の市販の健康食品の大豆イソフラボンである.今後，これらの点を検討する必要性があると考えられる. の分析を行い， DSに相当する錠剤型の大豆イソフラボン一方，大豆抽出物と EEとの併用の影響を子宮肥大試験加工食品については 3製品を調査報告している.その結によって検討した報告はないが， Shmidtら19) は，卵巣摘果から， 3製品の総イソフラボン量(ダイジン，グリシチン，ケ、ニスチン，夕、、イゼイン，グリシティン，ゲニステイ EE(30μgjkgjday)を単独あるいは併用で 3日間経口投 * 2厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知“大豆イソフラボンを含む特定保健用食品等の取扱いに関する指針について"平成 1 8年 8月 2 3日，食安発第 0 8 2 3 0 0 1号 ( 2 0 0 6 ) . 出ラットを用いて，ゲニステイン ( 1 0 0mgjkgjday)と与し，子宮重量などのホルモン活性を調べている.相対子宮重量の結果を見てみると，コントロールに対してゲニステインは約1.5倍， EEは約 2倍の増加となり，単独投与 J u n e2 0 1 0 大豆抽出物とエチニルエストラジオールの複合エストロゲン活性 1 0 7 によってどちらも有意な増加が認められ，それらを併用し投与によって子宮や腫で αおよび βが発現し， αおよび P た場合は 3倍以上の増加となり， EE単独よりも有意な増の発現の低下が，子宮や睦の形質の変化に関連しているこ加が認められている. Shmidtらはゲニステインと EEのとが報告されている 22) すなわち，エストロゲン活性を持併用投与は明らかに相加的な作用をもたらすと考察していつ物質について，i nv i t r oでエストロゲンレセプターのサブタイプに対する作用を調べれば，i nv i v oでの作用をレる. その際の投与条件であるゲニステインの投与量(100 mgjkg)，EEの投与量 ( 3 0 μ gjkg)および 3日間投与は，今回の実験の大豆抽出物高濃度の投与量 ( 0 . 3 6gjkg，総セプターレベルで説明できる. そのため本研究では，酵母 t wo-hybrid法を用いて，エストロゲンレセプターの αおよび β に対する大豆抽出物イソフラボン 83mgを含む)中のゲニステイン量， EE と EEおよびそれらの併用影響を評価した.なお，酵母高濃度の投与量(10 μ gjkg)および 4日間投与より，量が two-hybrid法は，エストロゲン依存的なエストロゲンレ多い.そのため，ゲニステインと EEの単独投与によってセプターとコアクチベーターの相互作用をみており，作用も今回の実験の結果(大豆抽出物高濃度単独は増加なし，機序は生体反応の一部を反映していることから，i nv i v o EE高濃度単独で1.4倍増加)以上に増加が認められたものと推測される.さらに，ゲニステインと EEを併用投与有用な方法である. の実験によって得られた生体反応の結果を説明するためのすることでも，今回の実験の結果(大豆抽出物高濃度と酵母 t wo-hybrid法 ( h E R α ，hER-s)において大豆抽出 EE高濃度の併用で1.9倍増加)以上に明らかな増加が見られたものと考えられる. したがって， Shmidtらの実験物と EEの併用添加の影響を検討したところ， EEの各濃度において大豆抽出物の濃度増加に伴い TjBは増加したは，投与量，実験動物などの違いはあるが，本実験で大豆 ( F i g .3A，F i g .3 B ) . また， EEの各濃度における大豆抽出抽出物と EEを併用すると複合エストロゲン活性が増加し物の併用添加の EC 0値を算出したところ， h E R α および 5 たことと同様の結果であると示唆される. hER-sともに，大豆抽出物を単独添加した場合の EC 50値また，片山らは，幼若雌性ラットを用いて，イソフラボより低値を示したことから，大豆抽出物と EEを併用する 0 . 3 μ gjkg)を単独ンのゲニステイン ( 10mgjkg)と EE( とエストロゲン活性が増加することが明らかとなった. こあるいは混合で単回経口投与して，子宮重量などの変化を nv i t r oの結果は，大豆抽出物と EEの併用による複合のi 調べている *3 その結果，単独投与では明瞭な影響は認めエストロゲン活性は大豆抽出物の濃度増加に伴って増加すられないが，混合すると明瞭な子宮肥大反応が認められ，るという i nv i v oの結果を裏づけるものとなった.また，さらに，混合による複合効果はエストロゲンレセプターの大豆抽出物の単独添加では，hER-sにおける EC 50値はアンタゴ、ニストとの混合投与によりキャンセルされたこと h E R α より 23倍低い値を示し，大豆抽出物は hER-sにを報告している. 対して強いエストロゲン活性を有していることが明らかと 1 0mgj 片山らの実験におけるゲニステインの投与量 ( なった. これらの結果は，ゲニステインやダイゼインなど k g )は，今回の実験で用いた大豆抽出物低濃度 ( 0 . 0 0 3 6 の植物性エストロゲンは αよりも β に対して強い結合活 gjkg，総イソフラボン 0 . 8 3mgを含む)と高濃度 ( 0 . 3 6 性および遺伝子転写活性化能を示した Kuiperらの報告 21) gjkg，総イソフラボン 83mgを含む)の間にあり，またを反映していると考えられる. EEの投与量 ( 0 . 3 μ gjkg)は， EE低濃度 ( 1 μ gjkg)より少ゲニステインと EEを併用投与すると，子宮重量が相加なく，それぞれ 1回投与であるが，混合することで明ら的に増加することを認めた前述の Shmidtらの報告 19) にかな反応が見られている.このことも，本実験で大豆抽出おいて，ゲニステインはエストロゲンレセプター α と非1 物と EEを併用すると複合エストロゲン活性が増加したこ常に弱し、相互作用を持ち， EEのエストロゲンレセプターとと一致する. αとの結合において競合しないと考えられている. したがってゲニステインはエストロゲンレセプター αの弱いアゴ、ニストになる 23)と示唆されている. イソフラボンや EEはエストロゲンレセプターに結合し，生体作用を発揮するが，レセプターには αとβ の 2 つのサブタイプがあり，ラットを用いた研究では， αは子この考え方からすると，今回の i nv i t r oの実験におい宮，精巣，下垂体，卵巣，腎臓，精巣上体，副腎，sは前て，大豆抽出物と EEを併用するとエストロゲン活性が増立腺，卵巣，肺，腸脱，脳，子宮，精巣で発現していることが明らかになっている 20) また，イソフラボンなどは，加するという結果は， h E R α あるいは hER-sで EEの強 αよりも β に対して強い結合活性および遺伝子転写活性化能を示すことが報告されている 21). EEについても，そのの作用が総合的に影響し，エストロゲン活性が増加したた * 3片山誠一，芦沢幸二，永井賢司，山本由徳，大保真由美，秋山賢之介，山下保志.幼若雌性ラットの子宮におけるエストロジェン応答遺伝子の発現に及ぼす巴t h y n y le s t r a d i o l，g 巴 n i s t e i n，m e t h o x y c h l o rおよび 1 C 11 8 2，7 8 0の複合効果.第 3 1回日本トキシコロジー学会学術年会プログラム・要旨集， p .3 0 3( 2 0 0 4 ) いエストロゲン活性と大豆抽出物の弱いアゴニストとしてめであると推測され， αとβ の両レセプターを介した活性が，i nv i v oの実験における大豆抽出物と EEを併用すると子宮重量が増加する結果に反映されると説明できる.ただし， EEの単独は hER-sよりも h E R α に対して 5 . 7倍強いエストロゲン活性を示したが，大豆抽出物は hER-s に対して強いエストロゲン活性を示していることを含め，，..-~胸 108 食衛誌子宮で αとβ の両レセプターのどちらがどの程度関与す Vol .5 1，NO.3 絵子，川角祐介の両氏に深く感謝いたします. るのかは不明である. ところで，i nv i v oにおける大亘抽出物と EE併用によ文献 nv i t r oのレセプる複合エストロゲン活性の増加の理由を i 1 ) Kawazoe ，S .，Naka，K . ， Hojo，Y . ， Suzuki，T .S t u d i e son ターレベルのみならず， EEの体内動態に及ぼす大豆抽出 s a f e t yi s s u e so fh e a l t hf o o d s :P a r t2Thinkingo ft h e h e a l t hf o o di n f o r m a t i o nf o rprosumersbyh e a l t hp r o f e s s i o n a l s from a v i e w p o i n to fs a f e t ys t u d i e s . Shyakai Yakugaku( Jp n .J .S o c .P h a r m . )，24 ，2 5-34( 2 0 0 5 ) 2 ) F a r m a k a l i d i s， E .， Hathcock， J .N .， Murphy， P .A .O e s t r o g巴n i c potency o fg e n i s t i n and d a i d z i ni nm i c e . Fd Chem.T o x i c .，23，7 4 1ー 745( 1 9 8 5 ) . 3 ) 清水俊雄編著.改訂増補版機能性食品素材便覧.東京，薬事日報社， 2006，p .3 7 5 3 7 8 .(ISBN4 8 4 0 8 0 9 2 5 9 ) ，物の影響という視点から考察してみる. Kishidaら24) は大豆イソフラボンを含む飼料 (0~300 mgjkg飼料)を 4 週間雄および雌ラットに与えた実験で，肝薬物代謝酵素のチトクローム P450のアイソザイムの mRNA量を調べたところ，影響がなかったことから，イソフラボンは転写段階の調節または転写後の mRNA安定化によるチトクローム P450の誘導を引き起こさないと考察している. しかし，窪田ら 25) は，大豆イソフラボン類(イソフラボン類を 20%を含む大豆抽出物)を餌に 1%添加し，それを雄ラットに 4週間摂取させたところ肝重量の増加を認め，別の研究でイチョウ葉エキスが肝重量を増加し肝薬物代謝酵素を誘導したこと 26) も考え合わせ，大豆イソフラボン類によっても肝薬物代謝酵素の誘導と併用する医薬品の代謝の変化が起きる可能性を推察している.なお，ラットは . 6 5gjkgjdayを摂取しており，イソフラ大豆抽出物約 0 ボンの摂取は約 130mgjkgjdayと算出され，雄ラットに 300mgjkg飼料を与えた前述の Kishidaらの実験より約 8倍多いと推定される. そこで，結果には示していないが，今回の実験において，コントロールに対する大豆抽出物の単独あるいは EE との併用による肝重量の変化を同時に調べてみた. しかし肝重量の増加は認められなかった.よって，肝薬物代謝酵素の誘導を肝重量のみを指標とした場合，大立抽出物は EEの代謝に影響を与えていないと推測されるが，窪田らの実験と比較すると，今回の実験はイソフラボンの投与量が少なく期間が短いこともあり，長期大量投与の場合はどうなのか興味がもたれる. 今回の DSに使用される大豆抽出物とピルの成分 EEの複合エス卜ロゲン活性について，安全性の観点から考察する.実験に用いた大豆抽出物は，市販の DSのイソフラボンのヒ卜の 1日摂取目安量 50mgに相当する量の総イソフラボンを含むように調製し，マウスに経口投与した.また実験には EEの経口投与量として l μ gjkgを用いた. これはヒ卜の体重(女性)で換算すると 50μ gj50kgとなり，ピル 1日 l錠の服用において含まれる EE30~40 μg，( 4 0 μ gj50kg=0.8μ g j k g ) 2 7 )に近い用量である.大豆抽出物と EEの併用による複合エストロゲン活性は大豆抽出物の濃度増加に伴って増加するという結果に加えて， DSが過剰摂取や長期摂取される可能性があることを考えると，大豆イソフラボンの DSと EEを含むピルの併用はエストロゲン活性を増強するという観点から注意を要すると思われる. 謝辞本研究を行うにあたり，実験にご協力いただいた川合美 4 ) Smolinske，S .C .D i e t a r ysupplement-drugi n t e r a c t i o n s . JAMWA， 54，1 9ト 192，195( 19 9 9 ) . .，Shimamura，Y .，H irokado，M.，Yasuda，K . ， 5 ) Kikuchi，Y N i s h i j i m a，M. Q u a n t i t a t i v巴 a n a l y s i so fd a i d z i n，d a i d z e i n，g e n i s t i nandg e n i s t e i ni nv a r i o u sf o o d sbyHPLC. ShokuhinE i s e i g a k uZ a s s h i( J .FoodH yg.S o c .J a p a n )， 40，444-454( 1 9 9 9 ) . 6 ) Kanno，， . J Onyon，， . L Haseman，J .，Fenn巴r C r i s p，P .， Ashby，J .，Owens，W.TheOECDprogramt ov a l i d a t e t h er a tu t e r o t r o p h i cb i o a s s a yt os c r e e ncompoundsf o r i nv i v oestrog巴n i cr e s p o n s e s :phase1 .E n v i r o n .H巴a l t h P e r s p e c ， . t 109，785-794( 2 0 0 1 ) 7 ) Ecavade，A .，Rao，A .R .Modulatoryi n f i u e n c eo fo r a l c o n t r a c e p t i v e s on mammary growth p a t t e r n o f normal and o v a r i e c t o m i s e dm i c e .C o n t r a c e p t i o n，50， 175-183( 1 9 9 4 ) . .，vand e rV i e s，J .O e s t r o g e n i ca c t i v i t yo f 8 ) d e rV i s s e r，J o e s t r a d i o l d e c a n o a t ea f t e ro r a la d m i n i s t r a t i o nt or o d e n t s .ActaEndoc ， . r 85，422-428( 1 9 7 7 ) . 9 ) Thigpen，J .E .，L i .L .A .，R i c h t e r，C .， . B Lebetkin，E .H .， Jameson，C .W.Themous 巴 b i o a s s a yf o rt h ed e t e c t i o n o fe s t r o g e n i ca c t i v i t yi nr o d e n td i e t s :1 .A s t a n d a r d i z e d method f o rc o n d u c t i n gt h e mouse b i o a s s a y .L a b . Anim.S c i .，37，596-601( 1 9 8 7 ) 1 0 ) Nishikawa，， . JS a i t o， K . ， Goto， J .， Dakeyama， F .， Matsuo， M.，N i s h i h a r a，T .News c r e e n i n gmethodsf o rchemi c a l swithhormonala c t i v i t i e su s i n gi n t e r a c t i o no fn u c l e a r hormone r e c e p t o r with c o a c t i v a t o r . Toxco. l App. lPharmaco ， . l 154 ，7 6 8 3( 1 9 9 9 ) .，S h i r a i s h i，H .，Nishikawa，， . JN i s h i h a r a，T .， 1 1 ) S h i r a i s h i，F M o r i t a， M. Development o fs i m p l eo p e r a t i o n a le s t r o g e n i c i t ya s s a ysystemu s i n gt h ey e a s tt w o h y b r i d s y s t 巴m .J .Env.Chem.，1 0，57-64( 2 0 0 0 ) . 1 2 ) Miyahara，M . ， I s h i b a s h i，H .，Inudo，M.，N i s h i j i m a，H .， I g u c h i， T .， G u i l l e t t e， J r .， L .J .， Arizono， K .E s t r o g e n i ca c t i v i t yo fad i e tt oe s t r o g e nr e c e p t o r sαandsi nane x penm巴n t a lanimal .J .H e a l t hSc ， . i49， 481-491( 2 0 0 3 ) . .C ancer，s t e r o i dhormone，andn u c l e a rr e c e p 1 3 ) Ogata，E .M o l e c u l a rM e d i c i n e，37，1 108-1111( 2 0 0 0 t or June2010 大豆抽出物とエチニルエストラジオールの複合エストロゲン活性 1 6 ) A d l e r c r e u t z， H .， Honjo，H . ， H i g a s h i， A .， F o t s i s，T .， Hamalainen，E .，Hasegawa，T .，Okada，H .U r i n a r ye x c r e t i o no fl i g n a n sandi s o f i a v o n o i dp h y t o e s t r o g e n si nJ a p a n e s emenandwomenconsumingat r a d i t i o n a lJ a p a n e s ed i et .Am.].C l i n .Nut ， . r 54 ，1093-1100( 19 9 1 ) . 1 7 ) Yamamoto，S .，Sobue，T .，Kobayashi，M . ，S a s a k i，S .，Tsu ー gane，S . ;JapanP u b l i cH e a l t hC e n t e r B a s e dP r o s p e c t i v 巴 StudyonCancerC a r d i o v a s c u l a rD i s e a s e sG r o u p .Soy， i s o f i a v o n e s，and b r e a s tc a n c e rr i s ki nJ a p a n .] .Natl . CancerI n s ， . t 95 ，9 06-913( 2 0 0 3 ) . 1 8 ) I s h i m i，Y . ， Takano ，F .，Yamauchi，J . . Taku ，K . ， Umeg a k i，K . ， Hosokawa ，Y .，Watanabe，S . Studyonf o o d l a b e l i n g and t h ec o n t e n to f soybean i s o f i a v o n e si n h e a l t hf o o d s .EiyogakuZ a s s h i( Jp n .J .Nut r .D i et . ) ， 6 7， 49-57( 2 0 0 9 ) . 1 9 ) Schmidt，S .，Degen，G .H .，S e i b e ， lJ . .H巴r t r a m p f ，T .，V o l l mer，G .，D i e l，P .Hormonala c t i v i t yo fc o m b i n a t i o n so f g e n i s t e i n，b i s p h e n o lA and1 7 β e s t r a d i o li nt h ef e m a l e W i s t a rr at .A r c h .Toxico ， . l 80 ，8 39-845( 2 0 0 6 ) . 2 0 ) Kuiper，G .G .] .M.，C a r l s s o n，B .，Grandien，K . ， Enmark ， E .，Haggblad，， . ]N i l s s o n，S .，G u s t a f s s o n，J . A .Comparison o ft h el i g a n db i n d i n gs p e c i f i c i t y and t r a n s c r i p t t i s s u ed i s t r i b u t i o no fe s t r o g e nr e c e p t o r sαandβ .Endoc r i n o l o g y，138 ，8 63-870( 1 9 9 7 ) . 2 1 ) Kuiper ，G .G .] .M.，Lemmen，] .G .，C a r l s s o n，B .，Corton， J .C .，S a f e，S .H .，vand e rSaag，P .T .，vand e rBurg，B .， G u s t a f s s o n，J . A .I n t e r a c t i o no fe s t r o g e n i cc h e m i c a l s andp h y t o e s t r o g e n swithe s t r o g e nr e c e p t o rβ .E n d o c r i nology，139，4252-4263( 19 9 8 ) 2 2 ) Kang，J .S .，Lee，B .J .，Ahn，B .，Kim，D .J . .Nam，S .Y . ， 2 3 ) 2 4 ) 2 5 ) 2 6 ) 2 7 ) 109 Yun，Y .W.，Nam，K.T .，Choi，M.，Kim，H .S .，Jang，D .D .， Lee，Y.S .，Yang，K.H .E x p r e s s i o no fe s t r o g e nr e c e p t o r αandsi nt h eu t e r u sand vaginao fimmature r a t s t r e a t e dwith1 7e t h i n y le s t r a d i ol .] .Ve t .M ed.S c i .，65， 1293-1297( 2 0 0 3 ) . D i el . P .， Smolnikar， K . ， S c h u l z， T .， LaudenbachLeschowski，U .，Michna，H . ， V ollmer，G .P h y t o e s t r o g巴n sand c a r c i n o g e n e s i s d i f f e r e n t i a le 百e c t so fg e n i s t 巴i ni ne x p e r i m e n t a lmodelso fnormalandmalignant r a tendometrium.Hum.R e p r o d .，1 6，997-1006( 2 0 0 1 ) . K i s h i d a，T .，Nagamoto，M.，Ohtsu，Y . ， Watakabe ，M . ， Oh shima，D .，N a s h i k i，K . ， M izushige，T .，Izumi，T .，Obata， A . ， E b i h a r a，K.Lacko fani n d u c i b l ee 妊e c to fd i e t a r y s o yi s o f i a v o n e sont h emRNAabundanceo fh e p a t i cc y tochrome P 4 5 0 isozymes i nr a t s .B i o s c i .B i o t e c h n ol . B i o c h e m .，68，508-515( 2 0 0 4 ) . Kubota，Y .，Umegaki，K . ， Tanaka ，N .，Mizuno，H .，Nakamura，K . ， Kunitomo ，M. ，S hinozuka，K.E f f e c to fv a r i ousd i e t a r ysupplementsont h ec a r d i o v a s c u l a rf u n c t i o n so fr a t s . Nippon Shokuhin Kagaku G a k k a i s h i ( Jp n .] .FoodC h e m . )，8，1 4 9ー 154( 2 0 0 1 ) . Umegaki，K . ，Y oshimura，M.，Higuch . iM.，E s a s h i .T .，S h i n o z u k a .K.I n f i u e n c eo fGinkgob i l o b ae x t r a c tf e e d i n g onb l o o dp r e s s u r e，h e a r tr a t e，b l o o dg l u c o s e，andv a r i oush e p a t i cp a r a m e t e r si ns p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v巴 r a t s . Shokuhin E i s e i g a k uZ a s s h i( J . Food H yg. Soc J a p a n . )，3，171-177( 2 0 0 0 ) . 低用量ピル ( OC)医師向け情報提供資料服用者向け情報提供資料.東京，薬事日報社， 1 999，p .3 5 .(ISBN4 8 4 0 8 0 5 8 1 4 ) マルチプレックス PCR法による遺伝子組換えトウモロコダイエタリーサプリメン卜に使用される大豆抽出物とエチシ DAS-59122-7，MIR604 ，MON863，MON88017系統のニルエストラジオールの複合エストロゲン活性(報文) 一斉定性分析法の開発(報文・英文) 川添禎浩中那賀和奈石橋弘志小原智未小口太一大西真理真野潤ー穐山浩手島玲子布藤聡古井聡橘田和美* 有薗幸司橋本香織北篠康司鈴木隆食衛誌 5 1 ( 3 )，92~100 ( 2 0 1 0 ) 食衛誌 5 1 ( 3 )，101~109 ( 2 0 1 0 ) 食品衛生法に基づく厚生労働省による安全性審査において，食品としての利用が承認されている遺伝子組換えダイエタリーサプリメントに使用される大豆抽出物とピ (GM) トウモロコシ 4系統 (DAS-59122-7，MIR604， E E )の複合エストロ MON88017および MON863系統)を分析対象とした新ルの成分エチニルエストラジオール ( 規定性マルチプレックス PCR法を開発した.室内試験にゲン活性を検討した.大豆抽出物(総イソフラボン 0 . 8 3 よる本分析法の検出限界を非組換えトウモロコシ由来 DNA及び GM トウモロコシ由来 DNAを混合した試料を mgを含む 0.0036gjkg，総イソフラボン 83mgを含む用いて評価したところ， MON863，MIR604，MON8801 7 0 1 0 μgjkg)を併用で卵巣摘出マウスに . 3 6gjkg) と EE( の 3系統に関しては 0.16%，DAS-59122-7系統に関しては 0.078%であった.我々は既に GM トウモロコシ 8系統 4日間経口投与したところ，相対子宮重量は有意に増加 ( Bt 11 ，Even t 176，GA21，恥lON810，MON863，NK603，し，大豆抽出物 ( 0 . 3 6gjkg)と EE( 1 0 μ gjkg)の併用は T25，TC1507)を分析対象とする定性マルチプレックス PCR分析法を開発しており，今回開発した方法と組み合 EE( 10 μ gjkg)単独より有意に増加した.大豆抽出物はヒわせることで，現在，商業利用が予想される GM トウモトエストロゲンレセプター αおよび sに夫すしてエストロロコシの主要 1 1系統すべてを対象とした定性検知をすることが可能となる. また，今後流通量の増加が予想されるゲン活性を有し， EEの併用によって活性の増加が認めらスタック品種に対する検査法としての利用も期待される. れた. *独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構食品総 *京都府立大学食保健学科合研究所リアルタイム PCR法によるスケトウダラ卵加工品中のマスケトウダラ卵加工品 64検体からは使用表示どおりにそ固相抽出エキシマー蛍光誘導体化 HPLC法による食品中不揮発性アミン類の分析(報文) 坂本智徳*赤木浩一樋脇弘 1 ( 3 )，115~121 ( 2 0 1 0 ) 食衛誌 5 固相抽出およびエキシマー誘導体化を用いた食品中不揮発性アミン類(プトレシン，カダペリン，ヒスタミン，チラミンおよびスペルミジン)の分析法を検討した.固体試料は 3%トリクロロ酢酸を用いて，液体試料は水を用いて抽出した.抽出液をポリマ一系強カチオン交換ミニカラム . 8 )および水でに負荷し， 25mmoljLリン酸緩衝液 (pH6 00mmoljL炭酸カリウム溶液で溶出した. 洗浄したのち 1 溶出液を 6mmoljL1 -ピレンブチリルクロリド溶液と混合し誘導体化した.不揮発性アミン類誘導体を LC-FLD で測定し，確認試験は誘導体化せずに LC-MSjMSで測定した. 検出限界 (SjNミ3 )は 0 . 0 4 μ gjg，定量限界 (SjN孟 1 0 )は 0 . 1μgjgであった.魚肉，味噌，醤油および赤ワれぞれの種が検出された. インでの回収率は 80 .4 ~111% であった. ダラおよびカラフ卜シシャモの検出(報文) 鶴田小百合*坂本智徳赤木浩一樋脇弘食衛誌 5 1 ( 3 )，110~114 ( 2 0 1 0 ) スケトウダラ卵加工品中のマダラ卵およびカラフトシシャモ卵を検出するリアルタイム PCR法を開発した.スケトウダラ，マダラおよびカラフトシシャモに特異的なプライマーと TaqManMGBプローブを cytochromeb領域において設計した.本法は，他種との交差反応は認められず，検出下限が DNA濃度 0 . 0 0 2n g ! . μ Lであり，検量 2 線の r .000であった. また，本法を用いた試験では，は1 スケトウダラ卵に 0.1%の割合で添加したマダラ卵またはカラフトシシャモ卵を検出することが可能であり，市販の *福岡市保健環境研究所 *福岡市保健環境研究所母子の原中 1-Hydroxypyreneから見た小児の化学物質曝露と食事との関連(ノート) メタミドホスおよびオメ卜エー卜の分析(報文) 鈴木慧*溝井美穂安達修一上野英二*大野春香棚橋高志大島晴美森拓哉吉永淳河原純子三上栄一根本了松田りえ子食衛誌 5 1 ( 3 )，128~132 ( 2 0 1 0 ) 食衛誌 5 1 ( 3 )，122~127 ( 2 0 1 0 ) 小児における多環芳香族炭化水素 ( p o l y c y c l i ca r o m a t i c 畜水産物およびはちみつ中のアセフェート，メタミドホ hydrocarbon:PAH)曝露状況を， PAHの代謝物である尿スおよびオメトエートを定量するための同時分析法を検討中の 1 -hydroxypyrene( 1 0 H P )を指標として調査し，食 2種類の試料事との関連性を解析した . 尿中 1-0HP濃度 [μmolj した.牛筋肉，豚ギョーザ，はちみつなど 1 (5~10 g )から，無水硫酸ナトリウムで脱水しながら酢酸 m ，平均が小児 0 . 0 8 3，母親 0 . 0 4 6となり，小児 o l c r e ]はの曝露量は母親の約1. 8 倍であることが確認されるとともエチルで抽出し， GPCおよび PSAカラムクロマトグラフィーにより脱脂・精製したのち，カラムスイッチング付に，母子聞で有意な正の相関が見られた.尿採取前日の食事内容では，肉・魚摂取量と尿中 1-0HP濃度は正の関連き ESI-SIMモード LC-MSで測定した.回収率 ( 2併行× が認められ，調理方法では高温調理により強い関連が認め 5 日)は，はちみつを除いて 7 1.4~98.4% (併行精度三五られた.食事メニューを母子聞の一致性にて解析した結 12.5%，室内精度孟 14.1%) と良好であった.なお，はち果，一致性が高い群ほど，母子聞の尿中 1-0HP濃度に高みつに高純度のサロゲート物質を用いる内標準法を適用しい相関が認められ，曝露要因として食事の寄与が大きいこたところ，回収率が 97.6~98.6% と大きく改善された. とが示唆された. *愛知県衛生研究所 *相模女子大学大学院公衆衛生学研究室 LC-MSによる畜水産物およびはちみつ中アセフェート，