本日の講演細胞や食品の冷凍・凍結挙動とその制御物質について 1．細胞における冷凍時の挙動について２．食品における冷凍時の損傷にいて２．食品における冷凍時の損傷について関西大学化学生命化学生命工学部学部生命・生物工学科河原秀久３．氷結晶制御物質とは結制御物質４．不凍タンパク質とその機能細胞における冷凍損傷について完全な細胞細胞内凍結細胞外凍結急速冷凍超高速冷凍細胞における冷凍時の挙動について Microcrystal of intracellular ice 緩慢凍結 Deadly damage Packing effects Solution effects 膜のダメージ細胞外に氷形成 Salt effects or 最小ボリューム緩慢解凍細胞の形質転換高生存率・・・・・酵素の失活再結晶化現象損傷；凍結温度で相違 Fujikawa S.: Trans of the JAR,14,11-25 (1987) 細胞保存方法ポリリジンコハク酸誘導体を用いたガラス化法によるiPS細胞の冷凍保存スロークーリング法；卵細胞の中にある水分を脱水することが必要になり、凍結する前の胚をアルコールなどを含んだ凍結保護剤に浸します。この際いきなり高濃度の保護剤に浸けるのではなく少しずつ濃度を上げていきます。げ凍結保剤凍結保護剤に浸された胚は細いストローに移された後、プログラムフリーザーで、ゆっくりと凍細後プグザ凍結します。凍結胚は液体窒素を満たしたタンク内で長期にわたる保存が可能です。解凍する場合は、ストローを取り出して暖め、凍結したときの逆のステップで培養液に戻します。良好な胚を凍結解凍した場合７５－８０％の胚が生存し、生存胚あたりの妊娠率は新鮮胚と同様です。ガラス化法；近年、プログラムフリーザーを用いない新たな凍結方法としてVitrification法（ガラス化法）が開発され、現在はスロークーリング法に代わって凍結法の主流になっている。ガラス化法では細胞内に氷を作らないように高濃度の溶液に浸し、一気に凍結します。この方法の利点は今まで凍結が困難であった胚盤胞や未受精卵の凍結が可能になった。玄丞烋再生医科学研究所准教授ら京都大学ホームページ； http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/news_data/h/h1/news6/2010/101201_3.htm 食品の低温保存および解凍方法低温保存の対象となる食品の分類そのままでは冷凍保存できない。生鮮食品植物性食品; 農産物(野菜類, 果実類）ブランチング（軽く加熱する)。ok 果実はシ果実はシロップ付け。プ付け食品における冷凍時の損傷について脱凍結脱水凍結動物性食品; 水産物(魚介類）畜産物(食肉類, 食鳥類, 乳, 卵) 短期は冷蔵。長期は-18℃以下の好ましい魚介類の一部は凍結保存できないものもある。加工食品植物性加工食品動物性加工食品複合調理加工食品目的とする貯蔵期間によって貯蔵温度を設定する。凍結食品の解凍原料形態の凍結食品；原料形態凍結食品；半解凍すなわち中半解凍すなわち中心温度が-5℃で表面はできるだけ0℃ 温度表面きるけ調理冷凍食品；食用可能な状態まで昇温させる。水の凍結曲線と氷成長速度冷凍保存中の食品の物理的変化「凍結焼け」凍焼」 1.. 食品の乾燥 2. すき間氷水氷低温すき間におびただしい氷水分が包装材の内面に移動 3. 氷結晶の成長融解「油焼け」焼」高温氷の再結晶化低温高温低温凝固凝固昇華昇華凝縮水蒸気時間経過に 0分凍結率と濃縮率凍結率は結合水を除いた凍結しうる水の割りあい AFP -20℃で90％（凍結直後) -20 ℃で93％（凍結貯蔵時） 50μg/ml 食品冷凍の化学的問題タンパク質の変化；タンパク質は食品の骨格タンパク質は食品の骨格、高い水和性により食品固有の口ざわり、歯ごたえなど。変性により、生肉では軟化、スポンジ化が起こり、ドリップ。脂肪の変化；脂肪の変化魚や畜肉の冷凍では、異臭発生や油焼けと呼ばれる脂質の変化。品質劣化 10分 30分食品冷凍の栄養学的問題タンパク質；タンパク質の一部は保水性を失い、変性する。起こしやすい例；タラ起こしにくい例；タコ、イカ糖質; 単糖や二糖類は問題ない。デンプンの老化が進む。糖質の変化；加熱調理済の冷凍食品にとって、デンプンの老化。急速な冷凍処理。脂質；脂質の一部リパーゼの作用で加水分解し、遊離脂肪酸が増加、酸化しやすくなる。色素の変化；ヘム色素（カツオやマグロの赤色）ミオグロビン変色カロチノイド類退色は酸化クロロフィルル緑色冷凍保存が高いポリフェノール類アントシアニンアルカリ条件下で退色栄養素の変化；冷凍時には変化がない。解凍時のドリップに流出してしまう。ビタミン類；ブランチング処理により水溶性ビタミン(VC)の溶出と加熱酸化凍結保存中の酸化による変化酸解凍時におけるドリップへの溶出、加熱による溶出と酸化ミネラル；ブランチング処理により一部（カリウム、ナトリウム）が損失ブランチング処理により部（カリウムナトリウム）が損失高温冷凍食品の買い求めから持ち帰りまでのポイント -18℃以下のもの; ショウケースの温度計を確認する。ロードライン以下のもの; ロドライン以下のもの; ロロードライン以上に積み上げられたものは品質劣化ドライン以上に積み上げられたものは品質劣化しているかも。ガッチリと凍っているもの乾燥がすすん乾燥がすすんでいないものなも包装のしっかりしているもの包装内側に霜少なも包装の内側に霜の少ないもの昇華が起きて氷形成している。割れたり、固まりになったりしていないものきっちりと表示しているもの; 名称・原材料名・内容量・賞味期限・保存方法・製造者名など氷結晶制御物質とは認定証マークのついているもの持ち帰り; 溶けないように工夫する。例えば、最後に買う。ドライアイスの利用や断熱性のある容器に入れる直接に日光をあてないバックの中央に入れる。包装紙などで二重、三重に厚く包む。家では;; -18℃以下に保てるフリーザーに入れる（2～3ヶ月が目安）家以下保るリザ入れる（ヶ月目安）生物の耐凍戦略氷形成に関わる化合物地球上の生物圏の80％近くが低温環境下に晒される普遍的水過冷却促進氷核タンパク質タンパク質・多糖促進氷核人間-暖かいねぐら、厚着異物鳥-越冬移動不凍哺乳類体毛を増加冬眠哺乳類-体毛を増加、冬眠昆虫-土中に潜る昆虫土中に潜る冬眠糖・糖アルコール蓄積氷結晶制御物質阻害両性類土中に潜る冬眠両性類-土中に潜る糖・糖アルコール蓄積微小なタンパク質阻害成長阻害形態変化再結晶化抑制凍結保護タンパク質・多糖植物-タンパク質、糖・糖アルコール蓄積、氷結晶制御物質微生物-タンパク質・糖アルコール蓄積、氷結晶制御物質氷未凍結状態細胞内外氷細胞内タンパク質変性阻害阻害昇華細胞内タンパク質未変性氷結晶制御物質の過冷却曲線 A B C C l Cool Heat melting li melting li Time 0℃ 熱ヒステレシス (℃) 抗氷核活性 (℃) freezing 不凍タンパク質とその機能 TH ANA A : AgI + 過冷却促進物質溶液 B : AgI + Distilled water (1 atomospheric pressure) C : AgI + 不凍タンパク質溶液不凍タンパク質とは魚由来不凍タンパク質(AFP)と不凍糖タ不凍糖タンパク質(AFGP) ク質( ) 南極ノトセニア不凍糖タンパク質発見。 20 mg/mlタンパク質で、-1.9℃凍結点タパク質 ℃凍結点 Characteristic AFGP TypeⅠAFP T peⅠAFPTypeⅡA T peⅡA TypeⅢAFP T peⅢAFPTypeⅣA T peⅣA FP FP 12000 2600-33000 3300-4500 11000-24000 6500 Mass (Da) AAT repeat Pleugramma antarcticum Comp. Biochem. Physiol. B., 76, 545-548 (1983) Comp Biochem. Comp. Biochem Physiol. Physiol C, C 111, 111 121-129 121 129 (1995) 存在する生物種魚類、植物、甲虫の幼虫、昆虫、キノコ、カビ、地衣類、酵母、細菌など海水温度の凍結点より体液の凍結温度を低下させる不凍糖タンパク質（Antifreeze glycoprotein) Key Properties Disaccharide Alanine-rich α-helix Disulfide bonded Representat ive AntarcticStructure Natural Source nototheniods Right-eyed, flouders Sea raven, Smelt, herringg β-sandwich β sandwich Ocean pout, Wolfish, eel ppout Alanine rich herical bundle Longhorn, sculpin p 昆虫の幼虫由来熱ヒステレシスタンパク質植物由来不凍タンパク質の存在と構造存在が明らかにされている植物アブラナ科イネ科ガーリックマスタードフユガラシ菜の花芽キャベツ・キャベツ芽キャツキャツオオバコ科ブナ科ハラオオバコオニオオバコセリ科ズルカマラジャガイモユリ科キク科ヤナギ科 Tenebrio molitor (②) Thecodiplosis japonensis ヤブカンゾウマツバノタマバエコントンウッドントンウッドシオン属セイヨウタンポポ幼虫ゴミムシダマシ Cucujus clavipes Oncopeltus fasciatus ヒラタムシナガカメムシ幼虫キチナーゼタイプ β-1,3-グルカナーゼタイプ β 1 3 グルカナーゼタイプソーマチン様タンパク質タイプキョウチクトウ科ヒメツルニチニチソウスミレ科起源タイプ分子量 Mealworm (②) 8.7 Th + Cys Thr C rich i h Th + Cys Thr C rich i h 12 or 13 AA 繰り返し 12 AA 繰り返し β-シート？相同タンパク質 Trypsin inhibitor ? Lipoglycoprotein Marinomonas Antarctic saline lake Protein 他の機能 164,000 INA 60,000 RIA Primoryensis* 局在 Flavobacterium Antarctic soil Antarctic soil Lipoprotein Protein 80,000 52,000 60,000 RIA xanthum Colwellia spp **. Antarctic sea Protein * ; Garnham CP et al, Bichem J., 411, 171-180 (2008). ** ; Raymond JA et al, FEMS Microbiol. Ecol., 61, 214-221 (2007). 赤字は、関西大学微生物工学研究室で研究開発したもの。 26,000 , Trypsin inhibitor ? 10 外内 Aタイプ cooling Protein β-シート + コイル Trypsin inhibitor ? 熱ヒステレシス値(TH ℃) RIA 外外 1℃/ min 熱ヒステレシス値（℃) 5 Teemperature (℃ ℃) Arctic rhizosphere 9.0 S +C Ser Cys rich i h β-シート？水 Pseudomonas putida Spruce budworm (③) 8.4 二次構造氷結晶の形態変化 Moraxella sp. Rhagium inquisitor ハナカマキリ幼虫不凍タンパク質の３つの基本活性細菌由来の不凍タンパク質 fluorescens ビロウドムシ一次構造次構造ポリガラクチポリガラクチュロナーゼインヒビタータイプナゼインタタイプ Antarctic soil 幼虫 Dendroides canadensis (①) 幼虫分子量(kDa) （活性化因子）スミレ Pseudomonas Choristoneura fumiferana (③) トウヒシントメハマキガ Fire beetle (①）なっているタイプナデシコ科種幼虫構造として明らかにレンギョウハコベナス科ハツユキソウケシ科コマクサ属モクセイ科ホワイトオークホワイトオクトウダイグサ科ニンジンカラス麦冬ライ麦四条大麦条大麦冬小麦スズメノカタビラライ小麦ナガハグサホソムギコスズメノチャヒキ融解温度－凍結温度 (℃) 0 -5 10μm径の氷結晶 ; 蒸留水 ; 不凍タンパク質 Bタイプ溶液 -10 10 内 0 5 10 15 Time (min) 外氷の再結晶化抑制 ‐6℃で維持 0 min buffer 0 min 30 min AFP 溶液 30 min 幼虫不凍タンパク質の氷結晶への結合状態不凍タンパク質の名称と関連物質 c 軸 c-軸氷への結合不凍タンパク質不凍タンパク質水が凍らないというイメージになる基盤面形態変化 a-軸軸 -9℃まで溶液中の氷結晶が成長しない -9℃まで、溶液中の氷結晶が成長しない。凍結温度低下氷形態を変化させる能力 Ice structuring protein 再結晶化抑制熱ヒステレシスが強いもの Thermal hysteresis protein 氷に結合する能力 Ice active protein 再結晶化活性み能力再結晶化活性のみの能力 Ice recrystallization-inhibiting protei (不凍タンパク質ではない？） a-軸不凍タンパク質の機能とその応用冷凍技術の現状生産ラインなど AFPによる最大熱ヒステレシス値；9℃ 水分子の氷結晶への結合阻止の結合阻止プリズム面 a-軸不凍タンパク質 Antifreeze 不凍タンパク質； A tif protein t i (AFP) 急速冷凍機ですばやく冷凍（最大氷結晶生成帯-1～-5℃）機能冷凍保存 80℃以下冷凍保存；-80℃以下氷結晶の形態制御流通ライン店頭販売冷凍庫２０℃以上冷凍庫；-２０℃以上, -10℃以上（一般家庭）鮮肉など100％凍結していない家庭冷凍庫再結晶化発生（解凍時におきやすい）解凍後、大量のドリップ組織破壊氷結晶の再結晶化抑制凍結温度の低下期待できる応用ドリップの減少、冷菓の食感、細胞・食品などの冷凍保存食材・冷凍食品の高品質保存細胞の長期保存霜発生阻害効果細胞などのチルド状態での保存低温下での膜の安定化食品などのチルド状態での保存北米地域で販売されている不凍タンパク質入りアイスクリーム不凍タンパク質の市場性の予測（北米地域）潜在的年収入全市場（百万ドル）遺伝子導入発現魚 400 大豆植物 500 コーヒー 2,000 （百万ドル） 20 30～50 100 フルーツ 200 10 柑橘類 360 18 細胞・組織・臓器の低温、凍結保存 4,000 150～200 血小板凍結保存 1 000 1,000 75～100 凍結外科手術アイスクリーム 30,000 サケの成長 2,500 ユニリーバ魚由来タイプIII不凍タンパク質の遺伝子を酵母に導入し、発現させて得られた組み換えタンパク質をアイスクリームに添加 50 植物油脂を半減し、氷再結晶化を添加した不凍タンパク質制御しパク質で制御している。る 90～100 125 GL. Fletcher et al., CHEMTECH, 29,17 (1999). 冬野菜に存在する不凍タンパク質不凍タンパク質の応用の可能性青色以外に存在するアブラナ科白菜大根ブロッコリーキャベツ小松菜チンゲン菜シロナ蕪キク科セリ科ユリ科リ科アカザ科改善ハス科春菊ニンジンネギほうれん草レンコンゴボウミブナ野沢菜ミズナカリフラワカリフラワー大根葉・カイワレエキスの使用方法根葉使法食品品質における不凍タンパク質の応用性の展開フリーズドライ食品の品質改善；使用が期待させれる商品凍み込ませた後、FD 澱粉製品、餃子、中華まん、フリーズドライ用食品、かまぼこ、中華ポテト、魚卵（数の子）、釜揚げチリメンジャコ、ハム、和菓子（餅、団子類、餡）、漬物、野菜、豆乳、湯葉、にこごり、ゆで卵、パン、アイスクリム、じゃがいも、野菜、豆乳、湯葉、にこごり、ゆで卵、パン、アイスクリーム、じゃがいも、柚子皮、大根、液体調味料、生麩、米飯、豆腐、ゼリー、ソーセージ、アボガド、畜肉食品、ドレッシング、寒天、血液、血清、血小版などキュウリ＋AFP 鮮肉・鮮魚の品質改善 -AFP 2μg/ml溶液浸漬方法インジェクション法浸漬方法、インジェクション法家畜の場合、屠殺前に静脈注射大根葉エキス 1 mgで2.5kgの仕込み量ムチムチ感加工肉製品の場合うどんの場合 100 mg/kg 冷凍パン生地、冷凍麺、冷凍ご飯の品質改善大根葉エキス 100 mgで肉1kg 冷凍パン生地水分量増加できるできあがり軟らかくなる AFPによってはデンプン老化抑制あり鶏肉の場合ドリップ量58％に冷凍解凍後、軟らかい冷凍すし飯に対するカイワレ大根エキスの効果米 450 g 水 540 g 水 540 g エキスキス 600μg 大豆オリゴ糖 (a) 根菜 13.5 g すし酢溶液エキス 600μg すし飯すし酢溶液 Protein (μg P g/g) 炊く 10％トレハロースすし飯エキストレハロース、大豆オリゴ糖一粒、一粒が粒同士が分かれている接着している -20℃、3ヶ月間保存 (b) 葉 50 0 .2 0 40 0 .1 5 30 0 .1 0 20 0 .0 5 10 0 0 .0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 .2 0 30 Protein (μg/g) 450 g Thermal hysteeresis (℃) 米大根の葉および根菜の低温馴化によるAFPの生産 8 Cold acclimation time (week) ●; タンパク質 ○; 熱ヒステレシス 0 .1 5 20 0 .1 0 10 0 0 .0 5 0 1 2 3 4 5 C ld acclimation Cold li i time i (week) ( k) 6 0 .0 0 Therm mal hystereesis (℃) 養殖魚の場合、？冬ライ麦由来不凍タンパク質抗体を用いたウエスタンブロッティングウスタンブッティング (a) TH (℃) (c) グルカナーゼ (b) キチナーゼ MW MW 94,000 67,000 104,000 80,000 43,000 , 46,900 30,000 33,500 20,100 14,400 各タパク質抽出物不凍活性各タンパク質抽出物の不凍活性 MW 0.15 67 ｋD glucanase 104,000 80,000 0.14 42 ｋD glucanase 0.14 36 ｋD chitinase 0.13 30 ｋD glucanase or chitinase 0.14 27 ｋD unknown 46,900 28,300 33,500 28,300 19,800 19,800 SDS-PAGE - + 複数の不凍タンパク質をアポプラスト画分に蓄積しているこれからの研究展開不凍タンパク質；氷再結晶化抑制能のみ持ったタンパク質を発見。同じ機能を持った多糖を検索し、すでに発見。構造解析中。植物不凍タンパク質‘クリスタ・キープ’としてカネカより販売開始抗氷核活性物質(過冷却促進物質）；過冷却水を形成するのに最適。過冷却水を形成するのに最適ご清聴どうもありがとうございました。食品成分（日本酒・餡粕など）からの物質生産高冷凍耐性水分保持高分子ゲル；食品素材多糖による冷凍耐性ゲルの開発物産フドサインスで販売開始物産フードサイエンスで販売開始高冷凍耐性を有する天然乳化剤；食品から冷凍耐性を合わせ持った乳化剤の開発これら化合物を組み合わせて、細胞や臓器保存液の開発へ連絡先；関西大学生命・生物工学科河原秀久 ℡06 6368 0832 ℡06-6368-0832 [email protected]