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リボソームタンパク質をバイオマーカーとしたマトリッ
クス支援レーザー脱離イオン化質量分析法によるバクテ
リアの迅速同定および分類法の開発 Rapid Identification
and Classification of Bacteria Using Ribosomal Protein as
Biomarkers by Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationMass Spectrometry
寺本, 華奈江
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2008-06
http://repo.lib.nitech.ac.jp/handle/123456789/479
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Thesis or Dissertation
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リボソームタンパク質をバイオマーカーとした
マトリックス支援レーザー脱離イオン化
質量分析法によるバクテリアの
迅速同定および分類法の開発
2008 年
寺
本
華
奈
江
A Dissertation for Degree of Doctor of Engineering
at
Graduate School of Engineering
Nagoya Institute of Technology
Kanae Teramoto
2008
Rapid Identification and Classification of Bacteria
Using Ribosomal Protein as Biomarkers
by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Mass Spectrometry
Kanae Teramoto
The rapid identification of bacteria has become of importance in various fields
such as food industries, biomedical assays, and environmental analyses. At the present,
the reliable genotypic classification of bacteria has been mainly performed by DNA
sequencing methods. Meanwhile a chemotaxonomic classification based on a
biochemical fingerprint has also been attempted for a simple and rapid characterization
of bacteria. However, an identification method having both simplicity and reliability has
not been established. Furthermore, it has been thought to be difficult to perform a
detailed classification of bacteria at a strain level, which is important for specifying
function and toxicity of bacteria, even by the DNA sequencing and chemotaxonomic
methods previously proposed.
Matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) is
beginning to play an important role in rapid identification or taxonomic classification of
bacteria. Recently, a bioinformatics approach has been proposed, in addition to the
previous mass spectral fingerprint approach. This method refers observed masses in the
MALDI mass spectra to those of the biomarker proteins calculated from the amino acid
sequences registered in protein databases. In this technique, ribosomal proteins
composed of more than 50 subunit proteins thought to be good candidates as the
suitable biomarkers. However, this proposal is not beyond a theoretical concept because
most sequence information of the protein databases has not been verified.
In this dissertation, a simple, rapid, and highly reliable method for the
identification and classification of bacteria by MALDI-MS was developed. In the first
i
step of this study, ribosomal subunit proteins used as the biomarkers for identifying
bacteria at the species level were characterized in detail together with the verification of
the amino acid sequences registered in the protein databases. Furthermore, by focusing
on the variation of amino acid sequences of ribosomal proteins, a new method for
phylogenetic classification at the strain level could be successfully performed.
In Chapter 1, the current status of the bacteria characterization was briefly
described. The historical progresses and the features of mass spectrometric approaches
for bacteria characterization were then discussed. Especially, the possibilities and
limitations of the rapid identification method of bacteria using ribosomal protein as
biomarkers by MALDI-MS were pointed out.
In Chapter 2, the principle of MALDI-MS and the analytical conditions for
ribosomal proteins were described. Especially, the optimization of the sample
preparation method of ribosomal proteins by MALDI-MS was discussed in detail.
In Chapter 3, the characterization of the ribosomal proteins in genome sequenced
lactic acid bacteria (LAB) was described. The first section in Chapter 3, the expression
of ribosomal proteins was confirmed through a proteomic approach using a
genome-sequenced strain, Lactobacillus plantarum (Lb. plantarum) NCIMB 8826, as a
model sample. The observed masses of 34 proteins including 31 ribosomal subunit
proteins and 3 ribosome-associated proteins were surely matched with the calculated
masses predicted from the amino acid sequence with considering N-terminal
methionine loss as a post-translational modification. These proteins were accepted as
reliable biomarkers to identify Lb. plantarum.
In the second section in Chapter 3, to verify the actual state of the sequence
information registered in the protein databases, a simple intact protein analysis by
MALDI-MS using cell lysates as samples was applied to the characterization of
ribosomal
proteins
from
genome-sequenced
Streptococcus
thermophilus
(St.
thermophilus) and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb. bulgaricus) strains.
By comparing the MALDI mass spectra of different strains and manual inspection of
ii
sequence information, various errors attributed to N-terminal amino acid sequences
could be identified. After sequence correction, approximately 40 out of 53 subunit
proteins could be assigned, considering N-terminal methionine loss, which should be
used as practical biomarkers for the rapid identification of St. thermophilus and Lb.
bulgaricus. After verification of these amino acid sequences, mass differences relative to
those of genome-sequenced strains have proved to be clues for distinguishing bacteria at
the strain level.
In the third section in Chapter 3, ribosomal subunit proteins of eight
genome-sequenced LAB were characterized to provide a guideline for selecting reliable
biomarkers used for the rapid identification of LAB by MALDI-MS. The ribosomal
subunit proteins with molecular weight over ca. 20,000 were commonly hard to detect.
This phenomenon seemed to be due to the mass discrimination effect in MALDI-MS.
Conserved post-translational modifications other than N-terminal methionine loss were
investigated by comparing the mass differences from sequence masses calculated from
their amino acid sequences. Some errors in the amino acid sequences of the ribosomal
subunit proteins registered in the protein databases could be found by the comparison of
amino acid sequences, and corrected by inspection of gene sequences. By the elimination
of the ribosomal subunit proteins with higher molecular weight and post-translational
modifications as well as other hardly detectable ribosomal subunit proteins, 27
ribosomal subunit proteins were finally selected for the reliable biomarkers.
The latter section in Chapter 3 was the description as for the application of the
rapid identification using MALDI-MS. In the fourth section in Chapter 3, the
application of MALDI-MS method for the maintenance of bacterial culture collections
was proposed. By comparing the MALDI mass spectrum of the stored culture of
Lactococcus. lactis subsp. lactis with that of the pure cultures, the stored culture was
found to be cross-contaminated with other LAB.
In the last section in the Chapter 3, rapid identification of hiochi bacteria (a
typical spoilage microorganism for sake) was demonstrated. Because the amino acid
iii
sequences of ribosomal proteins of hiochi bacteria have not been registered, the masses
of the 15 strongest peaks of ribosomal subunit proteins isolated and purified from
representative five hiochi bacteria were listed to make a biomarker peak database.
Using this database, hiochi bacteria generated in a sake brewery could be successfully
identified as Lactobacillus paracasei subsp. paracasei or its closely-related species.
In the Chapter 4, a new method for phylogenetic classification of bacteria at the
strain level was developed. In the first section of Chapter 4, phylogenetic classification
of a total of 16 strains of Pseudomonas putida (P. putida) as model samples was
demonstrated. Although the amino acid sequences of ribosomal subunit proteins are
highly conserved, slight sequence variations can occur at the strain level, reflecting
different phylogenetic evolution rates. Such differences could be detected as mass
differences in the MALDI mass spectra. The profile of the mass differences of ribosomal
subunit proteins was processed by cluster analysis, generating a phylogenetic tree. The
classification of P. putida strains by the proposed method was highly comparable to
those based on the DNA gyrase subunit B gene sequence analysis.
In the second section of Chapter 4, psychrotrophic LAB strains potentially used for
fermentation of meat were characterized by MALDI-MS. The sample strains of
commercial starter culture and the similar 15 strains were thought to be Lactobacillus
sakei (Lb. sakei) based on their biochemical properties and 16S rRNA partial gene
sequence. All sample strains could be surely identified as Lb. sakei, and further
classified into 4 groups based on the mass differences of the 16 biomarkers selected from
ribosomal subunit proteins.
In the last chapter, the development of the bacteria characterization method by
MALDI-MS using ribosomal proteins as the biomarkers was summarized. Future
prospects of the developed method was finally discussed.
iv
目
第1章
次
序論
1
1-1
微生物識別分析の必要性
2
1-2
微生物の分類とバクテリアの分類学的な位置
3
1-3
バクテリアの分類・同定技術の現状
6
1-4
質量分析法によるバクテリアの迅速分析
1-5
リボソームタンパク質をバイオマーカーとして用いる MALDI-MS
1-6
16
によるバクテリアの迅速同定
24
本研究の目的および概要
28
文献
第2章
MALDI-MS によるリボソームタンパク質の測定条件
43
2-1
緒言
44
2-2
MALDI-MS の測定原理
44
2-3
ボソームタンパク質の分析条件の最適化
51
文献
第3章
リボソームタンパク質をバイオマーカーとした MALDI-MS による
69
バクテリアの迅速同定
3-1
ゲノム解読された乳酸菌 Lactobacillus plantarum のリボソーム
タンパク質のキャラクタリゼーション
70
3-1-1
緒言
70
3-1-2
実験
72
3-1-3
結果および考察
75
文献
3-2
複数のゲノム解読株の比較解析によるリボソームタンパク質の
アミノ酸配列の登録情報および変異の検証
88
3-2-1
緒言
88
3-2-2
実験
90
3-2-3
結果および考察
90
文献
3-3
乳酸菌ゲノム解読株のリボソームタンパク質の比較解析
114
3-3-1
緒言
114
3-3-2
実験
115
v
3-3-3
116
結果および考察
文献
3-4
MALDI-MS を用いたバクテリアの迅速識別法の菌株管理への応用
136
3-4-1
緒言
136
3-4-2
実験
136
3-4-3
結果および考察
137
文献
3-5
MALDI-MS による火落ち菌の迅速同定
142
3-5-1
緒言
142
3-5-2
実験
142
3-5-3
結果および考察
143
文献
第4章
リボソームタンパク質のアミノ酸配列の変異に基づく MALDI-MS
によるバクテリアの分子系統分類法の開発
4-1
155
環境微生物 Pseudomonas putida をモデルとしたリボソーム
タンパク質のプロファイリングによる分子系統分類の開発
156
4-1-1
緒言
156
4-1-2
実験
159
4-1-3
結果および考察
160
文献
4-2
低温増殖性乳酸菌の迅速同定および分子系統分類への応用
176
4-2-1
緒言
176
4-2-2
実験
177
4-2-3
結果および考察
177
文献
第5章
まとめ
189
5-1
まとめ
190
本論文に関わる発表論文
195
共同研究者一覧
197
謝辞
199
vi
第
1
序
章
論
-1-
1-1
微生物識別分析の必要性
我々は、多種多様な微生物に取り囲まれて生活している。その存在を人類が実際に顕微
鏡により確認したのは 17 世紀後半であるが、それよりもはるかに昔から微生物の機能は世
界中で利用されてきた[1]。現在でも、乳製品、食肉製品、および漬物などの製造には、微
生物の機能を利用した手法が受け継がれている[2]。最近では、健康志向が高まり、発酵食
品から単離した乳酸菌の優れた機能に注目した飲料や、タブレットなどが製造されている。
また、ストレプトマイシン（放線菌由来）などの抗生物質、酵素、あるいはアミノ酸など
は 、 微 生 物 を 利 用 し て 工 業 的 に 製 造 さ れ て い る [1] 。 さ ら に 、 生 分 解 性 ポ リ マ ー
(biodegradable polymer) の 生 産 お よ び 生 分 解 [3-5] や 、 バ イ オ レ メ デ ィ エ ー シ ョ ン
(bioremediation) [6, 7]など、微生物の多彩な物質資化性を利用した排水処理や化学物質分
解技術が注目されている。
一方で、食物の腐敗や感染症による疾患[8, 9]、あるいは農産物の病害[10, 11]などを引き
起こす多種多様な有害微生物の被害にも悩まされ続けている。また、安全安心がキーワー
ドとなる今日、雑菌汚染の発生はその企業にとって致命的な打撃となりかねず、微生物が
関わる衛生管理に対する意識は、世界的に高まっている[12]。
微生物は、上空数千メートルまでの大気圏、水深 1 万メートル以下の水圏、地下数千メ
ートルまでの岩石圏から、300℃を超える深海底熱水孔ですら、その存在が確認されており
[13, 14]、目に見えなくても、環境中のあらゆる場所に様々な微生物が存在しているであろ
うことは容易に想像できる。これまでに、人類が分離培養できた微生物の種類は、地球上
に存在する微生物の 1%以下に過ぎないとさえ言われており[15]、我々の想像を大きく上回
る様々な特徴を有する微生物が存在していることも期待できる。そのため、我々の生活を
微生物と完全に切り離して考えることは困難であり、どのような微生物が存在しているの
かを知りたいという欲求は自然である。微生物の特徴を活用するために、あるいは被害を
回避するために、どのような微生物が存在しているのかを正しく把握して、うまく制御す
ることが重要になる。
-2-
1-2
微生物の分類とバクテリアの分類学的な位置
微生物とは、一般に肉眼では観測できない 2 mm 以下の生物の便宜的な総称であり、細
胞内に核をもたない原核生物(prokaryotes)であるバクテリア(bacteria)およびアーキア
（archaea、古くは古細菌と呼ばれた）から、細胞内に核をもつ真核生物(eukaryotes)の中
で藻類(algae)、菌類(fungi)、プランクトン(plankton)などの原生生物(protists)が含まれ、
広義には、細胞に寄生してのみ増殖するウイルス(virus)も含まれる場合がある[1, 16]。本論
文で研究対象とした微生物は、すべて「バクテリア」であるため、以降は微生物ではなく
バクテリアという用語を主として用いて論述していくが、微生物の分類手法のほとんどは、
解析対象がバクテリアに限定されず、本研究で開発した分析手法も、少なくともアーキア
には同様に適用でき、真核生物に対しても適用できる可能性が高いことをあらかじめ断っ
ておく。
生物分類の最上階におけるバクテリアの位置付けは諸説あるが、Whittaker の五界説で
は、生物は構造上の類似性に基づき動物界、植物界、原生生物界、菌界、およびモネラ界
の 5 つの界に分けられ、バクテリアは、同じ原核生物であるアーキアと共にモネラ界に含
まれている[17]。その後、1990 年に Woese は、16S リボソームリボ核酸(ribosomal
ribonucleic acid, rRNA)遺伝子の塩基配列に基づき、全生物を真核生物、バクテリア、およ
びアーキアの 3 つのドメイン(domain)に分類する「3 ドメイン説」を提案し[18]、これが現
在主流になっている。Fig. 1-1 に、3 ドメイン説に基づく微生物の上位階層における分類と、
バクテリアの分類学的な位置を示す。いずれの分類体系でもバクテリアとは、原核生物の
特徴（細胞に核を持たない、細胞骨格を持たない、原形質流動がない、70S リボソームを持
つ、有糸分裂しない）に加え、デオキシリボ核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)の塩基配列
においてイントロンが存在せず、アセチルムラミン酸を含んだ細胞壁をもち、脂質はエス
テル型であるという点において、別の原核生物であるアーキアとは異なる生物のグループ
を指すと考えてよい[1]。
-3-
Animals
Plants
Microorganism
Eukarya
Protists
Algae
Plankton
Eukaryotes
Fungi
Organism
Bacteria
Prokaryotes
Archaea
Virus
Fig. 1-1. Classification of life base on the three-domains by Woese (1990).
バクテリアの分類は、ドメイン―門―網―目―科―属―種―株の順で階層化される。
Table 1-1 に、各階層の名称と、代表的な実験用バクテリアである大腸菌 K12 株の例を示す。
バクテリアの分類は、「門」以下でさらに細分化されるが、実際にバクテリアを表記する場
合は「属(genus)」と「種(species)」を用い、学名はこれらを組み合わせたラテン語をイタ
リック体で表記する（二名法）[19]。例えば、大腸菌の学名は Escherichia coli（E. coli と
略記）である。種の中で異なる形質を持つ集団が存在する場合、必要に応じて、種の下位
Table 1-1. Taxonomic rank of bacteria.
English
Japanese
Example
Domain
ドメイン
Bacteria
Phylum
門
Proteobacteria
Class
網
Gammaproteobacteria
Order
目
Enterobacteriales
Family
科
Enterobacteriaceae
Genus
属
Escherichia
Species
種
coli
Strain
株
K12
-4-
階層に亜種(subspecies)が設定されるものがあり、これは属+種+亜種の組み合わせで命名さ
れる（種と亜種名の間に subsp.を挿入する）。例えば、ヨーグルトの製造で用いられる乳酸
菌の一種であるラクティス菌の学名は Lactococcus lactis subsp. lactis であり、同じく
Lactococcus lactis に属するクレモリス菌(Lactococcus lactis subsp. cremoris)とは亜種の
違いで区別される（これらの識別を行った研究内容は、第 3 章で述べる）。
このようなバクテリアの命名や分類は、バクテリアを含む原核生物全体の系統分類を統
括する「原核生物系統学に関する国際委員会(International Committee on Systematic of
Prokaryotes, ICSP)」が管理している。新規であると考えられるバクテリアは、ICSP が関
わる International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 誌上で受理され
ると、新規バクテリアとして正式に認定されたことになる。そして認定されたバクテリア
の分類体系は、"Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology" [20]にまとめられている。
単離されたバクテリアは、ある種（あるいは亜種）に分類されたとしても、その遺伝学
的あるいは形態的な緒性質が、その種の他の菌株と同一であるとは限らない。例えば、E. coli
では、K12 株と O157 株は同種でありながら、前者は一般的な実験用バクテリアであり、
後者は深刻な被害をもたらす可能性がある食中毒の原因菌である。一方、バクテリアは細
胞分裂によって増殖するため、変異が生じなければ一細胞から増殖した集団（クローン）
は同一の遺伝学的な形質を有している。そこで、種（あるいは亜種）をさらに詳細に区別
するために、クローンの一群を株(strain)とよぶ。特に、種（あるいは亜種）を定義する場
合に基準となるバクテリアの株（菌株）を基準株(type strain)と言う。菌株の命名に関する
基準はなく、研究者の任意である。また、ある菌株が他機関に分譲されると、別の菌株番
号が付けられる。例えば、E. coli の基準株は、理化学研究所では JCM 1649T であり、The
American Type Culture Collection (ATCC)では ATCC 11775T であるが、形質は同一のク
ローンであると考えてよい。なお、基準株を指す時は、菌株名の右肩に T を添える。バク
テリアは菌株の違いでも毒性や機能などが大きく異なることが多く、病原菌や有用バクテ
リアを取り扱う上で、株レベルでの識別や分類まで重要視されることも少なくない[8, 21]。
-5-
1-3
バクテリアの分類・同定技術の現状
バクテリアは、17 世紀後半にオランダのレーウェンフックが自作の顕微鏡を用いて、そ
の存在と形態が初めて肉眼で確認された。そして 19 世紀後半以降、形態観察をはじめとし
て、生物化学的および分子生物学的な知見の深まりと各種分析手法の開発とともに、バク
テリアを分類あるいは同定するための様々な手法が報告されている。
主なバクテリアの分類・同定法としては、Fig. 1-2 に示すように、顕微鏡観察による形態
(morphological features)の違いによる分類法、生存あるいは増殖に必要な栄養源(primary
nutrition)の違いによる分類法、および菌体構成成分(molecular biological properties)の違
いによる化学分類法(chemotaxonomy)の 3 つが挙げられる[16]。これら各分類方法は視点を
変えて見ると、表現型(phenotype)による方法と、遺伝子型(genotype)による方法に分ける
ことができる。Table 1-2 はそれぞれの分類法が得意とする適用範囲をまとめたものである
[22, 23]。各手法の特徴について、次節で概説する。
Phenotype
Morphological
features
Cell morphology, Staining ･･･
Primary nutrition
Carbon source, Energy source ･･･
Molecular biological
properties
(Chemotaxonomy)
Chemical compositions such as amino acids (in
cell wall), quinone species, lipids, and proteins.
Serotype ･･･
Genotype
DNA, RNA
16S rRNA gene sequence analysis
G+C contents
DNA-DNA hybridization
Restriction fragment length polymorphism (RFLP)
Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)
Random amplification of polymorphic DNA (RAPD)
Amplified fragment length polymorphism (AFLP)
etc.
Fig. 1-2. Classification and identification methods of bacteria.
-6-
a)
Table 1-2. Applicable range of various classification and identification methofs.
Family
Genus
Species
Strains
Compositional analysis of cell wall
Quinone species analysis
Fatty acid analysis
Total protein analysis
Enzyme Electrophorecis
Serotyping, Phage typing
16S rRNA gene analysis
C+G contents analysis
DNA-DNA hybridization
Pulsed-field gel electrophoresis
a) Dark bars: suitable, gray bars: sometimes applicable.
注）
ここで、本論文で用いる｢分類｣、｢同定｣、「識別」、｢迅速同定｣という用語について
注記する。「分類｣とは、試料菌株の特性の相違に基づいてグループ分けすることであり、
｢同定｣とは試料菌株が既知のバクテリア種のいずれと同種であるのかを決定することを言
う。分類された菌株の一群が、分類学的な定義（後述）のもとで基準株と同一の特性を有
すると判断されると、その一群はその基準株と同じ種であると同定される。したがって、
分類と同定は密接に関連しており、多くの場合、これらを分けて考えることはできない。
このような場合、本論文では、「分類・同定」という組み合わせの用語を用いることにする。
手法によっては、迅速･簡便化して、単に菌株間あるいは既知種との異同を調べるだけに止
まることがある。それぞれが異なる場合は｢識別」という用語を用いる。一方、ある評価手
法で既知種と同じであると判断された場合であっても、分類学的に必要とされる「同定」
の要件を満たしているわけではないため、一般には「簡易同定」という用語が用いられる。
但 し 、 質 量 分 析 法 を 用 い た 迅 速 な 簡 易 同 定 に 対 し て は 、 こ れ ま で 「 迅 速 同 定 (rapid
identification)」という用語がよく用いられてきた経緯があることから、本論文でも「迅速
同定」という用語を用いることにする。
-7-
1-3-1
(a)
表現形による分類 (phenotypic classification)
形態学的分類 (classification based on morphological features)
形態学的分類法は、顕微鏡でバクテリアを直接観察する極めて基本的な分類法であり、
菌体の形や連なり方、動き、鞭毛の有無、および染色性の違いにより分類する[16, 24, 25]。
染色法は、顕微鏡下でバクテリアを異物と識別して明確に可視化するのに有効であり、そ
の代表的なものはグラム染色法(Gram staining)である。一般的には、スライドグラスに塗
布・乾燥したバクテリア試料を、塩基性色素であるクリスタルバイオレットで染色し、さ
らにヨウ素液で染色すると、菌体内には不溶性色素複合体であるクリスタルバイオレット
‐ヨウ素複合体が形成される。これを、エタノールを用いて脱色処理すると、グラム陰性
菌の場合は、細胞壁の脂質が溶解するため、この不溶性色素複合体が抽出されて脱色する
が、グラム陽性菌では、厚いペプチドグリカン層からなる細胞壁の孔がエタノールにより
閉じて不溶性色素複合体の抽出が妨げられ、濃い紫色が残る。細胞表面の特性はバクテリ
アの機能に密接に関連しており、グラム染色法は、細胞表面の組成の大まかな違いによっ
てバクテリアを分類する重要な試験項目である。さらに顕微鏡下でバクテリア細胞の形の
違いと組み合わせれば、バクテリアの種類をかなり絞り込めることもある。そのため現在
でも、培養可能なバクテリアを使った実験を行う際は、随時顕微鏡での観察を行うべきで
あると言われており[22]、形態観察は、最も伝統的な手段で経験を要する手法であるにもか
かわらず、現在でも非常に重要な分析項目の一つであるといえる。より詳細に菌体構造を
観察する場合は、走査型電子顕微鏡による表面構造の観察や、透過型電子顕微鏡による菌
体内部構造の観察が有効である[25]。
(b)
栄養的分類 (classification based on primary nutrition)
栄養的分類とは、増殖に必要な培養条件の違いによりバクテリアを分類する方法であり、
エネルギー源として化学物質を利用するか、光を利用するか（光合成）、さらには、炭素源
として無機物（とくに二酸化炭素）を利用するか（独立栄養）、有機化合物を利用するか（従
属栄養）などによって大別される。有機化合物を炭素源として利用する従属栄養生物に属
-8-
するバクテリアでは、さらに詳細に分類するために、様々な炭素源（通常は糖質）をそれ
ぞれ単独で与えて培養した際に、各炭素源を代謝するか否かを調べて、それらを特徴付け
る「資化性試験」が行われる。さらに、生育温度、pH、酸素分圧、塩濃度などのパラメー
タを加えることによって、バクテリアの増殖性を基準にして分類が行われる。この方法は、
生物として生命維持に必要な条件を基準にした分類法としては理解しやすい。もちろん、
厳密な分類には適していないが、特別な装置を必要とせずに簡便に評価を行うことができ
るため、広く利用されている。但し、客観的な増殖性の判定を行うことが困難であること
も多く、同一条件で試験できないバクテリアを比較して評価することもできない。
(c) 化学分類 (chemotaxonomy)
バクテリアの細胞構成成分には、高等生物では考えられない程の多様性がある。これを
分析して分類するのが化学分類法であり、1970 年代から定着している[26]。この方法では、
Fig. 1-2 に示したように表現型と遺伝子型により細胞の構成成分を分析する。表現型による
分類で分析対象となるものとしては、ペプチドグリカン、脂質類、タンパク質、および DNA
などが挙げられる[22, 26]。
･ペプチドグリカン：
バクテリアの細胞壁の主要な構成要素であるペプチドグリカンは、
糖とペプチドが結合しており、このペプチド部の化学構造やアミノ酸組成がグラム陽性菌
を属レベルで分類するための指標として利用されている（但し、グラム陰性菌の分類には
適さない）。この分析には、薄層クロマトグラフィー(thin-layer chromatography, TLC)や
HPLC (high performance liquid chromatography, HPLC)などが用いられる。
・脂質類：
脂質は、バクテリアの細胞膜の主成分であると共に、補酵素やタンパク質を
保持するための構造体でもある。バクテリア菌体に含まれる脂質の種類は多様であり、脂
肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質、ミコール酸、イソプレノイドキノン類などが、バクテ
リアの化学分類指標として利用されている。脂質類の分析には、主として HPLC、TLC、
質 量 分 析 法 (mass spectrometry, MS) 、 お よ び ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー (gas
chromatography)/MS が用いられる。ここでは、脂質分析で特に重要な解析対象であるリ
-9-
ン脂質とイソプレノイドキノン類について述べる。これらの代表的な化学構造を Fig. 1-3
に示す。
リン脂質は、炭化水素鎖が結合したリン酸エステル類の総称であり、グリセリドを基本
成分とするグリセロリン脂質と、セラミドを基本成分とするスフィンゴリン脂質に大別さ
れる。特にグリセロリン脂質は、全てのバクテリアが菌体中に有しており、鎖長や不飽和
度が異なる炭化水素鎖の組成分布や親水基部分の化学構造の違いなどが、バクテリアを化
学分類する上での重要な指標となる。特に、ホスファチジルエタノールアミン(Fig. 1-3a)
およびホスファチジルグリセロール(Fig. 1-3b)が代表的なリン脂質である。
イソプレノイドキノン類は、呼吸の電子伝達系に関わる補酵素として生命維持に重要で
あり、バクテリアが有するイソプレノイドキノン類は、メナキノン類(Fig. 1-3c)とユビキノ
ン類(Fig. 1-3d)に大別される。イソプレノイドキノン類のイソプレノイド側鎖は、連続した
共役二重結合をもつ不飽和炭化水素鎖であるが、バクテリア種によって、側鎖の長さ、水
素飽和度、および水素飽和位置が多様に異なる。その分子構造の違いにより主として属レ
(a) phosphatidylethanolamine
(b) phosphatidylglycerol
O
O
R2
C
CH2O
O
CH
C
O
O
R1
O
R2
C
CH2O
O
CH
C
O
R1
+
CH2O P
O CH2 CH2 NH3
CH2O P
O
OH
O CH2
HC OH
CH2OH
(c) menaquinones
(d) ubiquinones
O
O
CH3
CH3
CH3O
H
n
H
n
CH3O
O
O
Fig.1-3. Chemical structures of typical bacterial phospholipids and isoprenoid
quinones.
(a)
phosphatidylethanolamines,
(b)
phosphatidylglycerols,
(c)
menaquinones, and (d) ubiquinones. R1 and R2 in (a) and (b) mean hydrocarbon
chain.
- 10 -
ベルでの分類が可能であるため、バクテリアの分類群の記載に必要な項目の一つとなって
いる。
・タンパク質： タンパク質は、それをコードしている遺伝子の進化を反映しているため、
分類指標として期待できる生体成分である。ただし、タンパク質の種類によっては、培養
条件により組成比や発現量が大きく変化することがある。これまでタンパク質分析による
分類は、バクテリア菌体から抽出された全タンパク質のゲル電気泳動のパターンをもとに
行われてきた。しかし、近年の MS をはじめとする様々な構造解析技術の著しい進歩によ
り、タンパク質の詳細な化学構造（特にアミノ酸配列）の解析が可能になってきており、
これから分類指標として最も期待される生体成分である[22]。
以上のように、菌体構成成分を指標としてバクテリアを分類することは、生命体として
のバクテリアの特徴（表現型）を知る上でも重要である。しかし、これらの成分の発現量
や化学構造は、バクテリア種の違い以上に、培養条件の違いによって変化することも珍し
くなく、バクテリアを分類するための絶対的な指標にはなり得ない。一方、菌体構成成分
の中で、DNA は遺伝情報そのものであり、その塩基配列を比較することにより進化軸に沿
った系統分類が可能である。そのため、DNA 塩基配列に基づく分類は、「遺伝子型による
分類」として、上述の「表現型」による化学分類とは区別されている。
1-3-2
遺伝子型による分類 (genotypic classification)
細胞構成成分のうち、遺伝情報を蓄える分子である DNA と、これにコードされた RNA
およびタンパク質は、生物の進化時間の情報を含む「分子時計(molecular clock)」の役割を
演じる｢情報高分子(semantides)」である[27]。これらの分子構造の違いに基づいてバクテ
リアを分類する手法が、遺伝子型による分類(genotypic classification)であり、特に、DNA
あるいは RNA の塩基配列やタンパク質のアミノ酸配列の違いに基づいて生物の進化系統
を推定するのが、分子系統分類(phylogenetic classification)である[28, 29]。遺伝子型によ
る分類は、培養条件などの生育環境の影響を受けることがなく、バクテリアの進化を反映
した客観的な結果を得ることができる。これら情報高分子のうち、1960 年代から DNA が
- 11 -
分類指標として使われ始めた[30]。これは、DNA を構成するグアニン(G)とシトシン(C)の
組成（GC 含量）の測定法[31]と DNA-DNA ハイブリダイゼーション[32]が実用的な手法に
なったことが契機となった。その後 1988 年のポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain
reaction, PCR)の登場やシーケンシング技術の進歩などによって、遺伝子の塩基配列を解読
し、相同性解析に基づく分子系統分類が盛んに行われるようになった。
一般的に DNA 分析による分類という場合には、全ゲノムの塩基配列を間接的な手法で解
析する方法（塩基組成、ハイブリダイゼーション、および電気泳動断片パターンなど）や、
16S rRNA 遺伝子をはじめとする特定遺伝子の塩基配列を解析する方法を意味している。以
下に、遺伝子を指標とした代表的な分類法について、その概要を列記する。
(1)
GC 含量の測定 (GC contents analysis)
DNA の二重らせん構造で、アデニン(A)とチミン(T)、グアニン(G)とシトシン(C)が対合
しているので、DNA の塩基組成はグアニン(G)とシトシン(C)をあわせた GC 含量(mol%)で
要約される。GC 含量は、DNA の特性値のうち最も簡単なものであり、バクテリアの GC
含量は 20～80%と分布の幅が広い。そのため、バクテリアゲノムの GC 含量は、遺伝的に
近縁な菌株間では近い値を示し、バクテリアを主に属レベルで鑑別するのに有用な手法で
ある[33]。GC 含量は、DNA を分解して各塩基の量を定量する直接法と、2 本鎖 DNA の解
離温度(Tm)などの測定値から推定する間接法がある。かつては、間接法が汎用されていた
[34]が、現在では、HPLC の分析精度が向上したため、分解物の HPLC 測定による直接法
が一般的である[35]。
(2)
DNA-DNA 相同試験 (DNA-DNA hybridization)
近縁の生物に由来する一本鎖 DNA 同士はハイブリッド DNA を形成しやすく、遠縁の
DNA 同士ではハイブリッド形成が起こりにくいことから、異なる DNA 同士で行う再会合
の程度がバクテリアの類縁性の基準になり得ることが示された[36]。これが DNA-DNA ハ
イブリダイゼーションとしてバクテリアの分類・同定に導入されるきっかけになった。現
- 12 -
在、国際細菌分類命名委員会によって、「種は、70%以上の DNA-DNA ハイブリッドを形成
する集団である」と勧告されており[37]、DNA-DNA 相同性試験は、バクテリアの分類・同
定において、極めて重要な試験項目である。なお、DNA-DNA ハイブリダイゼーションは、
近縁関係にある菌種の遺伝的な識別を行うものであり、高次分類群の系統関係を知る手段
ではない。そのため、後述の 16S rRNA 遺伝子の塩基配列に基づく相同性解析を行って、
DNA-DNA ハイブリダイゼーションで比較すべき菌種をあらかじめ調べておく必要がある
[23]。
(3)
16S rRNA 遺伝子に基づく相同性解析 (16S rRNA gene sequence analysis)
Woese ら[38]により、rRNA の塩基配列解析によって、バクテリアをはじめとする様々な
微生物の分子系統解析が可能であることが証明された。バクテリアの rRNA は 3 種類（5S、
16S、および 23S）存在するが、その中で 16S rRNA の遺伝子がバクテリアの系統分類にき
わめて優れた指標としてよく用いられる。
バクテリアの 16S rRNA 遺伝子の塩基配列は、1980 年では数株しか決定されていなかっ
たが、現在では非常に多くの既知種について、16S rRNA 遺伝子の塩基配列が決定されてい
る。これは、新しい菌種の発表には、必ず 16S rRNA 遺伝子の塩基配列を決定することが
要求されているためである。DNA シーケンシグ技術の成熟により、16S rRNA 遺伝子を用
いた分子系統分類法は、科から属あるいは種までの同定や系統位置を決定するための一般
的な方法となっている[23]。
現在、バクテリアの分類体系は、16S rRNA 遺伝子の塩基配列を中心に蓄積されたデータ
をもとに整理されており、その塩基配列が 3%以上既存の菌種と異なっていればその株は分
類学的には新しい菌種と判断しても差し支えないと考えられている[39]。しかし、16S
rRNA 遺伝子の塩基配列が 100%一致しても、DNA-DNA ハイブリダイゼーションの相同性
が 70%以下である例も報告されており、16S rRNA 遺伝子の塩基配列だけを指標として検
出同定系を作成するのは適切ではないとの指摘もある[39]。
この方法は、バクテリアの培養が必要条件ではなく、環境試料などからバクテリア由来
- 13 -
の DNA 画分を抽出し、16S rRNA 遺伝子を PCR で増幅したり、直接菌体内の 16S rRNA
に蛍光タグをつけたプローブを結合させて in situ で解析する FISH (fluorescence in situ
hybridization)と呼ばれる手法などによって、培養できないバクテリアですら、その存在を
明らかにし、系統分類や群集構造における多様性評価を行うことが可能である[38, 40]。し
かし、極めて高感度な PCR に依存する方法は、雑菌汚染（コンタミネーション）の影響を
受けやすく、複数のバクテリア由来の DNA が結合して増幅されることによって「キメラ
DNA」が生成するといった問題点も含んでいる[41-43]。そのため、得られた解析結果を慎
重に判断することが重要である[13]。
(4)
その他の遺伝子解析による株レベルの分類法
上述の各手法は、バクテリアの属～種レベルでの分類・同定に適した手法であったが、
DNA 塩基配列の違いがわずかである株レベルでの識別や分類には、一般には適用が困難で
ある。そこで、DNA 塩基配列の違いに基づいて株レベルの分類を行うためには、DNA の
全長あるいはその断片を解析する方法[44]と、分子進化速度が速い特定の遺伝子の塩基配列
の変異を解析する方法[45]が主に用いられる。
前者は、PCR による DNA の増幅および特異的な DNA 塩基配列を認識する制限酵素によ
る断片化と、ゲル電気泳動による断片の分離を組み合わせる各種手法が挙げられる。制限
酵素断片長多型(restriction fragment length polymorphism, RFLP)法は、制限酵素によっ
て切断した DNA 断片をゲル電気泳動で分離し、その泳動パターンから菌株を識別する手法
である。巨大な DNA 断片をゲル電気泳動により分離するために、パルスフィールド電気泳
動法(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)[46]がよく利用される。PFGE では、2 方向
から電流をパルス的に加えると、巨大な DNA 分子がその 2 方向からのパルスにより三次構
造がほぐされ、方向転換されながら移動する。大きい分子の DNA は移動が遅いので、通常
のゲル電気泳動では分離ができないような 2 万塩基を越える大きな DNA であっても、移動
度の違いにより分離することが可能になる。現在、RFLP と PFGE を組み合わることによ
って、大型の DNA 断片の泳動パターンを解析する手法は、再現性に優れた信頼できる菌株
- 14 -
識別法であると評価されている[21]。
その他に、分離菌の DNA を鋳型として、ランダムな塩基配列を持つ DNA プライマーを
用いて PCR を行い、増幅された複数の DNA 断片の電気泳動パターンを比較することによ
って菌株を識別する、RAPD(random amplification of polymorphic DNA)法[47]や、RFLP
法と RAPD 法を組み合わせて、制限酵素で切断された長さの異なる DNA 断片を PCR で選
択的に増幅して検出する AFLP(amplified fragment length polymorphism)法[48, 49]が開
発されている。
上記以外にも、制限酵素による切断、PCR による DNA の増幅、ハイブリダイゼーショ
ンなどを組み合わせた様々な手法が提案されている[44]。これらの手法を用いて、食中毒菌
[8]、結核菌[50, 51]、体内挿入物（インプラント）への感染菌[52]などの疫学的に重要なバ
クテリアの株レベルでの識別・分類[49]が行われている。しかしながら、この手法では結果
が得られるまでに 1 日以上必要である。
遺伝子の塩基配列に基づいてバクテリアを亜種あるいは株レベルで分子系統分類する方
法では、DNA ジャイレース B サブユニット遺伝子(gyrB)[53, 54]、RNA ポリメラーゼ σ70
因子遺伝子(rpoD)[55]、シャペロンタンパク質 DnaJ 遺伝子(dnaJ)[56]など、進化速度が 16S
rRNA 遺伝子よりも比較的速い遺伝子の塩基配列を利用する方法も提案されている。
Mycobacterium 属[57]や Streptococcus 属バクテリア[58]では、菌種間における DNA 塩基
配列の相同性の平均値は、16S rRNA 遺伝子で約 95 %であり、gyrB や dnaJ はそれよりも
低い約 76 %であることが報告されている。そのため、gyrB や dnaJ は、菌種間の違いをよ
り明確に識別できる指標として注目されている。現時点では、これらが全てのバクテリア
の系統分類に適用できることは証明されておらず、今後様々なバクテリアを用いた研究に
より、その実用性が検証されていくものと考えられる。
以上のように、バクテリアの分類・同定に使われる方法はいくつもあるが、現在の分類
学では、(1) 形態学的データ、(2) 16S rRNA 遺伝子の DNA 塩基配列データ、(3) ゲノムの
GC 含量、(4) DNA-DNA 相同性、(5) 既存種との生化学的・生理学的な特性の相違、以上
- 15 -
の 5 項目が、いずれの菌群を対象とした場合でも記載すべきデータであるとされている[23]。
これらの試験項目のうち 16S rRNA 遺伝子の配列解析は、バクテリア種に関わらず基本的
に同じ手法が適用できるのに対し、表現型による分類は、分析対象のバクテリア種により、
検査項目が異なる。したがって、現在では遺伝子解析が容易になったこともあり、まず 16S
rRNA 遺伝子解析を行って属や種の位置づけを行い、さらに生物化学的手法による菌体構成
成分の分析や資化性試験などの煩雑な分析を行うことが分類・同定の近道であると言われ
ている[23]。このように、バクテリアを分類・同定するために、一つでも多くの独立した、
しかも遺伝子型で発現して制御されている性状の組み合わせと相関性を考慮した分析を行
う必要がある。その大きな理由は、Table 1-2 に示すように、それぞれの分析手法が得意と
する分類・同定の範囲が異なることに起因している。そのため、バクテリアを正確に分類･
同定するためには、何種類もの煩雑かつ長時間を要する測定や試験が要求される。その手
順を統一的にガイドしたものとして、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology [59]
が広く利用されている（但し、1994 年の第 9 版を最後に改訂版は出版されておらず、現在
では、記述内容が十分であるとは言えない）。
一方で、環境微生物や有用微生物のスクリーニングでは、分類学的な試験項目を簡略化
して、数多くの菌株を分類・同定する必要がある。また、食中毒が起こった場合などでは
原因となる病原菌の特定は一刻を争う。さらに、2002 年には炭疽菌などの病原菌を悪用し
たバイオテロあるいは模倣事件が発生するなど、20 世紀には想像もつかなかった事件が起
こり、バイオハザードに対するセキュリティー管理に対する関心が世界的に高まっている
[60, 61]。このように、上述した分析法では、バクテリアを取り扱う現場での実際分析には
対応しきれない場合が多々あり、迅速、簡便、かつ信頼性の高いバクテリアの分析手法の
開発が、常に求められている。
1-4
質量分析法によるバクテリアの迅速分析
バクテリアを迅速かつ簡便に分類・同定する手段として、質量分析法(mass spectrometry,
MS)を用いた化学分類が 1970 年代から盛んに検討されてきた。MS は、広い分子量分布を
- 16 -
有する菌体構成成分について、μg オーダー以下の試料を用いて数分以内で分析できる能力
をもつ。本節では、熱分解質量分析法を用いた脂質分析によるバクテリアの迅速同定法の
開発から、様々なソフトイオン化法の開発に伴うバイオマーカーの拡大、そして、現在 MS
によるバクテリア分析の主流となっている、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を
用いたタンパク質分析によるバクテリアの迅速同定法の開発までの経緯について概観する。
1-4-1
熱分解質量分析法によるバクテリアの迅速分析
脂質は、菌体全乾燥重量に対して 10%以下しか存在しないが、それらの分子種や分布パ
ターンは菌種ごとに特徴があるため、脂肪酸、極性脂質、およびイソプレノイドキノンな
ど様々な脂質成分が、バクテリアを化学分類する指標として用いられてきた[62]。1960 年
代にガスクロマトグラフィー(gas chromatography, GC)が実用化されると、バクテリア菌
体に含まれる脂質の分析が試みられた[63]。その後、高分子分析の手段として開発された熱
分解ガスクロマトグラフィー(pyrolysis-GC, Py-GC)を応用して、脂質の抽出を行わずにバ
クテリアの種類を解析する方法が提案された[64]。さらに、バクテリア菌体の熱分解生成物
の化学種を同定するために、Py-GC の検出手段として質量分析法を用いた、Py-GC/MS シ
ステムが利用された[65]。この研究は、1976 年の Viking 計画における火星の生命探索に
Py-GC/MS を導入することを意図して行われたもので、実際に、火星探査船に Py-GC/MS
システムが搭載されたことは特筆すべき事項であろう。このときは、生命の存在を裏付け
る有機化合物は検出されなかったが[66]、地球外生命体の検出手段として、Py-GC/MS は現
在でも有望視されている[67, 68]。
菌体試料を熱分解して得られる熱分解生成物をコールドトラップし、GC 分離を行わずに
質量分析計に導入する、オフラインの熱分解質量分析法(pyrolysis-mass spectrometry,
Py-MS)が、Py-GC/MS に続いて導入された[69, 70]。この当時、これらの論文を発表した
オランダ基礎科学財団(The Foundation for Fundamental Research on Matter, FOM)の原
子・分子物理研究所(Institute for Atomic and Molecular Physics)では、Py-GC および
Py-MS を用いたバクテリアの迅速分類・同定を行うプロジェクトが進められており、マス
- 17 -
スペクトルの指紋判定を行う Py-MS 装置およびデータ解析アルゴリズムの開発まで行って
いた[71]。
一方、1975 年に、質量分析装置のイオン源内部で菌体試料を直接熱分解し、熱分解生成
物をそのまま質量分析する、オンラインの Py-MS によるバクテリアの迅速同定法が報告さ
れた[72]。この報告では、凍結乾燥したグラム陰性菌を質量分析装置のイオン源に直接導入
し、300~350℃に加熱して熱分解により生じたリン脂質とユビキノンの観測ピークにより、
サルモネラ(Salmonella)属バクテリアをはじめとする各種病原菌の迅速同定が行われた。さ
らに、キュリーポイント(Curie-point)型のパイロライザーを用いた瞬間的な熱分解法による
Py-MS が導入され、バチルス(Bacillus)属バクテリア[73]やレジオネラ(Legionella)属バク
テリア[74]の種レベルでの分類が行われた。また、質量分析装置も進歩し、熱分解装置とタ
ンデム型質量分析計の結合システム[75, 76]や、それまでの電子イオン化法(electron
ionization, EI)に代わり、当時としては新しいソフトイオン化法であった化学イオン化
(chemical ionization, CI)を用いた質量分析計との結合[77, 78]により、バクテリアの分析が
行われた。その後さらに測定条件の検討[79]などが進み、測定手法が一般化するにつれて、
応用分野も拡大し[80, 81]、特に臨床分野への応用が広がった[82-91]。
1-4-2
ソフトイオン化法の開発とバクテリア分析への応用
Py-MS は、試料を熱分解することによって生じるフラグメントのパターンに基づいてバ
クテリアを分析するものであった。一方、生体関連物質を分解せずにイオン化するための
種々のソフトイオン化法の開発と実用化が進められた[92-94]。Table 1-3 に、各ソフトイオ
ン化法の開発の経緯を示す[95]。
1970 年前後から 1980 年代にかけて、レーザー脱離イオン化(laser desorption/ionization,
LDI)[96]、電界脱離(field desorption, FD)[97]、プラズマ脱離(plasma desorption, PD)[98]、
高速原子衝突(fast atom bombardment, FAB)[99]、および液体二次イオン質量分析(liquid
secondary ion MS, LSIMS)[100]などのソフトイオン化技術が相次いで開発され、生体試料
の分析に用いられるようになった。これにより、菌体構成成分の分析対象が、ペプチド、
- 18 -
多糖類、およびオリゴヌクレオチドにまで拡大した。1980 年代には、これらの質量分析技
術により、全菌体もしくは菌体破砕液中の脂質、脂肪酸、および菌体内毒素を分析した先
駆的な研究が行われた[101-103]。
Table 1-3. Development of soft ionization techniques and relating topics.
1968
Laser desorption ionization (LDI) [96]
1969
Field desorption (FD) [97]
1974
Plasma desorption (PD) [98]
1981
Fast atom bombardment (FAB) [99]
1982
Liquid secondary ion MS (LSIMS) [100]
1984
Electrospray ionization (ESI) [104]
1985
Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) for small molecules
[105]
1987
Protein analysis by MALDI using inorganic matrix [106]
1988
Protein analysis by MALDI using organic matrix [107]
2002
The Nobel prize in chemistry ( Tanaka and Fenn)
1980 年代末に、エレクトロスプレーイオン化法(electrospray ionization, ESI)[104, 108]
とマトリックス支援レーザー脱離イオン化法(matrix-assisted laser desorption/ionization,
MALDI)[106, 107]が相次いで登場し、それまでは MS の解析対象ではないと考えられてき
た分子量が数万以上ものタンパク質ですら、分解せずにイオン化することが可能になった。
さらに、エレクトロニクス技術の進歩と共に、MALDI-MS 測定に用いる飛行時間型質量分
析装置(time-of-flight mass spectrometer, TOFMS)の高性能化が進み、現在では、分子量が
2000 程度までのペプチド分析などでは 20 ppm 程度、タンパク質の分析であっても 100
ppm 程度の高い質量精度で、フェムトモル(10-15 mol)レベルの測定試料の質量を解析する
ことが可能な装置が一般的なものになっている。これらの新しい MS 技術の開発は、それ
まで行われてきた生体高分子の構造解析のアプローチを根底から覆し、プロテオーム解析
をはじめとする様々なバイオ研究のハイスループット化において革命的な役割を果たした。
- 19 -
この技術の開発に対して、2002 年のノーベル化学賞が田中耕一氏と、J. B. Fenn 教授に授
与された[109]。このような測定技術の進歩に、MS を用いたバクテリアの分析も無関係で
はありえず、MALDI-MS が生化学関連の分野を中心に普及し始めた 1990 年代後半から、
それまで主として用いられてきた Py-MS や FAB-MS などに代わり、MALDI-MS が解析手
段としての重要な役割を担うことになった。
1-4-3
MALDI-MS によるバクテリアの分析
MALDI-MS は、試料分子が「マトリックス剤」と総称される化合物によって分散された
微細結晶の表面に、レーザー光をパルス照射することにより、試料分子をほとんど分解す
ることなくソフトにイオン化し、質量分析する方法である[110-112]。MALDI-MS は、何ら
かの溶媒に可溶でかつ不揮発性の化合物であれば、タンパク質、糖質、オリゴヌクレオチ
ド、脂質、およびこれらの複合体をはじめとする様々な生体関連物質のマススペクトルを
観測することが可能である。すなわち、MALDI-MS の登場により、バクテリア菌体のあら
ゆる構成成分が解析対象になったといっても過言ではない。しかも、菌体構成成分を抽出
するのではなく、菌体そのものを測定試料としてマススペクトルを観測することが可能で
ある[113]。さらに、“intact cell MALDI-MS (ICMS)”[114, 115]あるいは「オンプローブ試
料調製法」[116, 117]と呼ばれる、培地上のバクテリア菌体を直接試料ターゲットに塗布し
て MALDI-MS で測定する方法も開発されており、その簡便性、迅速性、および高感度は、
従来の分析手法と比較にならないほどで際立っている。そのため、MALDI-MS は、バクテ
リアを属や種レベルで容易に識別あるいは迅速同定できる解析手法として急速に発展して
きた[60, 118-121]。以下に、MALDI-MS を用いた主なバクテリアの分類・同定法について
述べる。
(1) 脂質を指標とする方法
当初、MS を用いた脂質分析では、Py-MS や FAB-MS が利用されてきたが、MALDI-MS
の開発により、それまでの MS 技術では測定が困難であった、熱的に不安定な脂質の分析
- 20 -
まで可能になった。例えば、細胞膜の主な構成リン脂質であるホスファチジルエタノール
アミンおよびホスファチジルグリセロール[122]（Fig. 1-3 参照）や、リポペプチド[123]な
どを指標とした Bacillus 属バクテリアの識別が報告されている。しかし、これらはいずれ
も質量分析の前に菌体試料から溶媒抽出などにより得られた脂質成分を分析対象としてお
り、何らかの前処理が必要である。石田ら[60, 117, 124-126]は、培地から採取したバクテ
リア菌体を MALDI-MS の試料プレート上に直接塗布し、その上から有機溶媒を用いたマト
リックス溶液を滴下する、脂質分析のためのオンプローブ試料調製法を開発した。これに
より、μg オーダーの菌体試料を MALDI-MS により直接測定し、グラム陰性菌のリン脂質
を高感度に検出することを可能にした。この手法により、同種のリン脂質の相対強度の違
いにより、大腸菌と豚コレラ菌を含む腸内バクテリアを検出し、属の違いを明確に識別で
きたことが報告されている[117]。さらに、ペプチドグリカン層の厚い細胞壁をもつグラム
陽性菌に対しても、高濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)を添加することにより、リン脂質を観
測することができることが報告されている[124]。
TOFMS を質量分離部に用いた MALDI-MS では、観測されるピークの質量のみから一義
的に脂質の化学組成を解析することはできない。そこで、フーリエ変換イオンサイクロト
ロ ン共鳴 質量 分析計 (Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometer,
FT-ICR/MS)を用いた超高分解能測定により、菌体そのものを測定して観測されたマススペ
クトル上の各ピークの精密質量から脂質成分の化学組成を求める方法も提案されている
[127]。
(2) タンパク質を指標とする指紋判定法
タンパク質は、菌体乾燥重量に対して 50%以上含まれ、200～6000 種にもおよぶ極めて
多種多様な分子種である[121]。しかも、タンパク質は「機能高分子」であると共に、その
アミノ酸配列が進化を反映した｢情報高分子｣としての性格をもつことから、生物機能と遺
伝的形質の両者を対比したバクテリアの系統分類学的な解析を行うことができる分類指標
としての利用が、以前から期待されてきた[128, 129]。
- 21 -
当初、バクテリア菌体中のタンパク質の分析には、二次元電気泳動法が主に用いられて
きた[129]。その後、MALDI-MS の実用化に伴い、この手法で観測されるタンパク質のマ
ススペクトルパターンを指紋判定する方法が主流になった。基準となるバクテリアのマス
スペクトルライブラリをあらかじめ用意しておけば、バクテリア種の迅速同定や株レベル
での識別を行うことが可能になる[130-134]。この指紋判定法は、タンパク質や脂質などの
菌体構成成分を解析対象としたバクテリアの化学分類の一手法であるという観点からすれ
ば、各種クロマトグラフィーやゲル電気泳動法を用いた従来の分類法と変わらない。しか
し、MALDI-MS による方法では、バクテリア試料の前処理がほとんど必要なく、分析に必
要とされる菌体量はわずかμg 以下で、場合によっては 1000 細胞[135]、さらには 100 細胞
[136]でもマススペクトルを観測することができ、数分以内の測定時間で正確な質量を求め
ることができるという特長は、従来法に比べて大きな利点である。これまでに、炭疽菌
(Bacillus anthracis)[137, 138]、ピロリ菌(Helicobacter pylori)[139, 140]、各種感染症を引
き起こすヘモフィルス(Haemophilus)属バクテリア[141]、院内感染菌である薬剤耐性黄色
ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)[142]などの Staphylococcus 属バクテリア[143]、食中
毒の原因菌である Campylobacter 属バクテリア[144-146]やセレウス菌(B. cereus)[147]、
大腸菌(E. coli)などの各種腸内バクテリア類[133, 144, 148, 149]、魚類のエロモナス病を発
症する Aeromonas 属バクテリア[150, 151]などの病原性バクテリアの迅速分析が主として
行われている。さらに、下水汚泥[152]あるいは海洋試料[153]から採取した環境微生物群や、
ヨーグルトの製造で用いられる乳酸菌[154, 155]などのキャラクタリゼーションにも応用
されている。
最近では、ケモメトリックスを利用した指紋判定に基づく化学分類も行われ[136, 150,
156]、ライブラリを備えた解析ソフトウェアも開発されている[157, 158]。しかしながら、
指紋判定法は、マトリックス剤の種類および結晶の調製方法[159-161]や測定装置の機種な
どの測定条件の違い[162-164]だけではなく、バクテリアの生育条件の違い[155, 165, 166]に
よっても、観測されるマススペクトルのピークパターンが大きく異なるうえ、観測してい
るピーク成分が不明であるため、同定結果には再現性や信頼性に乏しいという根本的な課
- 22 -
題が残されている。そのため、測定条件を最適化する試みもなされている[115, 167-169]が、
様々なバクテリアの培養条件や測定装置を、異なる機関間で統一することは現実的ではな
く、あくまでも限られた機関や組織内に限られた規格に止まっている。
(3) バイオインフォマティックスを利用する方法
ここ数年のうちにバクテリアの全ゲノム解読が急速に進展し、さらに生物情報学（バイ
オインフォマティックス, bioinformatics）の発展により、様々なタンパク質の翻訳アミノ
酸配列情報を、インターネットを介して Swiss-Prot/TrEMBL や NCBInr などの公共タン
パク質データベース（第 2 章で詳述）から容易に入手できるようになった。それに伴い、
これまでの指紋判定法に代わる方法として、バイオマーカータンパク質の観測質量を、遺
伝子の塩基配列情報を翻訳したアミノ酸配列から推測される計算質量と関連付けてタンパ
ク質を同定することによって、その情報を与えるバクテリア種を同定する方法
(bioinformatics-based approach [121])が提案された[140, 170]。
この方法で解析に必要な測定値は、マススペクトル上で観測されるバイオマーカータン
パク質の m/z 値だけであるため、培養条件や測定条件の違いによりピーク強度の変動の影
響を受ける指紋判定法の問題点を克服した手法であると言える。しかも、バイオマーカー
タンパク質の質量情報は、それをコードする遺伝子情報と関連付けられているため、遺伝
子型の同定結果を得ることができる。しかし、バクテリアの細胞を MALDI-MS で測定する
と、様々な成分のピークが多数観測されてしまう。それらの観測ピークの中から、ライフ
ステージや培養条件に関係なく発現し、確実に観測されるバイオマーカータンパク質を選
定することが、信頼性の高い同定分類結果を得るために重要である。そのため、バクテリ
ア試料の MALDI マススペクトル上で観測されやすいピーク成分の解析が進められてきた。
HPLC と接続した MALDI-MS により、バクテリア細胞の懸濁液中の様々なタンパク質が
同定され、その中にリボソームタンパク質が多く含まれていることが明らかとなった
[171-173]。さらに、E. coli の菌体を MALDI-MS により測定して観測されるピークの約半
分が、リボソームタンパク質であることが確認された[174]。バクテリア以外でも、真菌類
- 23 -
(fungi)の測定でピークが帰属されたタンパク質には、リボソームタンパク質が含まれてい
た[175]。このような背景から、リボソームサブユニットタンパク質をバイオマーカーとし
て用いてバクテリアの迅速に同定を行う方法が、Pineda ら[176]によって提案された。
1-5
リボソームタンパク質をバイオマーカーとして用いる MALDI-MS によるバクテリア
の迅速同定
リボソームは、生物の細胞に普遍的に存在し、遺伝子情報に基づいてタンパク質を合成
する細胞質成分である[177]。Fig. 1-4 に原核生物の 70S リボソームの構成を示す。70S リ
ボソームは、ラージサブユニット(50S)とスモールサブユニット(30S)から構成されている（S
値は、超遠心での沈降速度を表し、大きな値ほど大きな構造体である）。さらに、ラージサ
ブユニットは、2 種類の rRNA（23S rRNA および 5S rRNA）と L1～L36（欠番有り）の
33 種類のサブユニットタンパク質から構成されており、スモールサブユニットは、16S
rRNA と S1～S21 の 21 種類のサブユニットタンパク質から構成されている。これらの構成
成分の組成と構造は、培養条件やライフステージが異なっても、基本的には変化しない。
リボソームは、細胞内に最も多く存在する小器官であり、細胞分裂が活発な対数増殖期
には、菌体重量の半分程度を占め、リボソームタンパク質だけでも約 20%を占めている[178]。
70S ribosome
50S large subunit
23S rRNA
30S small subunit
5S rRNA
16S rRNA
Ribosomal
subunit proteins
S1～S22
Ribosomal
subunit proteins
L1～L36
- 24 -
そのため、Pineda ら[176]は、bioinformatics-based approach で対象とするバイオマーカ
ーをリボソームサブユニットタンパク質に限定すれば、観測ピークの m/z 値と計算質量が
偶然一致することによる誤判定の危険性を大幅に低下することができると考え、統計学的
なモデルで信頼性を検証すると共に、実際に Bacillus 属バクテリアをはじめとする 5 種類
のバクテリアの同定を行った。
すでに、リボソームタンパク質は、MALDI-MS で測定しやすいタンパク質であることが
知られている[179]。その理由として下記の点が挙げられる[180]。
1) リボソームタンパク質は菌体内での発現量が多い。
2) リボソームサブユニットタンパク質のほとんどが、プロトン親和性が高い、塩基性
タンパク質であるため、MALDI 過程で[M + H]+イオンが生成しやすい。
3) 分子量が 5000~20000 程度のリボソームサブユニットタンパク質が多いため、数
Da 程度の誤差範囲で、これらの質量を比較的正確に求めることができる。
4) アミノ酸配列から予測できないような翻訳後修飾は起こりにくいため、タンパク質
データベースに登録されている翻訳アミノ酸配列情報から発現タンパク質の質量を
推測することができる。
Pineda ら は 、 こ れ ら の 利 点 に 注 目 し て 、 バ イ オ イ ン フ ォ マ テ ィ ク ス を 利 用 す る
MALDI-MS によるバクテリアの迅速同定を行うためのバイオマーカーのモデルとして、リ
ボソームタンパク質を選択した[176]。
本論文の著者は、MALDI-MS によるバクテリアの迅速同定法の実用化を目指すうえで、
リボソームタンパク質をバイオマーカーとすることが、分子系統分類の視点から極めて重
要な意味をもつことに気がついた[180]。リボソームサブユニットタンパク質は、rRNA と
同様に、生体内において生命維持に必須の情報高分子であり、それらのアミノ酸配列およ
びそれらをコードする遺伝子の塩基配列の変異は、バクテリアの分子進化を反映している
と考えることができる。このような生命維持に関与し、多くの生物種に共通して存在して
いるタンパク質をハウスキーピングタンパク質(house-keeping protein)といい、それをコー
- 25 -
ドする遺伝子をハウスキーピング遺伝子(house-keeping gene)という。リボソームは、あら
ゆる生物種に存在し、その構造は非常に良く保存されている。構造の保存性が高いという
ことは、換言すればわずかなアミノ酸配列の違いとそれによる分子量の違いが、バクテリ
ア種の違いを判定する決定的な評価指標になり得るということを意味する。すなわち、リ
ボソームタンパク質をバイオマーカーとする方法は、リボソーム構成成分の遺伝子の保存
性の高さに注目している点において、現在主流となっている 16S rRNA 遺伝子の塩基配列
を利用する方法と、解析の基本的な概念は同じである。
すでに、リボソームサブユニットタンパク質の高い保存性に着目してバクテリアの分類
を試みた先駆的な研究例が報告されており、Ochi ら[181-190]および Ochiai ら[191, 192]
は、リボソームタンパク質の二次元電気泳動のパターンや特定のリボソームサブユニット
タンパク質（特に L30）のアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列からバクテリアを分
類する手法を提案した。しかし、リボソームタンパク質は、その高い塩基性のために、二
次元電気泳動による分離が容易ではないうえ、現在では、16S rRNA 遺伝子の塩基配列解析
が主流になったため、これらの方法が普及することはなかった。
しかし、今や MALDI-MS を用いれば、リボソームタンパク質は、比較的容易に分析でき
る対象である。そこで、本研究では、50 種類程度のリボソームサブユニットタンパク質の
高い保存性に着目した解析を行えば、遺伝子解析に頼らなくても、MALDI-MS を用いた迅
速簡便で、かつ遺伝学的な根拠に基づく信頼性の高い実用分析法を開発することができる
のではないかと考えた。しかしながら、リボソームタンパク質をバイオマーカーとした
MALDI-MS によるバクテリアの迅速同定法を実用化するためには、解決すべき 2 つの大き
な課題が存在する[180]。
第一に、この適用範囲は、基本的にゲノム情報が公知のバクテリアに限定されている。
Pineda らが、リボソームタンパク質をモデルとしたバイオインフォマティクスを利用する
手法を報告した 2003 年の時点では、わずか 38 種類のバクテリアのリボソームタンパク質
の翻訳アミノ酸情報しか入手することができなかった[176]。しかし、ここ数年、バクテリ
アの全ゲノム解読プロジェクトが世界的に盛んに進められており、Fig. 1-5 に示すように、
- 26 -
2007 年 12 月 1 日の時点で GenBank などの DNA 塩基配列データベースに登録されている
全ゲノム解読結果は、798 株（ドラフト状態を含む）に達した。しかも、これらのうち 204
菌株のゲノム解読結果は、2006 年 12 月からわずか 1 年間で新たに登録されたものである。
ゲノム解読されるバクテリアの種類は、今後もさらに増え続けるものと期待される。した
がって、様々な分野で関心が高い病原菌や有用微生物に関しては、この問題があまり重要
ではなくなる日もそう遠くはな
されるバクテリア菌株は、産業上
有用な菌株か、病原菌の代表的な
菌株であることが多く、バクテリ
アの分子系統分類の指標となる
Number of sequenced bacteria
いであろう。しかし、ゲノム解読
1000
800
600
400
200
0
2006. 3
2006.6 2006. 9 2006. 12 2007. 3 2007. 6 2007. 9 2007. 12
Year
基準株が選ばれるとは限らない。
第二の課題は、すべてのサブユ
Fig. 1-5. Increase of the number of sequenced
ニットタンパク質に対して、計算
genomes of bacteria in publicly available genome
databases as a function of time.
質量が発現タンパク質の実際の
質量と一致するとは限らないということである。計算質量と観測ピークの質量が一致しな
い理由として、以下の 3 つの可能性が挙げられる。
① アミノ酸配列情報からは推測できない、何らかの翻訳後修飾が起こっている。
② アミノ酸配列がゲノム解読株のものと異なっている。
③ タンパク質データベースに登録されているアミノ酸配列情報に誤りがある。
翻訳後修飾に関する問題（①）は、ほとんどのバクテリアについてリボソームタンパク
質の翻訳後修飾の実態が明らかでないことに起因している。アミノ酸配列情報からは予測
することができない翻訳後修飾が起こると、バクテリア種を同定するための指標となる計
算質量を正しく求めることができないことになる。代表的な翻訳後修飾は、生合成された
ポリペプチド鎖の N 末端に必ず位置するメチオニン残基の切断であるが、これは N 末端則
と呼ばれる経験則（第 2 章で詳述する）によって、アミノ酸配列情報からその有無を容易
- 27 -
に推測し、計算質量を求めることができるので、問題にはならない。それ以外の翻訳後修
飾として、E. coli のリボソームタンパク質では、リボソームサブユニットタンパク質の種
類によって、メチル化やアセチル化などが起こることが知られている[179]。しかし、E. coli
のリボソームサブユニットタンパク質で起こる翻訳後修飾が、他のバクテリアのリボソー
ムサブユニットタンパク質でも同様に起こるかどうかは、全くといってよいほど明らかに
なっていない。
アミノ酸配列の変異に関する問題（②）は、この手法がゲノム解読されたバクテリア菌
株の翻訳アミノ酸配列情報を手掛かりにしていることに起因している。仮に試料菌株がゲ
ノム解読株と同種であっても、ゲノム解読株とはアミノ酸配列が異なるリボソームサブユ
ニットタンパク質が存在すると、それらはバクテリア種を同定する指標として用いること
ができない。
アミノ酸配列情報の誤りに関する問題（③）は、この手法だけではなく、プロテオーム
解析などアミノ酸配列データベースを利用する他の手法にも影響が大きい。しかし、どの
程度の頻度でどのような誤りが起きているのか、登録されているアミノ酸配列情報の検証
はほとんど行われていない。
以上のように、リボソームタンパク質をバイオマーカーとして用いる方法は、バクテリ
アを遺伝子型に基づいて迅速に同定し得る手法としてその高い潜在能力が期待されるが、
実際には上記の課題が、実用的なバクテリア分析法を開発する上での大きな障壁になって
いる。
1-6
本研究の目的と概要
これまで述べてきたように、環境微生物あるいは有用微生物のスクリーニングや医療現
場での病原菌の特定など、様々な分野において、どのようなバクテリアが存在しているの
かを迅速かつ簡単な手法で正確に把握するための分類・同定手法の開発が強く求められて
いる。このような要求に対して、MALDI-MS は、ごく少量の試料でほとんど前処理を行わ
ずにバクテリア菌体の構成成分の正確な質量を求めることができることから、バクテリア
- 28 -
の迅速簡便な分析手法になり得ると期待されてきた。しかし、従来行われてきた脂質やタ
ンパク質のマススペクトルパターンを用いた指紋判定法では、培養条件や前処理および分
析装置の違いによる影響を強く受けるため、解析結果の信頼性に大きな課題があった。こ
れに対して、あらゆる生物に多量に存在するリボソームタンパク質をバイオマーカーとし、
MALDI マススペクトル上で観測されるピークの観測質量を、タンパク質データベース上の
翻訳アミノ酸配列から推測した計算観測質量と比較することによって、その情報を与える
バクテリア種を同定する手法が提案された。この手法は、マススペクトルから得られる質
量情報をゲノム情報と関連付けるため、遺伝学的な根拠に基づく信頼性の高い同定手法に
なり得ると考えられる。しかし、翻訳アミノ酸配列情報からは予測できない翻訳後修飾、
菌株の違いによるアミノ酸配列の変異、そしてタンパク質データベースに登録されている
アミノ酸配列情報に誤りのために、実際に発現するリボソームタンパク質の質量が計算質
量とは異なる可能性がある。しかも、ほとんどのバクテリアについて、発現リボソームタ
ンパク質の質量は検証されていないのが現状である。
そこで、本研究では、リボソームタンパク質をバイオマーカーとした MALDI-MS による
迅速かつ簡便で信頼性の高いバクテリアの分類・同定手法を確立することを目的とした。
まず、ゲノム解読された乳酸菌をモデルバクテリアとして用い、MALDI-MS で観測される
発現リボソームタンパク質の質量と、タンパク質データベース上に登録されている翻訳ア
ミノ酸配列情報に基づく計算質量とを比較して、リボソームサブユニットタンパク質の詳
細なキャラクタリゼーションを行った。そして、翻訳後修飾が起こりやすいリボソームサ
ブユニットタンパク質や、ピークが観測されにくいリボソームサブユニットタンパク質を
調べ、さらにタンパク質データベースに誤って登録されている翻訳アミノ酸配列情報の修
正を行うことによって、信頼性の高いバクテリアの同定結果が得られるバイオマーカーを
選択する指針を提案した。
この過程で、リボソームサブユニットタンパク質の中には、株レベルでアミノ酸配列が
変異しやすいものがいくつか存在し、それらの変異はマススペクトル上で明確なピークシ
フトとして容易に検出できることを明らかにした。この変異の有無をプロファイル化して
- 29 -
統計学的な処理を行うことにより、遺伝子解析を行わなくても、タンパク質の質量分析に
よってバクテリアの分子系統分類が可能であることを見出した。本論文は、MALDI-MS を
用いた従来のバクテリア分析法における諸課題を克服して、迅速・簡便さと系統分類学的
な信頼性を兼ね備えた、新しいバクテリアの分析手法を開発した研究成果をまとめたもの
であり、全体は 5 章で構成されている。以下にその概要を述べる。
第 1 章は、序論であり、バクテリア分析の必要性と現在用いられている分類・同定技術
を概説し、次にバクテリア種の迅速な分析法として期待されてきた質量分析法の特徴を述
べ、そのなかでもリボソームタンパク質をバイオマーカーとして用いる MALDI-MS による
バクテリアの迅速同定の可能性と諸課題を指摘し、最後に本研究の目的を述べている。
第 2 章では、本研究に用いた MALDI-MS の測定原理、リボソームタンパク質の分析条件
の最適化について述べている。特に、リボソームタンパク質の MALDI-MS の測定技術で鍵
となる、マトリックス剤の選定と試料結晶の調製方法について最適化を行った内容を記述
している。
第 3 章では、ゲノム解読された乳酸菌をモデルバクテリアとして用いた MALDI-MS によ
るリボソームタンパク質のキャラクタリゼーションについて論じており、本章は 5 つの研
究内容から構成されている。
3-1 節では、ゲノム解読された乳酸菌 Lactobacillus plantarum NCIMB 8826 をモデルと
して、プロテオーム解析の手法により、各リボソームタンパク質の発現を検証し、タンパ
ク質データベース上のアミノ酸配列情報が概ね正確であることを確認した。次に、3-2 節で
は、同種で複数のゲノム解読株を用い、マススペクトルおよび翻訳アミノ酸配列情報を比
較しながら、タンパク質データベースに登録されているリボソームタンパク質の翻訳アミ
ノ酸配列情報を検証して誤りを修正すると共に、アミノ酸配列に変異が起こるリボソーム
サブユニットタンパク質を明らかにする手法を提案した。これらの研究過程で、リボソー
ムタンパク質を精製しなくても、菌体破砕液からリボソームサブユニットタンパク質のピ
ークを明確に観測できることを明らかにし、極めて簡便な測定法を提案した。さらに、3-3
節では、ゲノム解読された 8 種類の乳酸菌の菌体破砕液を MALDI-MS で測定し、ピークが
- 30 -
帰属されたリボソームサブユニットタンパク質の種類を比較して、信頼性が高い分析結果
が得られるバイオマーカーを選択する指針を提案した。
第 3 章の後半は、実試料中のバクテリアの迅速同定を試みた研究内容について述べてい
る。まず、3-4 節では、実際に研究室で保存している乳酸菌試料のコンタミネーションを判
定し、本法が保存菌株の管理に応用できることを述べた。また、3-5 節では、本法を清酒の
汚染源として知られる乳酸菌である「火落ち菌」の迅速同定を試みた。火落ち菌は、リボ
ソームタンパク質のアミノ酸配列情報が公開されていないため、基準となる菌株の精製リ
ボソームタンパク質の質量を実測してまとめたデータベースを作成し、これを利用して実
際に清酒醸造所で発生した火落ち菌を同定した。
第 4 章では、バクテリアの株レベルでの分子系統分類法を開発した研究内容を述べてい
る。これは、リボソームタンパク質のアミノ酸配列には、菌株の違いによりある程度の割
合で変異が生じており、それをマススペクトル上のピークシフトとして明確に検出できる
ことを実証した第 3 章の研究成果を発展させたもので、本章は 2 つの研究内容から構成さ
れている。
4-1 節では、株レベルでの多様性が豊富である典型的な土壌微生物 Pseudomonas putida
16 菌株をモデルとして、ゲノム解読株と試料菌株のリボソームサブユニットタンパク質の
観測質量を比較してプロファイル化し、クラスター解析によりデンドログラムを作成した。
これにより得られるデンドログラムが、従来の遺伝子解析法である gyrB の DNA 塩基配列
解析に基づき作成した分子系統樹と極めてよく一致することを確認し、DNA 塩基配列解析
を行わずに、MALDI-MS で株レベルでの分子系統分類が達成できることを実証した。
4-2 節では、この手法を、低温増殖性乳酸菌の迅速同定および株レベルでの分類に適用し、
本法が迅速同定や分類ばかりでなく、有用微生物のスクリーニングに対しても有効な手法
になり得ることを実証した。
第 5 章は結語であり、リボソームタンパク質をバイオマーカーとした MALDI-MS による
バクテリアの分類・同定法の到達点と、今後の展望について述べている。
- 31 -
文献
[1]
緒方靖哉: 微生物とその利用; コロナ社: 東京, 1997.
[2]
乳酸菌研究集談会; 編: 乳酸菌の科学と技術; 学会出版センター: 東京, 1996.
[3]
筏義人編: 生分解性高分子; 高分子刊行会: 京都, 1994.
[4]
筏義人編: 生分解性高分子の基礎と応用; アイピーシー: 東京, 1999.
[5]
山根恒夫; 上田俊策; 前原晃: グリーンプラスチック最新技術; 井上義男, 監; シーエム
シー出版: 東京, 2002, pp. 71-83 (6. 微生物を利用する生分解性プラスチック合成).
[6]
Iwamoto, T.; Nasu, M.: J. Biosci. Bioeng. 2001, 92, 1.
[7]
海見悦子; 高橋栄二; 橋口大介; 藤原和弘: 資源と素材 2006, 122, 1.
[8]
渡辺治雄; 寺嶋淳; 泉谷秀昌; 伊豫田淳; 田村和満: 感染症学会誌 2002, 76, 842.
[9]
小笠原準: 生活衛生 2006, 50, 378.
[10]
泉秀実: 園芸学研究 2005, 4, 1.
[11]
河野芳樹: Mycotoxins 2007, 57, 17.
[12]
鬼武一夫: 日本農村医学会雑誌 2005, 54, 625.
[13]
高井研; 佐子芳彦: Microbes Environ. 2000, 15, 45.
[14]
長沼毅: 資源と素材 2004, 120, 1.
[15]
Stackebrandt, E.: Biology of the prokaryotes; Lengeler, J. W., Drews, G., Schlegel, H.
G.; Blackwell Science: New York, 1999, pp. 674-720 (Prokaryotic diversity and
systematics).
[16]
須藤隆一編: 環境微生物実験法; 講談社サイエンティフィク: 東京, 1988.
[17]
Whittaker, R. H.: Rev. Biol. 1959, 34, 210.
[18]
Woese, C. R.; Kandler, O.; Wheelis, M. L.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 4576.
[19]
吉田真一: 感染症学雑誌 2001, 75, 93.
[20]
Garrity,
G.
M.:
Bergey's
Manual
of
Systematic
Bacteriology
2nd
Ed.;
Springer-Verlag New York, 2001.
[21]
渡辺幸一: 腸内細菌学雑誌 2005, 19, 193.
[22]
鈴木健一郎; 平石明; 横田明; 編: 微生物の分類・同定実験法; シュプリンガー･フェアラ
- 32 -
ーク東京: 東京, 2001.
[23]
河村好章: 感染症学雑誌 2001, 75, 1003.
[24]
長谷川武治編: 微生物の分類と同定<下>; 学会出版センター: 東京, 1984.
[25]
Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J.; （室伏きみ子、関啓子監訳）: Brock 微生
物学; オーム社: 東京, 2003, pp. 49-102 (3. 細胞生物学).
[26]
駒形和男編: 微生物の化学分類実験法; 学会出版センター: 東京, 1982.
[27]
Zuckerkandl, E.; Pauling, L.: J. Theor. Biol. 1965, 8, 357.
[28]
長谷川政美; 岸野洋久: 分子系統学; 岩波書店: 東京, 1996.
[29]
根井正利; S.クマー; （大田竜也、竹崎直子共訳）: 分子進化と分子系統学; 培風館: 東
京, 2005.
[30]
Johnson, J. L.; Ordal, E. J.: J. Bacteriol. 1968, 95, 893.
[31]
Marmur, J.; Doty, P.: J. Mol. Biol. 1962, 5, 109.
[32]
Gollespie, D.; Spiegelman, K. E.: J. Mol. Biol. 1965, 12, 829.
[33]
金子太吉: 微生物の化学分類実験法; 駒形和男, 編; 学会出版センター: 東京, 1982, pp.
239-242 (2. GC 含量の測定).
[34]
江崎孝行: 日本の微生物分類
この 20 年 ; 微生物分類研究会, 編, 2000, pp. 12-16
(DNA の塩基組成と DNA 類似度).
[35]
鈴木健一郎: 微生物の分類・同定実験法; 鈴木健一郎, 平石明, 横田明, 編; シュプリン
ガー・フェアラーク東京: 東京, 2001, pp. 28-33 (II-3. DNA 塩基組成).
[36]
Schildkraut, C. L.; Marmur, J.; Doty, P.: J. Mol. Biol. 1961, 3, 595.
[37]
Wayne, L. G.; Brenner, D. J.; Colwell, R. R.; Grimont, P. A. D.; Kandler, O.;
Krichevsky, M. I.; Moore, L. H.; Moore, W. E. C.; Murray, R. G. E.; Stackebrandt, E.;
Starr, M. P.; Truper, H. G.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1987, 37, 463.
[38]
Woese, C. R.: Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1987, 51, 221.
[39]
Stackebrandt, E.; Goebel, B. M.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1994, 44, 846.
[40]
山口進康; 那須正夫: 日本 PDA 学術誌 GMP とバリデーション 2005, 7, 94.
[41]
Shuldiner, A. R.; Nirula, A.; Roth, J.: Nucleic Acids Res. 1989, 17, 4409.
[42]
Paabo, S.; Irwin, D. M.; Wilson, A. C.: J. Biol. Chem. 1990, 265, 4718.
- 33 -
[43]
Liesack, W.; Weyland, H.; Stackebrandt, E.: Microb. Ecol. 1991, 21, 191.
[44]
Vaneechoutte, M.: Mol. Biotechnol. 1996, 6, 115.
[45]
Olive, D. M.; Bean, P.: J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 1661.
[46]
Olson, M. V.: J. Chromatogr. 1989, 470, 377.
[47]
Bingen, E.; Barc, M. C.; Brahimi, N.; Vilmer, E.; Beaufils, F.: J. Clin. Microbiol.
1995, 33, 1657.
[48]
Keim, P.; Kalif, A.; Schupp, J.; Hill, K.; Travis, S. E.; Richmond, K.; Adair, D. M.;
HughJones, M.; Kuske, C. R.; Jackson, P.: J. Bacteriol. 1997, 179, 818.
[49]
Savelkoul, P. H. M.; Aarts, H. J. M.; de Haas, J.; Dijkshoorn, L.; Duim, B.; Otsen,
M.; Rademaker, J. L. W.; Schouls, L.; Lenstra, J. A.: J. Clin. Microbiol. 1999, 37,
3083.
[50]
Hermans, P. W.; van Soolingen, D.; Dale, J. W.; Schuitema, A. R.; McAdam, R. A.;
Catty, D.; van Embden, J. D.: J. Clin. Microbiol. 1990, 28, 2051.
[51]
河合常明; 廣地敬; 大谷倫子; 藤田晃三; 赤石尚一; 高瀬愛子; 品川雅明; 松本英伸: 札
幌市衛研年報 2003, 30, 47.
[52]
Montanaro, L.; Campoccia, D.; Arciola, C. R.: Biomaterials 2007, 28, 5155.
[53]
Yamamoto, S.; Harayama, S.: Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61, 1104.
[54]
Yamamoto, S.; Harayama, S.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1998, 48, 813.
[55]
Lonetto, M.; Gribskov, M.; Gross, C. A.: J. Bacteriol. 1992, 174, 3843.
[56]
Liu, H. S.; Li, Y.; Huang, X. X.; Kawamura, Y.; Ezaki, T.: Microbiol. Immunol. 2003,
47, 859.
[57]
Yamada-Noda, M.; Ohkusu, K.; Hata, H.; Shah, M. M.; Nhung, P. H.; Sun, X. S.;
Hayashi, M.; Ezaki, T.: Syst. Appl. Microbiol. 2007, 30, 453.
[58]
Itoh, Y.; Kawamura, Y.; Kasai, H.; Shah, M. M.; Nhung, P. H.; Yamada, M.; Sun, X.
S.; Koyana, T.; Hayashi, M.; Ohkusu, K.; Ezaki, T.: Syst. Appl. Microbiol. 2006, 29,
368.
[59]
Holt, J. G.; Krieg, N. R.; Sneath, P. H. A.; Staley, J. T.; Williams, S. T.: Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology Ninth Ed.; Williams & Wilkins: Baltimore,
1994.
- 34 -
[60]
石田康行: J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 2003, 51, 108.
[61]
瀬戸康雄: 分析化学 2006, 55, 891.
[62]
倉石衍: 微生物の化学分類実験法; 駒形和男, 編; 学会出版センター: 東京, 1982, pp.
87-182 (2 脂質).
[63]
Abel, K.; deSchmertzing, H.; Peterson, J. I.: J. Bacteriol. 1962, 85, 1039.
[64]
Reiner, E.: Nature 1965, 206, 1272.
[65]
Simmonds, P. G.: Appl. Microbiol. 1970, 20, 567.
[66]
Biemann, K.: J. Geophys. Res. 1977, 1977, 4641.
[67]
Glavin, D. P.; Schubert, M.; Botta, O.; Kminek, G.; Bada, J. L.: Earth. Planet. Sci.
Lett. 2001, 185, 1.
[68]
Mukhopadhyay, R.: Anal. Chem. 2007, 79, 7249.
[69]
Schulten, H. R.; Beckey, H. D.; Meuzelaar, H. L. C.; Boerboom, A. J. H.: Anal. Chem.
1973, 45, 191.
[70]
Meuzelaar, H. L. C.; Kistemaker, P. G.: Anal. Chem. 1973, 45, 587.
[71]
金子太吉: 微生物の化学分類実験法; 駒形和男, 編; 学会出版センター: 東京, 1982, pp.
294-308 (6 熱分解法).
[72]
Anhalt, J. P.; Fenselau, C.: Anal. Chem. 1975, 47, 219.
[73]
Shute, L. A.; Gutteridge, C. S.; Norris, J. R.; Berkeley, R. C. W.: J. Gen. Microbiol.
1984, 130, 343.
[74]
Kajioka, R.; Tang, P. W.: J. Anal. Appl. Pyrolysis 1984, 6, 59.
[75]
Voorhees, K. J.; Durfee, S. L.; Holtzclaw, J. R.; Enke, C. G.; Bauer, M. R.: J. Anal.
Appl. Pyrolysis 1988, 14, 7.
[76]
Deluca, S.; Sarver, E. W.; Harrington, P. D.; Voorhees, K. J.: Anal. Chem. 1990, 62,
1465.
[77]
Tas, A. C.; Vandergreef, J.; Dewaart, J.; Bouwman, J.; Tennoeverdebrauw, M. C.: J.
Anal. Appl. Pyrolysis 1985, 7, 249.
[78]
Tas, A. C.; Dewaart, J.; Bouwman, J.; Debrauw, M. C. T.; Vandergreef, J.: J. Anal.
Appl. Pyrolysis 1987, 11, 329.
[79]
Voorhees, K. J.; Durfee, S. L.; Updegraff, D. M.: J. Microbiol. Methods 1988, 8, 315.
- 35 -
[80]
Gutteridge, C. S.: Method. Microbiol. 1987, 19, 227.
[81]
Goodacre, R.; Kell, D. B.: Curr. Opin. Biotechnol. 1996, 7, 20.
[82]
Freeman, R.; Goodfellow, M.; Gould, F. K.; Hudson, S. J.; Lightfoot, N. F.: J. Med.
Microbiol. 1990, 32, 283.
[83]
Freeman, R.; Goodfellow, M.; Ward, A. C.; Hudson, S. J.; Gould, F. K.; Lightfoot, N.
F.: J. Med. Microbiol. 1991, 34, 245.
[84]
Freeman, R.; Gould, F. K.; Wilkinson, R.; Ward, A. C.; Lightfoot, N. F.; Sisson, P. R.:
Epidemiol. Infect. 1991, 106, 239.
[85]
Freeman, R.; Sisson, P. R.; Lightfoot, N. F.; McLauchlin, J.: Lett. Appl. Microbiol.
1991, 12, 133.
[86]
Orr, K.; Gould, F. K.; Sisson, P. R.; Lightfoot, N. F.; Freeman, R.; Burdess, D.: J.
Hosp. Infect. 1991, 17, 187.
[87]
Sisson, P. R.; Freeman, R.; Lightfoot, N. F.; Richardson, I. R.: Epidemiol. Infect.
1991, 107, 127.
[88]
Magee, J. T.; Hindmarch, J. M.; Nicol, C. D.: J. Med. Microbiol. 1991, 35, 304.
[89]
Freeman, R.; Sisson, P. R.; Jenkins, D. R.; Ward, A. C.; Lightfoot, N. F.; Obrien, S.
J.: Epidemiol. Infect. 1995, 114, 433.
[90]
Sisson, P. R.; Freeman, R.; Law, D.; Ward, A. C.; Lightfoot, N. F.: J. Anal. Appl.
Pyrolysis 1995, 32, 179.
[91]
Sultana, S.; Magee, J. T.; Duerden, B. I.: Clin. Infect. Dis. 1995, 20, S122.
[92]
上野民夫; 平山和雄; 原田健一; 編: バイオロジカルマススペクトロメトリー; 東京化学
同人: 東京, 1997.
[93]
原田健一; 田口良; 橋本豊; 編: 生命科学のための最新マススペクトロメトリー; 講談社
サイエンティフィク: 東京, 2002.
[94]
Gross, J. H.: Mass Spectrometry. A Textbook; Springer: Berlin, 2004.
[95]
佐藤浩昭: O plus E 2006, 28, 492.
[96]
Posthumus, M. A.; Kistemaker, P. G.; Meuzelaar, H. L. C.; Ten Noever de Brauw, M.
C.: Anal. Chem. 1978, 50, 985.
[97]
Beckey, H. D.: Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 1969, 2, 500.
- 36 -
[98]
Macfarlane, R. D.; Torgerson, D. F.: Science 1976, 191, 920.
[99]
Barber, M.; Bordoli, R. S.; Sedgwick, R. D.; Tyler, A. N.: Nature 1981, 293, 270.
[100]
Aberth, W.; Straub, K. M.; Burlingame, A. L.: Anal. Chem. 1982, 54, 2029.
[101]
Seydel, U.; Haas, M.; Rietschel, E. T.; Lindner, B.: J. Microbiol. Methods 1992, 15,
167.
[102]
Heller, D. N.; Cotter, R. J.; Fenselau, C.: Anal. Chem. 1987, 59, 2806.
[103] Heller, D. N.; Fenselau, C.; Cotter, R. J.; Demirev, P.; Olthoff, J. K.; Honovich, J.; Uy,
M.; Tanaka, T.; Kishimoto, Y.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987, 142, 194.
[104]
Yamashita, M.; Fenn, J. B.: J. Phys. Chem. 1984, 88, 4451.
[105]
Karas, M.; Bachmann, D.; Hillenkamp, F.: Anal. Chem. 1985, 57, 2935.
[106]
Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T.: Rapid Commun.
Mass Spectrom. 1988, 2, 151.
[107]
Karas, M.; Hillenkamp, F.: Anal. Chem. 1988, 60, 2299.
[108]
Fenn, J. B.; Mann, M.; Meng, C. K.; Wong, S. F.: Science 1989, 246, 64.
[109]
大谷肇; 佐藤浩昭: ぶんせき 2002, 668.
[110]
田中耕一: ぶんせき 1996, 253.
[111]
佐藤浩昭: 生命科学のための最新マススペクトロメトリー; 原田健一, 田口良, 橋本豊,
編; 講談社サイエンティフィク: 東京, 2002, pp. 17-33 (1-2 MALDI-MS).
[112]
Gross, J. H.: Mass Spectrometry. A Textbook; Springer: Berlin, 2004, pp. 411-440 (10
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization).
[113]
Krishnamurthy, T.; Ross, P. L.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996, 10, 1992.
[114]
Edwards-Jones, V.; Claydon, M. A.; Evason, D. J.; Walker, J.; Fox, A. J.; Gordon, D.
B.: J. Med. Microbiol. 2000, 49, 295.
[115]
Walker, J.; Fox, A. J.; Edwards-Jones, V.; Gordon, D. B.: J. Microbiol. Methods 2002,
48, 117.
[116]
Madonna, A. J.; Basile, F.; Ferrer, I.; Meetani, M. A.; Rees, J. C.; Voorhees, K. J.:
Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14, 2220.
[117]
Ishida, Y.; Madonna, A. J.; Rees, J. C.; Meetani, M. A.; Voorhees, K. J.: Rapid
Commun. Mass Spectrom. 2002, 16, 1877.
- 37 -
[118]
Lay, J. O.: Trac-Trend. Anal. Chem. 2000, 19, 507.
[119]
van Baar, B. L. M.: FEMS Microbiol. Rev. 2000, 24, 193.
[120]
Lay, J. O.: Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 172.
[121]
Fenselau, C.; Demirev, P. A.: Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 157.
[122]
Ho, Y. P.; Fenselau, C.: Anal. Chem. 1998, 70, 4890.
[123]
Williams, B. H.; Hathout, Y.; Fenselau, C.: J. Mass Spectrom. 2002, 37, 259.
[124]
Ishida, Y.; Kitagawa, K.; Nakayama, A.; Ohtani, H.: Appl. Environ. Microbiol. 2005,
71, 7539.
[125]
Ishida, Y.; Kitagawa, K.; Nakayama, A.; Ohtani, H.: J. Anal. Appl. Pyrolysis 2006,
77, 116.
[126]
大谷肇; 石田康行: 分析化学 2007, 56, 299.
[127]
Jones, J. J.; Stump, M. J.; Fleming, R. C.; Lay, J. O.; Wilkins, C. L.: J. Am. Soc.
Mass. Spectrom. 2004, 15, 1665.
[128]
駒形和男: 微生物の化学分類実験法; 駒形和男, 編; 学会出版センター: 東京, 1982, pp.
183-224 (3. 蛋白質).
[129]
信太治: 日本の微生物分類 この 20 年; 微生物分類研究会, 編, 2000, pp. 53-60 (タンパ
ク質).
[130]
Claydon, M. A.; Davey, S. N.; EdwardsJones, V.; Gordon, D. B.: Nat. Biotechnol.
1996, 14, 1584.
[131] Holland, R. D.; Wilkes, J. G.; Rafii, F.; Sutherland, J. B.; Persons, C. C.; Voorhees, K.
J.; Lay, J. O.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996, 10, 1227.
[132]
Welham, K. J.; Domin, M. A.; Scannell, D. E.; Cohen, E.; Ashton, D. S.: Rapid
Commun. Mass Spectrom. 1998, 12, 176.
[133]
Arnold, R. J.; Reilly, J. P.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1998, 12, 630.
[134]
Jarman, K. H.; Daly, D. S.; Petersen, C. E.; Saenz, A. J.; Valentine, N. B.; Wahl, K.
L.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999, 13, 1586.
[135]
Tao, L. D.; Yu, X. L.; Snyder, A. P.; Li, L.: Anal. Chem. 2004, 76, 6609.
[136]
Stackebrandt, E.; Pauker, O.; Erhard, M.: Curr. Microbiol. 2005, 50, 71.
[137] Krishnamurthy, T.; Ross, P. L.; Rajamani, U.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996,
- 38 -
10, 883.
[138]
Elhanany, E.; Barak, R.; Fisher, M.; Kobiler, D.; Altboum, Z.: Rapid Commun. Mass
Spectrom. 2001, 15, 2110.
[139]
Nilsson, C. L.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999, 13, 1067.
[140]
Demirev, P. A.; Lin, J. S.; Pineda, F. J.; Fenselau, C.: Anal. Chem. 2001, 73, 4566.
[141]
Haag, A. M.; Taylor, S. N.; Johnston, K. H.; Cole, R. B.: J. Mass Spectrom. 1998, 33,
750.
[142]
Majcherczyk, P. A.; McKenna, T.; Moreillon, P.; Vaudaux, P.: FEMS Microbiol. Lett.
2006, 255, 233.
[143]
Carbonnelle, E.; Beretti, J. L.; Cottyn, S.; Quesne, G.; Berche, P.; Nassif, X.; Ferroni,
A.: J. Clin. Microbiol. 2007, 45, 2156.
[144]
Lynn, E. C.; Chung, M. C.; Tsai, W. C.; Han, C. C.: Rapid Commun. Mass Spectrom.
1999, 13, 2022.
[145] Mandrell, R. E.; Harden, L. A.; Bates, A.; Miller, W. G.; Haddon, W. F.; Fagerquist, C.
K.: Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71, 6292.
[146]
Fagerquist, C. K.; Miller, W. G.; Harden, L. A.; Bates, A. H.; Vensel, W. H.; Wang, G.
L.; Mandrell, R. E.: Anal. Chem. 2005, 77, 4897.
[147]
Ryzhov, V.; Hathout, Y.; Fenselau, C.: Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 3828.
[148]
Chong, B. E.; Wall, D. B.; Lubman, D. M.; Flynn, S. J.: Rapid Commun. Mass
Spectrom. 1997, 11, 1900.
[149]
Conway, G. C.; Smole, S. C.; Sarracino, D. A.; Arbeit, R. D.; Leopold, P. E.: J. Mol.
Microbiol. Biotechnol. 2001, 3, 103.
[150]
Donohue, M. J.; Smallwood, A. W.; Pfaller, S.; Rodgers, M.; Shoemaker, J. A.: J.
Microbiol. Methods 2006, 65, 380.
[151] Donohue, M. J.; Best, J. M.; Smallwood, A. W.; Kostich, M.; Rodgers, M.; Shoemaker,
J. A.: Anal. Chem. 2007, 79, 1939.
[152]
Ruelle, V.; El Moualij, B.; Zorzi, W.; Ledent, P.; De Pauw, E.: Rapid Commun. Mass
Spectrom. 2004, 18, 2013.
[153]
Dieckmann, R.; Graeber, I.; Kaesler, I.; Szewzyk, U.; von Dohren, H.: Appl.
- 39 -
Microbiol. Biotechnol. 2005, 67, 539.
[154] Fedele, L.; Seraglia, R.; Battistotti, B.; Pinelli, C.; Traldi, P.: J. Mass Spectrom. 1999,
34, 1385.
[155]
孫麗偉; 佐藤浩昭; 鳥村政基; 田尾博明; 新谷智吉: 分析化学 2004, 53, 603.
[156]
Dickinson, D. N.; La Duc, M. T.; Haskins, W. E.; Gornushkin, I.; Winefordner, J. D.;
Powell, D. H.; Venkateswaran, K.: Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70, 475.
[157]
http://www.anagnostec.eu/products-services/saramis.html.
[158]
Maier, T.; Klepel, S.; Renner, U.; Kostrzewa, M.: Nat. Methods 2006, 3, i.
[159]
Domin, M. A.; Welham, K. J.; Ashton, D. S.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999,
13, 222.
[160]
Evason, D. J.; Claydon, M. A.; Gordon, D. B.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000,
14, 669.
[161]
Vaidyanathan, S.; Winder, C. L.; Wade, S. C.; Kell, D. B.; Goodacre, R.: Rapid
Commun. Mass Spectrom. 2002, 16, 1276.
[162]
Wang, Z. P.; Russon, L.; Li, L.; Roser, D. C.; Long, S. R.: Rapid Commun. Mass
Spectrom. 1998, 12, 456.
[163]
Saenz, A. J.; Petersen, C. E.; Valentine, N. B.; Gantt, S. L.; Jarman, K. H.; Kingsley,
M. T.; Wahl, K. L.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999, 13, 1580.
[164]
Williams, T. L.; Andrzejewski, D.; Lay, J. O.; Musser, S. M.: J. Am. Soc. Mass.
Spectrom. 2003, 14, 342.
[165]
Arnold, R. J.; Karty, J. A.; Ellington, A. D.; Reilly, J. P.: Anal. Chem. 1999, 71, 1990.
[166]
Wunschel, D. S.; Hill, E. A.; McLean, J. S.; Jarman, K.; Gorby, Y. A.; Valentine, N.;
Wahl, K.: J. Microbiol. Methods 2005, 62, 259.
[167]
Jackson, K. A.; Edwards-Jones, V.; Sutton, C. W.; Fox, A. J.: J. Microbiol. Methods
2005, 62, 273.
[168]
Vargha, M.; Takats, Z.; Konopka, A.; Nakatsu, C. H.: J. Microbiol. Methods 2006, 66,
399.
[169]
Liu, H. H.; Du, Z. M.; Wang, J.; Yang, R. F.: Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73,
1899.
- 40 -
[170]
Demirev, P. A.; Ho, Y. P.; Ryzhov, V.; Fenselau, C.: Anal. Chem. 1999, 71, 2732.
[171] Dai, Y. Q.; Li, L.; Roser, D. C.; Long, S. R.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999, 13,
73.
[172]
Holland, R. D.; Duffy, C. R.; Rafii, F.; Sutherland, J. B.; Heinze, T. M.; Holder, C. L.;
Voorhees, K. J.; Lay, J. O.: Anal. Chem. 1999, 71, 3226.
[173]
Wall, D. B.; Lubman, D. M.; Flynn, S. J.: Anal. Chem. 1999, 71, 3894.
[174]
Ryzhov, V.; Fenselau, C.: Anal. Chem. 2001, 73, 746.
[175]
Amiri-Eliasi, B. J.; Fenselau, C.: Anal. Chem. 2001, 73, 5228.
[176]
Pineda, F. J.; Antoine, M. D.; Demirev, P. A.; Feldman, A. B.; Jackman, J.;
Longenecker, M.; Lin, J. S.: Anal. Chem. 2003, 75, 3817.
[177]
Elliott, W. H.; Elliott, D. C.; (清水孝雄、工藤一郎訳): 生化学・分子生物学; 東京化学同
人: 東京, 1997, pp. 281-302 (22. タンパク質合成、細胞内輸送、分解).
[178]
Wittmann, H. G.: Annu. Rev. Biochem 1982, 51, 155.
[179]
Arnold, R. J.; Reilly, J. P.: Anal. Biochem. 1999, 269, 105.
[180]
寺本華奈江; 佐藤浩昭; 孫麗偉; 鳥村政基; 田尾博明: J. Mass Spectrom. Soc. Jpn.
2007, 55, 209.
[181]
Ochi, K.: J. Gen. Microbiol. 1989, 135, 2635.
[182]
Ochi, K.; Miyadoh, S.; Tamura, T.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1991, 41, 234.
[183]
Ochi, K.: Gene 1992, 115, 261.
[184]
Ochi, K.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1992, 42, 144.
[185]
Ochi, K.; Miyadoh, S.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1992, 42, 151.
[186]
Ochi, K.; Haraguchi, K.; Miyadoh, S.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1993, 43, 58.
[187]
Ochi, K.: Microbiol. 1994, 140, 2165.
[188]
Ochi, K.; Hiranuma, H.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1994, 44, 285.
[189]
Ochi, K.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1995, 45, 110.
[190]
Ochi, K.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1995, 45, 268.
[191]
Ochiai, K.; Uchida, K.; Kawamoto, I.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1993, 43, 69.
[192]
Ochiai, K.; Kawamoto, I.: Biosci., Biotechnol., Biochem. 1995, 59, 1679.
- 41 -
- 42 -
第
2
章
MALDI-MS による
リボソームタンパク質の測定条件
- 43 -
2-1
緒言
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(MALDI-MS)は、試料分子が「マト
リックス剤」と総称される化合物によって分散された微細結晶の表面に、レーザー光をパ
ルス照射することにより、試料分子を分解せずにソフトイオン化し、質量分析する技術で
ある[1-4]。この手法により、分子量が数万以上のタンパク質の質量を高感度かつ高精度で
解析することが可能であり、バクテリア菌体そのものを試料として用いることも、場合に
よっては可能であるため、バクテリアの属や種を容易に識別あるいは同定できる解析手法
として急速に発展してきたことは、既に第 1 章で詳述したとおりである。しかし、これま
でのところ、あらゆる試料に対して適用できる MALDI-MS の測定操作は確立されておら
ず、特にマトリックス剤の選択と試料/マトリックス混合結晶の調製が、観測されるマスス
ペクトルの質に大きく影響するため、試行錯誤的に測定条件を最適化する必要がある。し
かも、従来の指紋判定法によるバクテリア分析では、マススペクトル上で観測される何ら
かの菌体構成成分のピークを用いて解析が行われていたが、本研究ではリボソームタンパ
ク質をバイオマーカーとして用いるため、これを簡単な前処理で、かつ確実に MALDI マ
ススペクトル上で観測できる測定手順（プロトコル）を確立することが必須である。本章
では、MALDI-MS の測定原理、一般的な試料調製法、および測定システムの構成などを
述べながら、本研究で最適化したバクテリアのリボソームタンパク質を分析するための試
料調製法について詳述する。
2-2
2-2-1
MALDI-MS の測定原理
イオン化の機構
MALDI 法におけるイオン化の機構は複雑であり、いまだ不明な点も多く、現在でも様々
な角度から議論あるいは実験を通じて、そのメカニズムの詳細な解明が試みられている[1]。
Fig. 2-1 に、一般に考えられている MALDI-MS におけるイオン化のモデル[1-4]を示す。
試料プレート上に析出した試料/マトリックス混合結晶の表面に、レーザー光を数ナノ秒程
度の時間幅でパルス的に照射すると、マトリックス剤分子が光エネルギーを共鳴吸収して、
- 44 -
イオン化するとともに急速に加熱
Laser pulse
されて気化する。このとき、レーザ
Analyte molecules
ー照射による試料分子の直接的な
Matrix molecules
励起および気化はほとんど起こら
ないが、試料分子を取り囲んでいた
マトリックス剤分子が瞬時に気化
Absorption of UV radiation by
the matrix molecules
Desorption of analyte molecules
together with matrix molecules
Proton transfer to analyte
molecules
z
Sample
plate
z
z
することによって、結果として試料
分子もほとんど分解するこことな
く、ほぼ同時に気相に放出されるこ
とになる。続いて、イオン化したマ
+
+
e+
+
e-
To flight tube
H+
H+
H+
+
起こると、主にプロトン化分子[M +
+
H+
間でプロトンや電子などの授受が
+
+
+
H+
e-
トリックス剤分子と試料分子との
+
H + e-
H]+や脱プロトン化分子[M - H]-な
Fig. 2-1. Ion formation mechanism on MALDI
どのイオンが生じる。なお、脱離に
process.
先だってイオン化が起こっている
という考えもある。その他、ナトリウムやカリウムなどのイオン化しやすい金属元素が混
合結晶中に存在していると、これらの金属カチオンが試料分子に付加した[M + Na]+や[M
+ K]+などのイオンも形成される。そのため、プロトン化分子[M + H]+のピークを選択的に
観測したい場合には、こうした付加イオンの生成を抑制するために酸の添加や脱塩処理な
どが必要になる。本研究では、トリフルオロ酢酸(trifluoroacetic acid, TFA)を試料溶液に
添加した。
2-2-2 マトリックス剤
MALDI 法では、マトリックス剤の光イオン化反応を利用しているため、マトリックス
剤には、用いるレーザー光の波長（通常は窒素レーザー：337 nm）に吸収帯がある有機化
- 45 -
合物を選択する必要がある。さらに、マトリックス剤は、試料分子を分子レベルで分散さ
せる役割も担っているため、試料分子と親和性ができるだけ高いマトリックス剤を選択す
ることが重要である。
Table 2-1 に、生体関連物質の MALDI-MS 測定で使用される代表的なマトリックス剤の
化学構造、分子量、測定に適した試料、および典型的な試料調製法をまとめて示す[1-4]。
いずれのマトリックス剤も波長 337 nm の紫外光を吸収しやすい、分子内に多数の共役二
重結合を有する芳香族化合物である。これらの中で、タンパク質の分析には、2,5-ジヒド
ロキシ安息香酸(2,5-dihydroxybenzoic acid, DHB)、シナピン酸(sinapinic acid, SA)、2-(4ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸 [2-(4-hydroxyphenylazo)benzoic acid, HABA]などが
よく用いられる。また、ペプチドの分析には、DHB や α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸
(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)が汎用される。特殊なマトリックス剤であるが、
1,5-ジアミノナフタレン(1,5-diaminonaphtharene, DAN)は、タンパク質中のジスルフィ
ド結合を選択的に切断する効果を兼ね備えており、タンパク質の架橋構造の解析などに有
効である[2, 5]。本研究では、リボソームタンパク質の分析には SA を用い（2-3 節で詳述
する）、リボソームタンパク質の酵素消化断片の測定（3-1 節）には CHCA を用いた。さ
らに、リボソームサブユニットタンパク質中に存在するジスルフィド結合の解析（3-2 節）
には、DAN を用いた。
MALDI-MS 測定で、高感度かつ高分解能なマススペクトルを観測するためには、でき
るだけ均一な試料/マトリックス混合結晶の形成が要求されるため、その調製方法が測定結
果の良否を決定付けることが少なくない。タンパク質およびペプチドの一般的な試料調製
では、マトリックス溶液は 1.5 mL チューブに 10~15 mg のマトリックス剤を秤取して、
0.1%TFA を含む 50%アセトニトリル水溶液 1 mL を加えて調製する。このマトリックス
溶液とタンパク質あるいはペプチドなどの試料溶液を 4:1～100:1 程度の比で混合し、その
1 μL を試料プレートに滴下して、乾燥する。本研究で最適化した試料調製法については、
2-3-2 節で詳述する。
- 46 -
Table 2.1. Typical matrices for biological samples.
Matrix
Compound name;
Abbreviation
Molecular weight
Sinapinic acid; SA
MW = 224.07
Structural
formula
Applications
Preparation
concentration and solvent1)
･Proteins
10 mg/mL (70% ACN and 0.1%
TFA)
･Proteins
･Peptides
10 mg/mL (50% ACN and 0.1%
TFA)
･Small proteins
･Peptides
･Carbohydrates
10 mg/mL (water)
･Proteins
･Lipopolysaccharides
1 mg/mL (50% ACN)
･Oligonucleotides
Make 9/1 dilution of matrix/
diammonium citrate
･3-HPA 50 mg/mL (50% ACN)
･Diammonium citrate 50 mg/mL
in water
･Nucleic acids
･Oligonucleotides
Make 9/1 dilution of matrix/
diammonium citrate
･THAP 10mg/mL (50% ACN)
･Diammonium citrate 50 mg/mL
in water
･Peptides
･Disulfide-bonding
cleavage
10 mg/mL (50% ACN)
CH=CHCOOH
CH3 O
OCH3
OH
α-cyano-4-hydoroxycinnamic acid;
CHCA
MW = 189.04
CH=C(CN)COOH
OH
2, 5-dihydoroxybenzoic acid; DHB
MW = 154.03
COOH
OH
HO
2-(4-hydoroxyphenylazo)benzoic acid;
HABA
MW = 242.07
COOH
N N
OH
3-hydoroxypicolinic acid; 3-HPA
MW =139.03
COOH
OH
N
2,4,6-trihydroxyacetophenone; THAP
MW =168.04
COCH3
HO
OH
OH
1,5-diaminonaphthalene; DAN
MW =158.20
NH2
NH2
1) Abbreviations: ACN, acetonitrile, TFA, trifluoroacetic acid.
- 47 -
2-2-3
レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置
MALDI 法では、一度のレーザー照射によって生じるイオンの量はごくわずかであり、
しかもその質量数は数万以上にも及ぶことが少なくない。そのため、生じたイオンの大半
を検出器へと導入することができ、しかも原理的には測定質量範囲に制限がない飛行時間
型(time-of-flight, TOF)の質量分離部をもつレーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装
置(LDI-TOFMS)が最もよく用いられている[1-4]。本研究では、島津製作所製 AXIMA-CFR
plus を使用した。
Fig. 2-2 に、LDI-TOFMS の一般的な概略図とイオンの質量分離メカニズムを示す。基
本的な構成要素はいずれのメーカーの装置でも同じであり、窒素レーザー(N2 laser)とその
光 学 系 (prism, window) 、 試 料 プ レ ー ト (sample plate) と 加 速 用 グ リ ッ ド 電 極 (grid
electrode)を収容したイオン源(ion chamber)、レーザー光照射位置を観測する CCD カメ
ラ(CCD camera)、フライトチューブ(flight tube)、リフレクトロン(reflectron)、検出器
(detector)、真空ポンプ(vacuum pump)、および制御・データ収集用のコンピュータ
(computer)からなる。
Fig. 2-2a には、装置構成と共に、レーザー光の光路と、生成した試料イオンが検出され
るまでの軌道を示した。窒素レーザーからパルス発振された波長 337 nm の紫外レーザー光
は、プリズムや鏡などで光路を曲げ、光学窓を通じて高真空のイオン源内に導入され、試
料プレート上に塗布された試料/マトリックス混合結晶の表面に照射される。レーザー光照
射により MALDI 過程を経て生成した試料イオンは、試料プレートとグリッド電極との間
の電位差によって加速され、フライトチューブ内へ導入される。ここでイオンは、質量電
荷比(m/z)の違いに基づく飛行時間の違いよって質量分離され、検出器で検出される。
Fig. 2-2b は、TOFMS における各イオンの質量分離の原理を図示したものである。
MALDI 等のイオン化機構によってパルス的に生成したイオンは、自由運動が可能な荷電粒
子であり、サンプルプレート(sample plate)とグリッド電極(grid electrode)の電位差によっ
て、加速領域(acceleration region)で加速され、フライトチューブに引き出される。
- 48 -
(a)
Computer
Prism
N2 laser
Window
CCD camera
Flight tube
Sample
plate
Grid electrode
Orbit of ion
Vacuum pump
(b)
Ionization chamber
Acceleration
region
Detector in
Detector in
Vacuum reflector mode linear mode
pump
Drift path (L)
+
+
+
Detector
+
+
+
Sample
plate
Reflectron
+
+
+
Accelerating voltage Ground grid
(V0, typically 10～20 kV)
Int.
+
+
+
m/z
Fig. 2-2. Schematic diagram of LDI-TOF mass spectrometer (a), and separation
mechanism of ions in TOFMS (b).
このとき、イオンの加速エネルギーと運動エネルギーの間には、エネルギー保存の法則が
成立する。
zeV 0 =
1
muv 2
2
･･･････････ (1)
- 49 -
但し、
z : イオンの電荷の数 (無次元)
e : 素電荷 (1.6 × 10-19 C)
V0 : 電位差 (V)
m : イオンの質量 (無次元)
u : 統一原子質量 (1.66 × 10-27 kg)
v : イオンの速度 (m/s)
式(1)を、イオンの速度 v (m/s)を求める式に変形すると、式(2)が得られる。
⎛ e ⎞⎛ z ⎞
v = 2V0 ⎜ ⎟⎜ ⎟
⎝ u ⎠⎝ m ⎠
･･･････････ (2)
速度 v (m/s)で距離 L (m)のドリフト長(drift path)をもつフライトチューブを飛行するイオ
ンが、加速されてから検出器に到達するまでの時間 t (s)は、次の式で求めることができる。
t=
L
v
･････････(3)
式(3)に、式(2)を代入すると、式(4)が得られる。
t=L
1 ⎛ u ⎞⎛ m ⎞
⎜ ⎟⎜ ⎟
2V0 ⎝ e ⎠⎝ z ⎠
･････････(4)
ここで、右辺の m および z 以外は、全て測定条件で決まる定数であるので、これを k とお
くと、式(5)が得られる。
t = k m/z
･････････(5)
この式(5)から、m/z 値が小さいイオンほど高速で自由飛行領域を飛行して早く検出器に到
達し、逆に m/z 値が大きいイオンは時間がかかることがわかる。このように、TOFMS で
は、m/z 値の違いによってイオンの飛行する時間が異なることを利用して質量分離を行い、
マススペクトルを得る。
TOFMS における質量分離モードには、イオン源から検出器までイオンを直線的に飛行さ
せる「リニアーモード(linear mode)」と、検出器に到達する前にイオンを静電界ミラー（リ
フレクトロン, reflectron）を用いて反転させる「リフレクターモード(reflector mode)」が
ある(Fig. 2-2a)。リニアーモードでは、加速されたイオンは慣性の法則にしたがって直線的
に等速飛行する。そのため、フライトチューブ内で分解あるいは中性化したイオンも、も
- 50 -
とのイオンと同じ速度で飛行し続けて検出器に到達するので、高感度測定に適している。
しかし、レーザー照射によって脱離した試料分子のイオンは、ある程度初期運動エネルギ
ーに分布をもって生じるため、そのままイオンを加速すると、その分布が観測されるピー
クの広がりに反映されることになり、高分解能測定を行うことが困難になる。したがって、
リニアーモードを用いた測定は、主として分子量が数千～数万以上のタンパク質の分析に
用いられ、得られる解析値は、イオンを構成する同位体元素の平均質量（原子量）から求
められる「平均質量(average mass)」である。本研究では、リボソームタンパク質の測定に
は、リニアーモードを利用した。
一方、リフレクターモードでは、リフレクトロンを用いてイオンを反転させることにと
って、分解能の低下の原因となる初期運動エネルギーのばらつきを収束し、高分解能測定
を行うことができる。但し、飛行途中で分解や中性化が起こりやすいタンパク質などの高
質量のイオンは、リフレクトロンで折り返すことができないため、ピークはほとんど観測
されなくなる。そのためリフレクターモードは、一般に分子量が数千までの試料に対して、
同位体ピークまで分離して、
「モノアイソトピック質量(monoisotopic mass)」を精密に測定
する目的で用いられている。本研究では、リボソームタンパク質をトリプシンで酵素消化
して得られたペプチド断片を測定する際に、リフレクターモードを利用した（3-1 節）。
なお、リフレクターモードでは、飛行途中で分解したイオンの軌道が検出器に到達する
ようにリフレクターの印加電圧を調整することによって、ポストソース分解(post-source
decay, PSD) あ る い は 衝 突 誘 起 解 離 (collision induced dissociation, CID) を 利 用 し た
MS/MS 測定を行うことができる。この技法は、MALDI-TOFMS によってペプチドのアミ
ノ酸配列などを解析する上で重要である。本研究では、リボソームタンパク質をトリプシ
ンで酵素消化して得られたペプチド断片を測定する際に、上記のリフレクターモードでの
測定と共に CID-MS/MS 測定を行った（3-1 節）。
2-3 リボソームタンパク質の分析条件の最適化
2-3-1
バクテリア試料の調製
- 51 -
(a) バクテリア試料
本研究では、主として乳酸菌の全ゲノム解読株をモデルバクテリアとして用いて、リボ
ソームタンパク質をバイオマーカーとした MALDI-MS によるバクテリアの分析法を開発
するための基礎検討を行った。乳酸菌は、ヨーグルトや漬物などの伝統的な発酵食品の製
造や醸造などに用いられている代表的な有用バクテリアであるため、比較的多くの種類の
乳酸菌が全ゲノム解読されており、その多くは菌株分譲機関から入手することができる。
しかも、乳酸菌のほとんどは、安全に取り扱うことができ、培養が容易である。乳酸菌に
属するバクテリアは、Lactobacillus 属、Lactococcus 属、Streptococcus 属、Leuconostoc
属、Pediococcus 属など多岐にわたるが、いずれも比較的硬い細胞壁をもつグラム陽性菌
であるため、リボソームタンパク質を菌体から抽出する際に破砕処理が必要となる。すな
わち、乳酸菌のリボソームタンパク質のマススペクトルを高感度で観測することができる
前処理条件を最適化すれば、その条件は乳酸菌以外のバクテリアの前処理への応用が容易
になると考えられる。しかも、グラム陽性菌のリボソームタンパク質のキャラクタリゼー
ションは、著者の知る限り報告されておらず、タンパク質の構造解析の観点からも興味深
い。
なお 4-1 節で述べるバクテリアの分子系統解析では、グラム陰性菌である Pseudomonas
(P.) putida を解析対象とした。P. putida は、代表的な環境微生物で、株レベルでの多様性
が豊富であることから、DNA ジャイレースサブユニット B 遺伝子(gyrB)を用いたバクテ
リアの株レベルでの分子系統分類が初めて適用されたバクテリアでもある[6, 7]。そのため、
MALDI-MS による分子系統分類の解析結果を、gyrB を用いた遺伝子解析の結果と比較・
検証するために、モデルバクテリアとして P. putida を選択した。
(b) 試料バクテリアの培養と菌体懸濁液および菌体破砕液の調製
本研究で用いた乳酸菌は、いずれも乳酸菌の培養に汎用される de Man-Rogosa-Sharpe
(MRS)液体培地を用いて、各菌株の至適温度にて 18 時間培養した。Table 2-2 に MRS 培
地の組成を示す。一方、4-1 節で用いた P. putida は、分譲機関から指定された培地を用い
- 52 -
て各菌株の至適温度にて 18 時間
培養した（詳細は、4-1 節で述べ
る）。
増殖した菌体は、Table 2-3 に示
す組成の TMA-I 緩衝液 用いて 2
回遠心洗浄した。次に、菌体湿重
量 1 g に対して TMA-I 緩衝液 5
mL を加えて菌体を分散させ、菌
体懸濁液とした。この菌体懸濁液
700 μL と 0.1 mm のビーズ 700
Table 2-2. Composition of MRS medium.
Components
Amounts
Peptone
10 g
Meat extract
10 g
Yeast extract
5g
Glucose
20 g
Tween 80
1g
K2HPO4
2g
Sodium acetate
5g
Diammonium hydrogencitrate
2g
MgSO4·7H2O
0.2 g
MnSO4·nH2O
0.05 g
Distilled water
1L
pH 6.0 - 6.5.
μL を容量 2 mL のチューブに移し
Table 2-3. Composition of TMA-I buffer.
て菌体破砕装置によりビーズ破砕
した。当初は、産業技術総合研究
所生物機能工学研究部門の鎌形洋
一研究グループ長（現、産総研ゲ
Components
Concentrations
tris(hydroxymethyl)aminomethane
10 mM
(Tris)
NH4Cl
30 mM
MgCl2
10 mM
2-mercaptoethanol
6 mM
HCl
adjust to pH 7.8
ノムファクトリー研究部門長）の
厚意により、ビーズ破砕機
（FastPrep 製 FP120）を借用して、ガラス製のビーズ（直径 0.1 mm、BioSpec Products
製）で 600 rpm で 20 秒間の破砕を 4 回繰り返す工程で菌体破砕を行った（3-1 節）
。その
後、Bartles-ville 製のビーズ破砕機(Biospec mini bead-beater-8)を購入して、ビーズの種
類と破砕条件を最適化し、最終的にジルコニアシリカ製のビーズ（直径 0.1 mm, BioSpec
Products 製）で、3000 rpm で 20 秒間の破砕を 4 回繰り返す工程を採用した。この破砕
により得た試料溶液を、遠心分離機（トミー精工製 MX300）を用いて遠心分離（5800 g、
2 分間）し、ビーズと未破砕の細胞および大きな細胞断片（デブリ）を除去して、菌体破
砕液の試料を得た。この菌体破砕液は、MALDI-MS による測定とリボソームタンパク質
の精製に用いた。
- 53 -
(c) リボソームタンパク質の精製
本研究では、タンパク質データベースに登録されている各リボソームサブユニットタン
パク質の翻訳アミノ酸配列情報を検証するために、リボソームタンパク質画分を精製して
MALDI-MS 測定を行った。その調製フローチャートを、Fig. 2-3 に示す。
70S リボソームは、Kurland[8]と Traub ら[9]の方法に基づいて、前項(b)で調製した菌
体破砕液(cell lysate)から精製した。なお、本実験では試料溶液は原則として氷浴上で取り
扱い、遠心分離および超遠心分離は全て 4℃にて行った。まず、菌体破砕液を遠心分離（5800
g、20 分間）してデブリを十分に沈殿除去し、次に上静を超遠心分離機（日立製作所製 himac
55P-72）を用いて超遠心分離（80000 g、6 時間）して、粗精製の 70S リボソームを沈殿
物として得た。粗精製の 70S リボソームに TMA-I 緩衝液 1 mL を加えて懸濁し、これを
超遠心分離用のチューブ内で 30%ショ糖を含む TMA-I 緩衝液に重層して、再度、超遠心
分離（45000 g、16 時間）し、70S リボソームを精製した。
70S リボソームからリボソームサブユニットタンパク質を単離･精製する工程は、Hardy
らの方法[10]を改良した方法を用いて行った。まず、70S リボソームの沈殿物に、トリス
ヒドロキシアミノメタン(10 mM)と塩酸から構成されるトリス塩酸緩衝液(Tris-HCl
buffer, pH 7.8)を 3 mL 加えて懸濁し、さらに超音波処理により均質化した。次に、70S
リボソームから rRNA を酸抽出により除去するために、70S リボソーム懸濁液に、0.3 mL
の 1 M 酢酸マグネシウム水溶液（Hardy の方法では塩化マグネシウム水溶液）と 6.6 mL
の酢酸を加え、2 時間撹拌した。これを遠心分離（5800 g、40 分間）し、rRNA を沈殿除
去した。上清に約 90 mL のアセトンを加えてから-20℃で一晩静置し、リボソームタンパ
ク質の凍結物（acetone powder という）を生成させた。これを遠心分離（5800 g、40 分
間）して、リボソームタンパク質の沈殿物を得た。最後に、脱塩するために、この沈殿物
を 3 mL の 2%酢酸水溶液に再溶解し、
透析膜（Spectrum Laboratories 製 Float-A-Lyzer、
分画分子量 100）を用いて透析し、精製リボソームタンパク質画分を得た。
- 54 -
Cell lysate
Centrifugation
(5800 g, 4 ºC, 20 min)
Supernatant
Precipitate
(debris)
Ultracentrifugation
(80000 g, 4 ºC, 6 h)
Supernatant
Precipitate
(crude 70S ribosome)
TMA-I buffer (1 mL)
Adding on a 30% sucrose TMA-I buffer
Ultracentrifugation
(45000 g, 4 ºC, 16 h)
Precipitate
(purified 70S ribosome)
Supernatant
10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8, 3 mL)
Homogenize (sonication)
1 M Mg acetate (0.3 mL)
Acetic acid (6.6 mL)
Stirring (2h)
Centrifugation (5800 g, 4 ºC, 40 min)
Precipitate
(rRNA)
Supernatant
(ribosomal proteins)
Acetone (ca. 90 mL)
Standing for overnight at -20 ºC
Acetone powder
(frozen ribosomal proteins)
Centrifugation (5800 g, 4 ºC, 40 min)
Supernatant
Precipitate
(ribosomal proteins)
2% acetic acid (3 mL)
Dialysis (2% acetic acid)
Purified ribosomal protein fraction
Fig. 2-3. Preparation procedure of ribosomal protein fraction.
- 55 -
2-3-2
(a)
MALDI-MS によるリボソームタンパク質の測定方法の最適化
マトリックス剤の選択および試料スポット調製法の最適化
MALDI-MS では、測定試料に応じたマトリックス剤の種類および混合結晶の調製法を
予備検討し、最適化する必要がある。MALDI-MS によるタンパク質の測定例は豊富で、
試料調製法は概ね確立されているが、リボソームサブユニットタンパク質は塩基性タンパ
ク質が多く、質量が 4000～30000 程度に広く分布しているため、従来のタンパク質測定
の条件が最適であるとは限らない。そこで、全てのリボソームサブユニットタンパク質の
分子量が明らかな大腸菌(Escherichia coli) K12 株のリボソームタンパク質をモデル試料
として用い、Table 2-1 に示したマトリックス剤の中から、タンパク質の分析で一般に用
いられる SA、DHB、CHCA、および HABA を用いて、MALDI-MS の測定条件を最適化
した。なお、各マトリックス剤は、いずれも 1%TFA を含む 50%アセトニトリル水溶液に
溶解し、10 mg/mL のマトリックス溶液とした。
Fig. 2-4 に、各マトリックス剤を用いて測定した、m/z 4000～20000 の範囲の MALDI
マススペクトルを比較して示す。なお、E. coli のリボソームサブユニットタンパク質とし
て帰属されたピークに印(●)を付した。いずれのマトリックス剤を用いた場合でも、ピー
クを観測することができたが、帰属されたリボソームサブユニットタンパク質の数は、SA
で 41 種類、DHB で 21 種類、CHCA で 18 種類、および HABA では 13 種類であった。
SA では、主として 1 価の[M + H]+イオンが観測され、最も多くのリボソームサブユニ
ットタンパク質が観測された。m/z 4000～20000 の範囲で本来観測されるべきリボソーム
サブユニットタンパク質の数は 46 種類であるが、近接したピークの分離が困難であった
ことと、一部のリボソームサブユニットタンパク質が観測されにくいこと（第 3 章で詳述）
を考慮すると、SA を用いればほぼ全てのリボソームサブユニットタンパク質を観測する
ことができる。しかし、試料スポット内およびスポット間で結晶の状態が異なっており、
特定の場所でピーク強度が強く観測される「スイートスポット」が存在した。また、DHB
を用いて調製した試料スポットでは、スイートスポットが特に生じやすく、針状結晶部分
のごく限られた場所にレーザー光が照射された場合にのみ、ピークが観測された。しかも、
- 56 -
% Int.
×10
(a) 100
0
(b) 100
0
(c) 100
0
(d) 100
0
5000
10000
m/z
15000
20000
Fig. 2-4. MALDI mass spectra of E. coli K12 using SA (a), DHB (b), CHCA (c), and
HABA (d).
m/z 10000 以上の範囲では、ほとんどピークが観測されなかった。また、CHCA と HABA
では、レーザー照射位置に関わらず比較的均一にピークが観測された。しかしながら、
CHCA は多価イオンが生じやすいため、マススペクトルが複雑化するという問題点があっ
た。また HABA では、マトリックス剤のクラスターイオンが高質量側までかなり強く観
測され、その影響でベースラインが平滑にならず、ピークの形状は、他のマトリックス剤
を用いた場合と比べて不明確であった。
- 57 -
以上の結果から、広い m/z 範囲で最も多くのリボソームサブユニットタンパク質を明確
なピークとして観測することができた SA が、バクテリアの同定分類に最も適したマトリ
ックス剤であると判断した。しかしながら、SA はスイートスポットが生じやすく、実用
化を目指した際に必要となる自動分析にはあまり適していない。そこで、マトリックス剤
と測定試料の混合溶液の調製法や、試料/マトリックス混合結晶の析出法を検討し、レーザ
ー照射位置に依存せずに安定してピークを観測することができる試料調製法の開発を試
みた。
試料/マトリックス混合結晶の調製法にはいくつかの方法があるが、その代表的な調製法
には、混合溶液を試料プレートに滴下して自然乾燥させるだけの dried droplet 法と、試料
プレート上に滴下した混合溶液をピペットチップ先端で撹拌しながら結晶を析出させる
crash crystal 法[11]がある。本研究ではさらに、試料溶液とマトリックス剤溶液を混合す
る過程で、ピペットの吸引により泡立てるほど激しく撹拌した後、試料/マトリックス混合
溶液を滴下して結晶を析出させる、dried droplet 改良法を検討した。
Table 2-4 に、crash crystal 法、dried droplet 法、および dried droplet 改良法で調製し
た試料スポットについて、調製手順、結晶の電子顕微鏡写真、スポット内のピーク強度分
布、観測ピークの形状（低質量側、高質量側）、および同一箇所にレーザー光を繰り返し
照射した際のピーク強度の持続性をそれぞれ比較して示す。Crash crystal 法では、様々な
形状と大きさの結晶が析出しており、スポット内でピークが観測される箇所は半数程度で、
ピーク強度はあまり持続せず、ピーク分解能も低かったため、正確な質量の測定には適し
ていないと判断した。一方、dried droplet 法では、比較的大きな六角柱あるいは板状の結
晶が形成されており、観測されたピークの分解能は比較的良好で、十分解析に用いること
ができる。また、ピーク強度の持続性も、crash crystal 法を用いた場合よりも長かった。
しかしながら、ピークが観測できる箇所は限られており、スイートスポットを試行錯誤的
に探索する必要がある。
一方、試料溶液とマトリックス溶液を激しく撹拌しながら混合し、試料プレートに滴下
して風乾させた dried droplet 改良法では、比較的小さい六角柱の結晶がスポット全体に均
- 58 -
Table 2-4. Comparison of preparative method of sample spot using SA matrix.
Modified dried
droplet
Dried droplet
Crash crystal
The sample/matrix
Crystal preparation solution was　deposited
procedure
with stirring using
pipette tip to crash
deposited crystals.
*High sensitive
method for peptide
analysis.
The sample/matrix
solution was simply
deposited on the
sample plate, and air
dried.
*Most popular method
for protein analysis.
The sample/matrix
solution was
vigorously mixed,
deposit on the sample
plate, and air dried.
*Developed in this
study.
Morphology of
matrix crystals
100 μm
1mm
4350
m/z
4380
ΔM/M = 530
13700
13800
m/z
ΔM/M = 242
8
4
S11
4350
m/z
12
Int. (arb. unit)
Stability of peak
intensity at the
same laser spot
L36
S11
4380
ΔM/M = 531
L36
13700
13800
m/z
ΔM/M = 747
12
Int. (arb. unit)
L36
8
4
0
0
1 3 5 7 9
Laser shots (×10)
1 3 5 7 9
Laser shots (×10)
S11
4350
m/z
4380
13700
13800
m/z
ΔM/M = 530 ΔM/M = 1053
12
Int. (arb .unit)
1mm×1mm
(100 mm intervals)
Intensity: Strong
Middle
Weak
L36： m/z 4365.4
S11： m/z 13727.7
100 μm
1mm
Distribution of peak
intensities using
raster scan mode
Resolution of
observed peaks
100 μm
8
4
0
1 3 5 7 9
Laser shots (×10)
一に分布していた。しかも、スポット内のピーク強度分布は均一かつ高強度であり、低質
量側および高質量側とも分解能が高いマススペクトルが得られたうえ、ピーク強度の持続
性も極めて良好であった。リボソームサブユニットタンパク質はリボソーム粒子を形成す
- 59 -
るために各分子間の結合力が強く、しかもその多くは、rRNA とも結合するため塩基性タ
ンパク質である。そのため、酸性マトリックスである SA の溶液と混合して、通常よりも
十分に激しく撹拌することにより、個々のサブユニットタンパク質が解離し、乾燥過程で
マトリックス剤にまんべんなく包み込まれ、比較的均一な結晶が析出したのではないかと
考えられる。
以上の結果から、本研究では、SA をマトリックス剤として用い、dried droplet 改良法
により試料スポットを調製することにより、リボソームサブユニットタンパク質のマスス
ペクトルを観測することにした。
(b)
キャリブレーション
マススペクトルのキャリブレーションは、まずミオグロビン(myoglobin, horse hart)の
[M + H]+ (m/z 16952.6)と[M + 2H]2+ (m/z 8476.8)、および副腎皮質刺激ホルモン
(adrenocorticotropic hormone, ACTH)の断片 18-39 の[M + H]+ (m/z 2465.7)の各ピークを
用いて、外部標準法および内部標準法で行った。さらに、翻訳アミノ酸配列情報が入手で
きる菌株の測定では、内部標準を加えずに MALD-MS 測定を行い、質量が推測できるピ
ークで内部キャリブレーションをする「自己キャリブレーション法(self-calibration)」[12]
により解析を行った。自己キャリブレーション用のピークは、あらかじめ内部標準を加え
た測定によって帰属されたピークの中から、ピーク強度が比較的強く、他のピークと重複
がないものを選択した。自己キャリブレーションで用いたピーク質量の検証は、各ピーク
の 2 価イオン([M + 2H]+)が所定の m/z 値に観測されることを確認して行った。
以上のように最適化し、以降の測定で用いた試料調製および MALDI-TOFMS の測定条
件を、Table 2-5 にまとめて示す。
- 60 -
Table 2-5. Typical experimental conditions for the observation of ribosomal proteins
by MALDI-MS.
Preparation of matrix solution
Matrix: sinapinic acid (Wako, MALDI grade)
Concentration: 10 mg/mL in 50% acetoritrile with 1% TFA
Preparation of sample/matrix co-crystals
Mixing ratio of sample/matrix solution: typically 1/7 v/v (depending on the sample)
Amount of applied sample/matrix solution: 1.5-2.0 μL (depending on the sample)
Co-crystal deposition: modified dried droplet (see Table 2-4)
TOFMS instrument settings
Instrument: Axima-CFR plus (Shimadzu)
Laser: N2 laser (337 nm, 3 ns pulse, 10 Hz)
Acceleration voltage: 20 kV
Flight path: 1.2 m (linear)
Ion focus: optimized for m/z 20000
Laser shots: 500 shots for 450 mm squire using a laster scan mode (50 μm step,
10 × 10 × 5 shots) (depending on the sample)
Observed m/z range: 4000-40000
Calibration method
First step: external calibration using myoglobin ([M + H]+ at m/z 16952.6 and
[M + 2H]2+ at m/z 8476.8) and ACTH clip 18-39 ([M + H]+ at m/z 2465.7).
Second step: internal calibration using the same calibrants above.
Final step: self-calibration using surely assigned ribosomal subunit proteins.
2-3-3
リボソームタンパク質のピーク帰属法
リボソームタンパク質の観測ピークの帰属は、まず公共タンパク質データベースからイ
ンターネットを利用して翻訳アミノ酸配列を入手し、あらかじめ解析対象となるバクテリ
アについて、基準となる各リボソームサブユニットタンパク質の計算質量を求め、リスト
化する。そして、計算質量と観測質量を比較しながら、各ピークを帰属する。タンパク質
データベースの概要と、計算質量のリスト化とピークの帰属までの具体的な手順を以下に
記す。
- 61 -
(a)
タンパク質データベース
Fig. 2-5 に、世界の DNA データバンクおよびタンパク質データベースの関係を示す。
バクテリアの全ゲノム解読が完了すると、世界三大 DNA データバンクのいずれかに、DNA
塩基配列および遺伝子領域であると推定される塩基配列および遺伝子名などの注釈（アノ
テーション）を登録する。DNA データバンクは、日本の国立遺伝学研究所の生命情報・
DDBJ 研究センター (Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan,
CIB-DDBJ)が管理する日本 DNA データバンク（DNA Data Bank of Japan, DDBJ）[13]、
Japan
(CIB-DDBJ/NIG)
DDBJ database
Whole genome
sequence
Registration
International Nucleotide
Sequence Databases
Europe
(EBI/EMBL)
EMBL database
USA
(NCBI/NLM)
GenBank database
Translation
and annotation
Translation and annotation
ExPASy Proteomics Server (SIB)
UniProt Knowledgebase (universal protein resource)
･Swiss-Prot; protein sequence database (high-level
annotation).
･TrEMBL; protein sequence database (computerannotated supplement of Swiss-Prot).
Other databases such as PROSITE, SWISS-2DPAGE,
ENZYME, and SWISS-MODEL Repository.
Abbreviations
DDBJ:
CIB-DDBJ:
NIG:
NCBI:
NLM:
EMBL:
EBI:
ExPASy:
SIB:
Entrez
NCBInr:
non-retardant protein
sequence database
Other databases such as
protein structures,
taxonomy, and others.
DNA Data Bank of Japan.
Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan.
National Institute of Genetics (Japan).
National Center for Biotechnology Information (USA).
National Library of Medicine (USA).
European Molecular Biology Laboratory.
European Bioinformatics Institute.
Expert Protein Analysis System.
Swiss Institute of Bioinformatics.
Fig. 2-5. Relationship between three major international nucleotide sequence
databases and protein sequence databases.
- 62 -
米 国 の 国 立 衛 生 研 究 所 (National Institute of Health, NIH) 傘 下 の 国 立 医 学 図 書 館
(National Library of Medicine, NLM)に属する国立バイオテクノロジー情報研究センター
(National Center for Biotechnology Information, NCBI)が管理する GenBank データベ
ース[14]、および欧州分子生物学研究所(European Molecular Biology Laboratory, EMBL)
に属する欧州バイオインフォマティックス研究所(European Bioinformatics Institute,
EBI)が管理する EMBL データベース[15]により構成されており、各データベース間で登
録情報は共有される。続いて、タンパク質をコードしている遺伝子領域であると判断され
た DNA 塩基配列(open reading frame, ORF)は、アミノ酸配列に翻訳され、タンパク質の
名称や推定される機能などの注釈と共にタンパク質データベースに登録される。その代表
的なものとして、EMBL の登録遺伝子配列を翻訳した TrEMBL とその登録情報を検証し
てまとめられた Swiss-Prot（いずれも UniProt Knowledgebase[16]に包括収録されてい
る）、および GenBank の登録遺伝子配列を翻訳したアミノ酸配列と Swiss-Prot などの情
報をまとめて整理した NCBInr[17]が挙げられる。
それらのなかでも、Swiss-Prot は、専門家が TrEMBL の登録情報を検証した上で、信
頼性が確認できたデータを TrEMBL から移行して構築したものであるため、一般に登録
情報に誤りが少ないといわれている。しかも、個々のエントリーに対して、各タンパク質
の構造および機能あるいはバクテリア種の情報に関する注釈（アノテーション）や、EMBL
（遺伝子）、PDB（立体構造）、および PROSITE（機能に重要なアミノ酸配列）など、様々
なデータベースへのリンクがまとめられており、そのタンパク質に関する多彩な情報を入
手することができる。一方、NCBInr では、1 種類のタンパク質に対して、Swiss-Prot を
含めた複数のデータベース情報が重複して登録されている。そのため本研究では、基本的
に登録情報の重複がない、Swiss-Prot/TrEMBL タンパク質データベースから翻訳アミノ
酸配列情報を取得した。
(b)
リボソームサブユニットタンパク質の計算質量のリスト化
Swiss-Prot/TrEMBL タンパク質データベースに登録されている情報を検証するために、
- 63 -
各ゲノム解読株のリボソームサブユニットタンパク質の翻訳アミノ酸配列を入手し、計算
質 量 を 求 め て リ ス ト 化 す る 。 こ こ で は 、 3-1 節 で 解 析 を 行 う ゲ ノ ム 解 読 株 で あ る
Lactobacillus (Lb.) plantarum NCIMB 8826 のリボソームの L35 サブユニットタンパク
質を例にして、計算質量の求め方を説明する(Fig. 2-6)[18]。
(1) Obtain the amino acid sequences of ribosomal subunit proteins from protein databases such as
Swiss-Prot/TrEMBL protein databases.
Example: L35 of Lb. plantarum NCIMB 8826.
MPKQKTNRAA AKRFKVTAKG KIKSANAFTS HRFHGKTKKQ
RRQLRGTAII EKPMVKTYHK LLQK
(2) Calculate the average mass.
7418.89 Da
(3) Consider N-terminal methionine loss.
The 2nd amino acid residue is P ⇒ Met loss
7418.89 - 131.19 = 7287.70
N-terminal rule.
N-terminal methionine is cleaved if the
2nd amino acid residue is as follows:
G (Gly）, A （Ala）, S （Ser）, P （Pro）,
V (Val）, T （Thr）, and C （Cys）
(4) Calculate the mass of [M+H]+ ion.
7287.70 + 1.01 = 7288.71
(5) Make the list of the calculated masses for all ribosomal subunit proteins.
Ribosomal subunit
name
L1
L2
L3
・
・
・
L34
L35
L36
・
calculated masses
of [M + H]+ ions
24640.13
30061.47
22566.87
・
・
・
4745.42
7288.71
4558.62
・
Fig. 2-6. Procedure for preparing the list of calculated masses of ribosomal subunit
proteins [18].
1)
Swiss-Prot/TrEMBL などのタンパク質データベースから、インターネット経由で解
析対象となるバクテリアのリボソームタンパク質の翻訳アミノ酸配列を入手する。Lb.
plantarum NCIMB 8826 の L35 サブユニットタンパク質は、Swiss-Prot ではアクセ
ッション番号 Q88WU7 で登録されており、Fig. 2-6 に示すような 64 アミノ酸残基か
ら構成されている。
- 64 -
2)
翻訳アミノ酸配列から質量を計算する。L35 場合、7418.89 Da である（有効桁は小
数点以下 2 桁で計算する）。実際には、ExPASy Proteomics Server（Fig. 2-5 参照）
の Compute pI/Mw tool [19]に、アミノ酸配列あるいは Swiss-Prot/TrEMBL のアクセ
ッション番号を一括入力して求めた。
3)
翻訳後修飾として、N 末端メチオニン残基の切断の有無を検討する。N 末端メチオ
ニン残基は、2 番目のアミノ酸残基がグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、プロリ
ン(P)、バリン(V)、スレオニン(T)、システイン(C)のいずれかである場合に選択的に切
断されやすいことが経験的に知られている（N 末端側、下記参照）[12, 20]。L35 では、
2 番目のアミノ酸残基がプロリン(P)であり、N 末端メチオニン残基の切断が起こると
推測できるので、2)で求めた質量（7418.89 Da）からメチオニン残基の質量 131.19 Da
を差し引くと、計算質量 7287.70 Da となる。
4)
MALDI-MS で観測されるイオンは、主として[M + H]+であるので、プロトンの質量
1.01 Da を加えて、このピークが観測される m/z 値の計算値 7288.71 が得られる。
以上のようにして、約 50 種類の全てのサブユニットタンパク質について、観測される
m/z 値の計算値を求めて MALDI マススペクトルのピークを帰属するためのリストを作成
した。このリストを、さらにゲノム解読された各種バクテリアに対して用意し、データベ
ース化した。実際には、上記の作業はコンピュータ上で包括的に行った。
(c)
観測ピークの帰属
本研究では、測定装置の性能と分子量が既知のタンパク質を用いた繰り返し測定の再現
性を考慮し、あるリボソームサブユニットタンパク質の計算質量との差が 150 ppm 以内で
一致するピークが観測できた場合に、そのピークが帰属できたものと判断した。タンパク
質のアミノ酸配列に変異が生じると、多くの場合で 10 Da 以上の質量変異が生じる。これ
に対して、150 ppm という許容誤差であれば、質量が 2 万 Da のタンパク質の場合でも 3 Da
以内の誤差でピークシフトを見分けることができ、十分に信頼性が確保された解析結果を
得ることができる。
- 65 -
補足）
N 末端則(N-end rule)について
N 末端メチオニン残基の切断は、リボソームで mRNA が翻訳されて生合成されたポリペ
プチド鎖が、N 末端メチオニン切断酵素の作用を受けることによって起こる最初の翻訳後
修飾であり、リボソームタンパク質に限らず、あらゆるタンパク質の生合成過程で起こり
得る。但し、この切断は必ず起こるのではなく、N 末端メチオニン残基に隣接する 2 番目
のアミノ酸残基の旋回半径が 1.29 Å以下の場合、すなわちグリシン(G), アラニン(A)、セ
リン(S)、プロリン(P)、バリン(V)、スレオニン(T)、およびシステイン(C)の場合に起こりや
すいことが、N 末端則(N-end rule)[20]として経験的に知られている[21, 22]。
タンパク質の寿命は、N 末端アミノ酸残基の大きさに依存しており、大きなアミノ酸残
基をもつタンパク質は不安定であることが知られている[23]。そのため、2 番目のアミノ
酸残基が小さい場合は N 末端メチオニン残基を切断し、それが大きい場合は、それよりも
小さな開始メチオニン残基を残すことによって、タンパク質の安定性を向上させているの
ではないかと考えられている。すなわち、N 末端メチオニン切断酵素は、2 番目のアミノ
酸残基の種類ではなく、N 末端アミノ酸配列の大きさ（立体障害）を認識しているのでは
ないかと考えられる。そのため、2 番目のアミノ酸残基が小さくても N 末端メチオニン残
基の切断が起こらないという例外がいくつも報告[12, 22, 24-28]されており、3 番目のアミ
ノ酸残基が、ポリペプチド鎖を大きく折り曲げるプロリン残基である場合に、N 末端メチ
オニン残基の切断が阻害されやすいようである。N 末端側にはあくまでも経験則であり、
例外が起こり得ることに注意して解析を行う必要がある。
- 66 -
文献
[1]
Gross, J. H.: Mass Spectrometry. A Textbook; Springer: Berlin, 2004, pp. 411-440 (10
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization).
[2]
田中耕一: ぶんせき 1996, 253.
[3]
Cotter, J. C.: Time-of-Flight Mass Spectrometry; American Chemical Society:
Washington, 1997, pp. 113-136 (6 Laser Desorption and MALDI).
[4]
佐藤浩昭: 生命科学のための最新マススペクトロメトリー; 原田健一, 田口良, 橋本豊,
編; 講談社サイエンティフィク: 東京, 2002, pp. 17-33 (1-2 MALDI-MS).
[5]
Fukuyama, Y.; Iwamoto, S.; Tanaka, K.: J. Mass Spectrom. 2006, 41, 191.
[6]
Yamamoto, S.; Harayama, S.: Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61, 1104.
[7]
Yamamoto, S.; Harayama, S.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1998, 48, 813.
[8]
Kurland, C. G.: Methods Enzymol. 1971, 20, 379.
[9]
Traub, P.; Mizushima, S.; Lowry, C. V.; Nomura: Methods Enzymol. 1971, 20, 391.
[10]
Hardy, S. J. S.; Kurland, C. G.; Voynow, P.; Mora, G.: Biochem. 1969, 8, 2897.
[11]
Xiang, F.; Beavis, R. C.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1994, 8, 199.
[12]
Arnold, R. J.; Reilly, J. P.: Anal. Biochem. 1999, 269, 105.
[13]
http://www.ddbj.nig.ac.jp/.
[14]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html.
[15]
http://www.embl.org/.
[16]
http://us.expasy.org/sprot/.
[17]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
[18]
寺本華奈江; 佐藤浩昭; 孫麗偉; 鳥村政基; 田尾博明: J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 2007,
55, 209.
[19]
http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html.
[20]
Varshavsky, A.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 12142.
[21]
Sherman, F.; Stewart, J. W.; Tsunasawa, S.: Bioessays 1985, 3, 27.
[22]
Moerschell, R. P.; Hosokawa, Y.; Tsunasawa, S.; Sherman, F.: J. Biol. Chem. 1990,
265, 19638.
[23]
Bachmair, A.; Finley, D.; Varshavsky, A.: Science 1986, 234, 179.
- 67 -
[24]
Barwick, R. C.; Jones, R. T.; Head, C. G.; Shih, M. F. C.; Prchal, J. T.; Shih, D. T. B.:
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 4602.
[25]
Yamada, T.; Kato, K.; Kawahara, K.; Nishimura, O.: Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1986, 135, 837.
[26]
Prchal, J. T.; Cashman, D. P.; Kan, Y. W.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83, 24.
[27]
Devlin, P. E.; Drummond, R. J.; Toy, P.; Mark, D. F.; Watt, K. W. K.; Devlin, J. J.:
Gene 1988, 65, 13.
[28]
Arnold, R. J.; Polevoda, B.; Reilly, J. P.; Sherman, F.: J. Biol. Chem. 1999, 274, 37035.
- 68 -
第
３
章
リボソームタンパク質をバイオマーカーとした
MALDI-MS によるバクテリアの迅速同定
-69-
3-1 ゲノム解読された乳酸菌 Lactobacillus plantarum のリボソームタンパク
質のキャラクタリゼーション
3-1-1
緒言
第 1 章で述べたように、MALDI-MS で求められるバクテリア菌体中のタンパク質の観測
質量と、タンパク質データベース上の翻訳アミノ酸配列から推測した計算質量を比較する
ことによってバクテリアを迅速同定する、バイオインフォマティクスを利用する手法[1-3]
は、再現性が乏しく解析結果の生物学的な根拠が希薄であった従来の指紋判定法の課題を
克服し、信頼性の高いバクテリアの迅速同定法になり得ると期待される。特に、あらゆる
生物に共通して多量に存在するリボソームタンパク質群は、分子進化を反映してバクテリ
ア種に固有の質量をもつことから、それらをバイオマーカーとして利用すれば、遺伝子型
(genotype)の違いに基づく同定結果を得ることができる可能性がある。
しかし、この方法で指標となるバイオマーカータンパク質の質量は、タンパク質をコー
ドしていると推測される遺伝子の DNA 塩基配列を翻訳したアミノ酸配列から求められた
計算値に過ぎない。そのため、MALDI-MS により実際に求められるバイオマーカータンパ
ク質の観測質量が計算質量と一致しない場合が起こり得ることは、すでに第 1 章で指摘し
た。バクテリア実験のモデルとしてよく用いられる大腸菌(Escherichia coli, E. coli)のリボ
ソームタンパク質については、1997 年の全ゲノム解読[4]よりも以前の 1970 年代からすで
に、アミノ酸配列や翻訳後修飾の解析などに関する詳細なキャラクタリゼーションが行わ
れてきた[5]。現在では、E. coli の全てのリボソームサブユニットタンパク質について、ア
ミノ酸配列、翻訳後修飾、および分子量に関する化学構造のみならず、立体構造まで詳細
に明らかになっている。しかし、ゲノム解読された多くのバクテリアで、発現した各リボ
ソームサブユニットタンパク質の遺伝子領域や分子量が検証されたのは、わずか数例に過
ぎない[6-8]。しかも、それらはいずれもグラム陰性菌であり、代表的な有用バクテリアで
ある乳酸菌を含むグラム陽性菌に関する解析例は、著者の知る限りこれまで全く報告され
-70-
ていない。すなわち、タンパク質データベースに登録されているグラム陽性菌のリボソー
ムサブユニットタンパク質の翻訳アミノ酸配列情報は、E. coli などのグラム陰性菌の情報
に基づいて推測されたものであり、その信頼性に関する検証は全く行われていない。
そこで本研究では、グラム陽性菌である乳酸菌をモデルとして、(1) タンパク質データベ
ースに登録されている、リボソームサブユニットタンパク質の翻訳アミノ酸配列であると
予測されている情報の正確さと、(2) その翻訳アミノ酸配列から求められる計算質量が発現
タンパク質の質量と一致するリボソームサブユニットタンパク質がどれだけ存在するか、
以上 2 点について検証を試みた。この検証を行うために、質量分析法とタンパク質データ
ベース検索を組み合わせたタンパク質の同定技術である「プロテオーム解析(proteomics)」
を応用することを試みた。まず、バクテリア菌体からリボソームサブユニットタンパク質
を精製し、それらのプロテオーム解析を行って、タンパク質データベース検索の結果、確
かにリボソームサブユニットタンパク質であると同定されたならば、タンパク質データベ
ースに登録されている翻訳アミノ酸配列がリボソームサブユニットタンパク質のものであ
るという予測は正しいということになる。そして、その翻訳アミノ酸配列から求められる
計算質量が、MALDI-MS による観測質量と一致すれば、乳酸菌を同定するために有用なバ
イオマーカータンパク質になり得る。
プロテオーム解析には、「トップダウンプロテオーム解析」と「ボトムアッププロテオー
ム解析」の２つのアプローチがある。
「トップダウンプロテオーム解析」を用いる方法では、
タンパク質を MALDI-MS により測定して、観測質量から分子量を求め、さらに解析対象と
なるタンパク質を質量分析装置内でフラグメント化して観測される MS/MS スペクトルの
ピークパターンを基に、データベース検索してタンパク質を同定する。しかし、現状技術
では、分子量が 1 万以上のリボソームサブユニットタンパク質のトップダウンプロテオー
ム解析は未だ困難である。
そこで本研究では、二次元ゲル電気泳動によるタンパク質の分離と、分離したタンパク
質を酵素消化して得られるペプチド断片を MALDI-MS 測定してデータベース検索するペ
プチドマスフィンガープリント（peptide mass fingerprinting, PMF）法を組み合わせた、「ボ
-71-
トムアッププロテオーム解析」を応用することを試みた。このアプローチで、個々のリボ
ソームサブユニットタンパク質を同定することによって、タンパク質データベースに登録
されている翻訳アミノ酸配列が、確かにリボソームサブユニットタンパク質のものである
か否かの検証を行った。但し、この方法では、二次元ゲル電気泳動で分離したタンパク質
は、ゲル電気泳動や染色などの過程で予測できない化学修飾による変性が起こり得るため、
分離したリボソームサブユニットタンパク質の MALDI-MS 測定による分子量の決定は極
めて困難である。そこで、別途精製リボソームタンパク質画分の MALDI-MS 測定を行い、
各リボソームサブユニットタンパク質の観測質量を求め、タンパク質データベース上の翻
訳アミノ酸配列から算出した計算質量との比較を行った。
本研究では、全ゲノム解読された乳酸菌である Lactobacillus (Lb.) plantarum NCIMB
8826 [6]をモデルとして用いた。Lb. plantarum は、グラム陽性の桿菌で、機能性食品製造
に用いられている産業的に重要な乳酸菌である[9]。MALDI-MS を用いて Lb. plantarum
を同定するために有用なバイオマーカータンパク質を明らかにすることによって、食品お
よびヘルスケア産業などにおける有用菌株の迅速スクリーニング法を開発することが可能
になると期待される。そこで、選択したバイオマーカータンパク質を用いて、市販されて
いる Lb. plantarum のスターターカルチャー（良好な発酵をスムーズに行わせるために食
品に添加する種菌）および Lb. plantarum を用いて製造したとされるヨーグルトに含まれ
るバクテリアの迅速同定を試みた。
3-1-2
(1)
実験
試料菌株の培養、菌体処理、および MALDI-MS 測定
Lb. plantarum NCIMB 8826 は、ゲノム解読された WCFS1 株[6]と本質的に同一の菌株
であり、NCIMB Japan（現 テクノスルガ・ラボ）から購入した。この培養および菌体破
砕は、第 2 章で述べた方法に従って行った。ここでは、直径 0.1 mm のガラス製ビーズを
用いて破砕処理を行い、菌体破砕液を得た。精製リボソームタンパク質画分は、第 2 章で
述べた方法に従って、超遠心法による 70S リボソームの精製と、リボソーム RNA(rRNA)
-72-
の除去を行って得た。これを凍結乾燥して二次元ゲル電気泳動に供した。MALDI-MS によ
り測定するリボソームタンパク質画分は、測定時まで-80℃で保存した。精製リボソームタ
ンパク質画分、菌体破砕液、および菌体懸濁液の MALDI-MS 測定は、第 2 章で述べた方法
により行った。
(2)
二次元ゲル電気泳動
精製リボソームタンパク質画分に含まれるそれぞれのタンパク質を分離するために、二
次元ゲル電気泳動を行った。リボソームサブユニットタンパク質の多くは等電点(pI)が高い
ため、等電点電気泳動を利用した通常の二次元ゲル電気泳動では、それらを分離すること
ができない。そこで、Wada[10]が開発したラジカルフリー高還元性(radical-free and high
reducing, RFHR)二次元ゲル電気泳動を用いた。この方法は、アクリルアミドゲル内に存在
するラジカルを除去して還元的な環境を作り、定 pH 条件下で泳動速度の違いによりタンパ
ク質の分離を行うもので、リボソームタンパク質などの塩基性タンパク質の分離に適して
いる。RFHR 二次元ゲル電気泳動装置はバイオ情報技術研究所から購入した。RFHR 二次
元ゲル電気泳動の実験手順は、以下に示すように既報[10]に従った。まず、100 μL の緩衝
液(pH 8.6)に溶解した約 0.75 mg の精製リボソームタンパク質を一次元ゲルに展開した。こ
こでは、各タンパク質の等電点(pI)の違いにより電気泳動し、pI が 8.6 よりも低いタンパク
質は陰極側に、pI が 8.6 よりも大きなタンパク質は陽極側に移動する。次に、pH 3.4 で二
次元目の展開を行った。ここでは、pI が 3.4 以上のタンパク質は、主として分子ふるい効
果により分子サイズが小さいものほど早く泳動する。分離した各スポットは、クマシーブ
ルーG250 で染色した。
(3)
タンパク質スポットの同定
RFHR 二次元ゲル電気泳動により得られた各タンパク質のスポットは、脱色した後に、
トリプシン（Promega 製、Trypsin Gold）を用いて 37℃で 3 時間ゲル内酵素消化した。得
られたペプチドは、5%のトリフルオロ酢酸（TFA）を含む 50%アセトニトリル水溶液中に
-73-
抽出して MALDI-MS による測定に供した。各トリプシン消化物の MALDI-MS 測定には、
マトリックス剤としてα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)を用い、その 15 mg を 1%トリ
フルオロ酢酸(TFA)を含む 50%アセトニトリル水溶液 1 mL に溶解してマトリックス溶液を
調製した。マススペクトルのキャリブレーションを内部標準法により行う場合は、副腎皮
質刺激ホルモン(adrenocorticotropic hormone, ACTH)の断片 18-39 (clip 18-39) ([M + H]+:
m/z 2465.7)とアンジオテンシン I (angiotensin-I) ([M + H]+: m/z 1296.7)を試料溶液にそれ
ぞれ加えた。1 μL の試料溶液を試料プレートに滴下して風乾した。MALDI マススペクト
ルは、正イオンリフレクターモードを用いて、m/z 800-3000 の範囲を測定して得た。観測
ピークの m/z 値を、Mascot 検索エンジン[11]を用いてペプチドマスフィンガープリンティ
ング(peptide mass fingerprinting, PMF)法により解析した。Mascot 検索のパラメーターは、
生物種の設定をグラム陽性菌、誤開裂の許容範囲を 1 箇所、変異性の修飾としてメチオニ
ン残基の酸化とシステイン残基のカルボキシメチル化、および 1 価イオンの誤差範囲を±
0.15 Da とした。同定結果の採否は、信頼確率が 95%以上かどうかで判定した。もしこの
信頼確率が得られない場合でも、(1)候補のタンパク質のトップスコアを与えるバクテリア
名が Lb. plantarum WCFS1 であり、(2)理論質量と pI 値が RFHR 二次元ゲル電気泳動に
よる結果と概ね一致した場合には、同定できたものと判断した。この基準で同定されなか
っ た ス ポ ッ ト は 、 さ ら に 衝 突 活 性 解 離 (collision-induced dissociation, CID) を 用 い た
MALDI-MS/MS 測定を行い、フラグメントピーク群のリストを Mascot 検索の MS/MS イ
オンサーチを利用して解析した。この場合、フラグメントイオンの誤差範囲は±1.5 Da に
設定した。
(4)
市販製品中の Lb. plantarum の迅速同定
市販のスターターカルチャーとヨーグルトを用いて、本手法により Lb. plantarum を迅
速同定できるかどうか検証した。Lb. plantarum KT という名称の市販のスターターカルチ
ャーを Bio-tech Japan から購入した。菌体は、遠心分離（5800g、10 分）により、直接ス
ターターカルチャー培地(107 cells/g)から回収した。Lb. plantarum を用いて製造したとさ
-74-
れるヨーグルトは、野村乳業から購入した。50 mL の MRS 培地に 1 g のヨーグルトを添加
して前培養し、再度 MRS 培地に接種して培養した。増殖した菌体は、遠心分離（5800 g、
10 分）により培養液から回収した。菌体の破砕処理および MALDI-MS 測定は、NCIMB
8826 株の場合と同様の操作で行った。
3-1-3
(1)
結果と考察
RFHR 二次元ゲル電気泳動/PMF 法によるタンパク質スポットの同定
Fig. 3-1-1 に、RFHR 二次元ゲル電気泳動により分離した精製リボソームタンパク質画分
の画像とスポットイメージを示す。Table 3-1-1 に、各スポットの同定結果、スポット番号、
タンパク質の名称、計算質量、pI の計算値、全アミノ酸配列に対して観測されたペプチド
断片の割合(%)、および SwissProt/TrEMBL タンパク質データベースのアクセッション番
(a)
(b)
1-D Sample gel
+
A1
S2
A3
A5
A7
-
2-D
L3
L1
S4
L2
L4 S3
L5 L11
L6
S5
L13
L9
L15
S8
S7
A8
L16 S11
S9 L17
S12
L22
L23
L31
L20
S13
L18 L21
L19
A9
S16
S10
S19
S15
S18
L27
L29
L30
L32
L10
A4
A6
S6
A2
A10
S21 L28
Fig. 3-1-1. Photograph (a) and imaging map (b) of the isolation of the ribosomal
proteins of Lb. plantarum NCIMB 8826 by RFHR 2-D electrophoresis. + indicates
the anode side and – indicates the cathode side. Arrows indicate the directions of 1-D
and 2-D electrophoresis, respectively. Identified proteins are indicated by white spots
(ribosomal 50S subunit proteins), dark spots (ribosomal 30S subunit proteins) and
dotted spots (ribosome-associated proteins) with their spot codes. Identification
results are summarized in Table 3-1-1.
-75-
号をまとめて示す。合計 52 スポットのタンパク質が同定され、そのうちの 42 スポットは
リボソームサブユニットタンパク質であった。その内訳は、50S ラージサブユニットタンパ
ク質が 25 種類、30S スモールサブユニットタンパク質が 17 種類であった。これらの大半
は等電点が高いため、一次元目の電気泳動で陽極側に分布し、等電点が低い L1、L5、L10、
L31 type B、S2、および S6 は、陰極側で観測された。
一方、Table 3-1-2 に示す 12 種類のリボソームサブユニットタンパク質は、本研究では
帰属されなかった。その原因として、以下の理由が考えられる：m/z 800-2500 の範囲では
観測されるペプチド断片の数が少ない（L14、L24、L33、L34、L35、L36、S14、S14-2、
S17、および S20）、等電点が低すぎて分離可能な範囲から逸脱した（S1 および L7/L12）、
ないしは分子量が小さすぎてゲルから逸脱した（L33、L34、および L36）。
以上のように、53 種類中 42 種類のリボソームサブユニットタンパク質が帰属されたこと
から、大半のリボソームサブユニットタンパク質が、タンパク質データベースの登録情報
と合致して発現していることを確認することができた。
精製リボソームタンパク質画分には、Table 3-1-1 の下段に示したように、リボソームサ
ブユニットタンパク質以外に、少なくとも 10 種類のタンパク質(A1 ~ A10)が含まれている
ことが分かった。これらのうち、S30EA (spot A3)は典型的なリボソーム関連タンパク質で
あり、30S サブユニットの界面に結合してリボソームを安定化する役割をもつ。このタンパ
ク質は、バクテリアに広く分布しており、δ54 調整タンパク質、YfiA、およびタンパク質 Y
などいくつかの異なった名称がつけられている[12-14]。このタンパク質は、Maki ら[13]に
よって、E. coli の精製リボソームタンパク質画分の RFHR 二次元ゲル電気泳動により見出
され、YfiA と名づけられた。したがって、本研究でも S30EA が精製リボソームタンパク
質画分で検出されたことは、妥当な結果である。
DNA 結合タンパク質 HU(spot A9)は、あらゆる原核生物の細胞内で最も多く発現してい
るタンパク質の一種である。E. coli は、HU-αおよび HU-βの 2 タイプのサブユニットタン
パク質を有しており、これと同じ 2 タイプのサブユニットタンパク質は、他の多くのバク
テリアにも存在している[15]。しかし、データベース上の遺伝子情報を調べた限りでは、Lb.
-76-
Table 3-1-1. Identification of the proteins in the ribosome fraction by RFHR 2-D
gel electrophoresis/PMF analysis.
Spot code
Protein name
Sequence
mass
pI
Sequence
coverage (%)
Accession number in
SwissProt/TrEMBL
24770.3
30191.7
22697.1
22637.1
20238.3
19350.1
16469.2
17926.6
14760.2
16293.0
15344.6
16074.8
14166.3
13354.2
13609.7
13590.1
11048.6
12455.5
11151.9
10077.4
7001.2
7537.8
6681.0
9135.2
6634.8
7.79
10.55
9.92
10.11
7.89
9.54
9.64
5.08
9.22
9.60
10.64
10.46
9.98
10.09
11.44
11.33
9.55
10.46
9.65
10.95
11.91
9.91
10.61
6.82
10.98
41
42
40
56
20
25
19
56
9
18
41
31
40
36
54
31
32
68
42
36
26
35
26
53
27
Q88YW9
Q88XY3
Q88XY6
Q88XY5
Q88XX4
Q88XX1
Q890J9
Q88YW8
Q88XY0
Q88XU8
Q88XW7
Q88XX9
Q88XV9
Q88XX0
Q88WJ1
Q88WU6
Q88WN5
Q88XY1
Q88XY4
Q88WN3
Q88WK6
Q88XX8
Q88XW8
Q88Z52
Q88WS9
30225.5
24207.9
22963.5
17261.0
11427.8
17841.4
14643.0
14594.8
11735.8
13777.9
15189.7
13637.7
10536.1
10207.9
9102.6
10290.8
7559.9
5.24
9.95
9.98
9.64
4.97
9.81
9.48
10.39
9.92
11.68
11.26
10.38
9.91
9.99
11.48
9.82
11.28
31
37
22
71
26
44
69
43
51
34
24
47
54
43
50
43
54
Q88VJ4
Q88XY0
Q88UX0
Q88XW9
Q890K2
Q88XY9
Q88XX2
Q88XU7
Q88XY7
Q88XW1
Q88XZ0
Q88XW2
Q88VD5
Q88WJ5
Q890K0
Q88XY2
Q88VR5
26173.8
4.49
19
Q88V88
34248.3
6.04
22
Q88YK0
21725.5
15785.8
17566.9
16672.6
10292.7
12926.4
9621.0
8461.6
5.31
4.92
5.11
5.00
4.95
6.10
9.75
10.09
51
63
37
55
34
15
35
60
Q88YL8
Q88Y61
Q88Y60
Q88SP7
Q88YM6
Q88W95
Q88VZ8
Q88Y36
Ribosomal 50S subunit proteins
L1
L1
L2
L2
L3
L3
L4
L4
L5
L5
L6
L6
L9
L9
L10
L10
L11
L11
L13
L13
L15
L15
L16
L16
L17
L17
L18
L18
L19
L19
L20
L20
L21
L21
L22
L22
L23
L23
L27
L27
L28
L28
L29
L29
L30
L30
L31
L31 typeB
L32
L32
Ribosomal 30S subunit proteins
S2
S2
S3
S3
S4
S4
S5
S5
S6
S6
S7
S7
S8
S8
S9
S9
S10
S10
S11
S11
S12
S12
S13
S13
S15
S15
S16
S16
S18
S18
S19
S19
S21
S21
Ribosome associated proteins
A1
Cell division initiation protein DivIVA
UTP-glucose-1-phosphate
A2
uridylytransferase
A3
S30EA
A4
Alkaline shock protein
A5
Alkaline shock protein
A6
Small heat shock protein
A7
10 kDa chaperonin
A8
Methylase
A9
DNA-binding protein II
A10
Hypothetical protein
-77-
Table 3-1-2. Unidentified ribosomal subunit proteins by RFHR 2-D gel
electrophoresis/PMF analysis.
Ribosomal
protein name
L7/L12
L14
L24
L33
L34
L35
L36
S1
S14
S14-2
S17
S20
Sequence
mass
12592.1
13148.2
11380.1
5656.6
4744.4
7418.9
4559.6
47159.7
7160.5
10139.9
10347.1
9084.6
pI
4.30
9.91
9.99
9.69
5.69
12.04
11.09
4.79
10.61
11.42
10.10
10.52
Numbers of
theoretical tryptic
peptides
8
4
1
2
0
2
2
25
2
3
4
2
Accession number in
SwissProt/TrEMBL
Q88YW7
Q88XX6
Q88XX5
Q88YX4
Q88RW9
Q88WU7
Q88XW3
Q88VZ5
Q88XX3
Q88V67
Q88XX7
Q88VD4
plantarum の DNA 結合タンパク質 HU には、1 種類のサブユニットタンパク質しか存在し
ないようである。DNA 結合タンパク質 HU は、E. coli の全菌体の MALDI マススペクトル
でも観測されている [16, 17] 。最近、 Fagerquist らは [18] 、 Campylobacter 属細菌を
MALDI-MS により同定する際に、DNA 結合タンパク質 HU が、バイオマーカーとして用
いることができることを報告している。
その他、細胞分裂始動タンパク質 DivV A (spot A1)、スモールヒートショックタンパク質
(spot A6)、10 kDa シャペロニン(spot A7)、およびメチラーゼ(spot A6)は、全て細胞分裂に
関わるタンパク質であり、タンパク質の合成を制御するために 70S リボソームとの結合性
を有していてもおかしくはない。リボソームはストレスに対する感受性が高いため[19]、精
製リボソームタンパク質画分中から、アルカリショックタンパク質（spot A4 と A5）や、
スモールヒートショックタンパク質(spot A6)などのストレス誘導タンパク質が検出された
ことも、十分にあり得ることである。さらに、UTP-グルコース-1-リン酸ウリジル酸トラン
スフェラーゼ(spot A10)は、リボソームと構造的あるいは機能的に関連するタンパク質であ
ると考えられる。
-78-
(2) 精製リボソームタンパク質画分の MALDI マススペクトルピークの帰属
精製リボソームタンパク質画分の MALDI マススペクトルを、Fig. 3-1-2 に示す。m/z
10000 以下の自己キャリブレーションには、L29、L30、S10、および S18 の[M + H]+イオ
ンのピークと、L30 の[M + 2H]2+イオンのピークを用いた。m/z 10000 以上範囲では、S3、
S5、S9、S10、および S18 の[M + H]+イオンのピークを用いて自己キャリブレーションを
行った。最終的に、計算質量と観測質量の誤差が 150 ppm 以内であるものを帰属できたも
のと判断した。計算質量は、翻訳後修飾として N 末端メチオニン残基の切断に関する N 末
端則[20-22]（第 2 章）を考慮して求めた。一方、メチル化やアセチル化など、その他の翻
訳後修飾は、Lb. plantarum のどのリボソームサブユニットタンパク質で起こるか明らかで
はなく、翻訳アミノ酸配列の情報から推測することができないため、本研究では考慮しな
かった。すなわち、N 末端メチオニン切断以外の翻訳後修飾を受けたリボソームサブユニ
ットタンパク質は、本法では帰属されず、解析対象外となる。
Table 3-1-3 に、MALDI-MS により帰属されたタンパク質と、各サブユニットタンパク
質の計算質量と観測質量、誤差（Da および ppm）、N 末端から 2 番目のアミノ酸残基の種
類、N 末端メチオニン切断の有無、および相対ピーク強度の程度をまとめて示す。53 種類
のリボソームサブユニットタンパク質のうち 40 種類が帰属された。その内訳は、50S ラー
ジサブユニットタンパク質で 32 種類のうち 22 種類、30S スモールサブユニットタンパク
質で 21 種類のうち 18 種類であった。但し、L2 と S2 および L27 と S16 のピークは、それ
ぞれ重複していた。RFHR 二次元ゲル電気泳動/PMF 法で帰属されなかった 12 種類のタン
パク質のうち、7 種類（L7/L12、L14、L24、L34、L35、S17、および S20）が、MALDI
マススペクトル上で観測された。その他に、RFHR 二次元ゲル電気泳動/PMF 法で帰属さ
れた 10 種類のリボソーム関連タンパク質のうち 4 種類が帰属された。以上の結果は、これ
らのタンパク質については、タンパク質データベースに登録されている翻訳アミノ酸配列
情報が正しいことを裏付けている。
代表的な翻訳後修飾である N 末端メチオニン残基の切断は、半分以上のリボソームサブ
ユニットタンパク質で確認された。興味深いことに、30S リボソームについては、帰属され
-79-
*
*
*
*
*
L30 *
*
*
L34
6.2 mV
0 mV
3500
4000
m/z
4500
6000
7000
8000
m/z
*
*
*
*
*
**
**
*
L35
5000
*
*
*
*
*
*
**
*
0 mV
S21
L28
L31
L30 *
S20
S18
L29
54 mV
5000
DNA-binding protein II
3000
*
2500
9000
10000
L27
S16
33 mV
12000
L6
S7
S5
L13
L9
small heat
shock protein
S12
L15
*
S9
L14 L20
S13
L19
S11
L17
L7/L12
methylase
S6
L24
S10
10000
*
0 mV
*
*
L21
S17
L23
S15
S19
×5
14000
m/z
16000
18000
20000
32000
36000
40000
L2
S2
S3
L4
L3
S30EA
0.5 mV
0 mV
20000
24000
28000
m/z
Fig. 3-1-2. MALDI mass spectrum of the isolated ribosomal protein fraction. The mass spectrum
is duplicated into four sets. The peaks indicated by boxed subunit names were used for
self-calibration. Asterisks (*) indicate [M + 2H]2+ peaks.
-80-
Table 3-1-3. Assigned proteins containing in the ribosome fraction by MALDI-MS.
Proteins namea
m/z values
Calculated
b
Errors
Observed
c
2nd
in Da
in ppm
a. a.
Met. loss
Intensity e
Comments
Overlap with S2
d
Ribosomal 50S large subunit proteins
30061.6
22567.0
22507.0
19220.1
12462.1
16470.2
16169.7
13149.2
15345.6
14036.2
13610.7
13460.1
11049.6
11152.9
11381.1
10078.4
6871.2
7538.8
6550.9
9136.2
-e
22569.3
22508.6
19220.1
12462.0
16470.6
16170.0
13149.1
15346.1
14036.2
13610.5
13460.3
11049.3
11152.3
11381.4
10077.3
6871.0
7538.9
6550.8
9136.0
2.3
1.6
0.0
-0.1
0.2
0.3
-0.1
0.5
0.0
-0.2
0.2
-0.3
-0.4
0.3
-1.1
-0.2
0.1
-0.1
-0.2
101
71
0
-8
24
19
-8
33
0
-15
15
-27
-54
26
-109
-29
13
-15
-22
G
T
T
S
A
Q
R
I
K
S
R
A
Y
E
L
L
A
K
A
Q
yes?
Yes
Yes
Yes
Yes
No
No
No
No
Yes
No
Yes
No
No
No
No?
Yes
No
Yes
No
Weak
Weak
Weak
Weak
Strong
Weak
Middle
Middle
Middle
Middle
Middle
Weak
Weak
Strong
Strong
Strong
Strong
Strong
Strong
Strong
L34
4745.4
4746.1
0.7
148
Q
No
Middle
L35
7288.9
7288.9
0.0
0
P
Yes
Strong
A
yes?
L2
L3
L4
L6
L7/L12
L9
L13
L14
L15
L17
L19
L20
L21
L23
L24
L27
L28
L29
L30
L31 type B
Overlap with S16
Overlap with [M +
2H]2+ of DNA
binding protein II
Ribosomal 30S small subunit proteins
-e
Overlap with L1
S2
30095.5
S3
24077.8
24077.8
0.0
0
G
Yes
Weak
S4
22833.4
22835.1
1.7
74
S
Yes
Weak
S5
17131.0
17131.1
0.1
6
T
Yes
Weak
S6
11297.8
11297.3
-0.5
-44
S
Yes
Strong
S7
17711.4
17712.2
0.8
45
P
Yes
Weak
S9
14464.8
14464.7
-0.1
-7
A
Yes
Middle
S10
11605.7
11605.9
0.2
17
A
Yes
Strong
S11
13647.8
13648.9
1.1
81
A
Yes
Middle
S12
15059.7
15059.6
-0.1
-7
P
Yes
Middle
S13
13507.7
13507.4
-0.3
-22
A
Yes
Middle
S15
10406.1
10406.2
0.1
10
A
Yes
Strong
S16
10077.8
10077.3
-0.5
-50
S
Yes?
Strong
S17
10217.1
10218.0
0.9
88
S
Yes
Middle
S18
8972.6
8972.6
0.0
0
A
Yes
Strong
S19
10160.8
10160.3
-0.5
-49
G
Yes
Strong
S20
8954.5
8953.1
-1.4
-156
P
Yes
Strong
S21
7429.8
7429.3
-0.5
-67
A
Yes
Middle
21726.5
21726.9
0.4
18
L
no
Weak
16542.5
16543.1
0.6
36
A
yes
Weak
12796.4
12796.6
0.2
16
A
yes
Weak
9491.0
9490.7
-0.3
-32
A
yes
Strong
Ribosome associated proteins
a
S30EA
small heat shock
protein
methylase
DNA-binding
protein II
The proteins written by bold characters are finally selected biomakers for cell lysates.
Calculated from amino acid sequence considering with N-terminal methionine loss or not.
Average values for three mass spectra.
d
Second amino acid from N-terminal side.
e
Judged by relative peak intensities to L29: weak; <5%, Middle; 5~10%, and Strong, >10%.
f
Observed but not determined m/z values due to insufficient peak resolution.
b
c
-81-
Overlap with L27
た全てのサブユニットタンパク質で N 末端メチオニン残基の切断が確認された。Arnold ら
[23, 24]は、大腸菌とイーストのリボソームタンパク質について、N 末端則がほぼ適用でき
ることを MALDI-MS を用いて実証した。N 末端則は、あくまでも経験則であり、常に検証
が必要である。本研究でも、N 末端メチオニン切断が起こる傾向は、N 末端則と完全に一
致することを確認した。
以上のように、Table 3-1-3 に示したタンパク質については、N 末端則を加味した計算質
量と合致することが確認できたため、これらは MALDI-MS によるバクテリアの同定のため
に有用なバイオマーカーの候補である。
一方、RFHR 二次元ゲル電気泳動/PMF 法により同定された 9 種類のリボソームサブユ
ニットタンパク質（L1、L5、L10、L11、L16、L18、L22、L32、および S8）と 6 種類の
リボソーム関連タンパク質（細胞分裂始動タンパク質 DivIV A、UTP-グルコース-1-リン酸
ウリジル酸トランスフェラーゼ、2 種類のアルカリショックタンパク質、シャペロニン、お
よび機能未知タンパク質）は MALDI マススペクトルでは帰属することができなかった。
さらに、4 種類のリボソームサブユニットタンパク質（L32、L33、L36、および S1）は、
両手法で検出されなかった。すなわち、これら 19 種類のタンパク質は、MALDI-MS でピ
ークを確認することができず、バイオマーカーとして適していないと判断した。これらの
タンパク質は、N 末端メチオニン切断以外の翻訳後修飾を受けたために帰属されなかった
可能性が考えられる。例えば、L11 は原核生物から真核生物に共通して、L11 メチル化酵素
の働きによって複数のメチル化が起こると考えられており、大腸菌の L11 では 9 残基のメ
チル基が導入されることが確認されている[23]。しかし、本研究では、L11 に導入されるメ
チル基の数を明らかにすることはできなかった。
(3) 菌体懸濁液および菌体破砕液の MALDI マススペクトル
リボソームタンパク質の精製を必要としない簡便な試料調製でも、リボソームタンパク
質のピークを観測することができれば、実用的な迅速同定法の開発につながる。そこで、
菌体懸濁液を試料とした場合とビーズで菌体を破砕した場合に観測された MALDI マスス
-82-
ペクトルを、精製リボソームタンパク質画分の MALDI マススペクトルと比較した。
Fig. 3-1-3 に、m/z 5000-20000 の範囲における菌体懸濁液(a)、菌体破砕液(b)、および精
製リボソームタンパク質画分(c)の MALDI マススペクトルを比較して示す。菌体懸濁液を
直接マトリックス溶液と混合して測定した場合では、リボソームタンパク質のピークはほ
とんど観測されていない（Fig. 3-1-3a）。これは、グラム陽性である Lb. plantarum は比較
的硬い細胞膜を有するため、マトリックス溶液と混合しただけでは、細胞内からリボソー
(a)
×2.5
5000
(b)
10000
×5
m/z
×5
5000
20000
15000
20000
15000
20000
×20
10000
m/z
(c)
5000
15000
×5
10000
m/z
Fig. 3-1-3. MALDI mass spectra of whole cell (a), cell lysate (b), and isolated ribosomal protein
fraction (c). Dark circles (●) indicate ribosomal subunit proteins, and white circles (○) indicate
ribosome-associated proteins.
-83-
ムタンパク質を抽出することが困難であることを示している。これに対して、ビーズ破砕
により得られた菌体破砕液（Fig. 3-1-3b）では、多くのピークを観測することができた。著
しく高い強度で観測されたピーク(m/z 7286, 7337, 8067, および 10294)を除けば、菌体破
砕液（Fig. 3-1-3b）と精製リボソームタンパク質画分（Fig. 3-1-3c）の MALDI マススペク
トルのパターンは類似していた。Table 3-1-3 に示したタンパク質のうち、分子量が 2 万以
上のもの（L2～L4、S2～S4、および S30EA）と 2 種類のリボソームサブユニットタンパ
ク質（L35 と S21）以外は、全て菌体破砕液でも観測することができた。最終的に、35 種
類のタンパク質（18 種類の 50S ラージサブユニットタンパク質、14 種類の 30S スモール
サブユニットタンパク質、および 3 種類のリボソーム関連タンパク質）を、MALDI-MS を
用いて Lb. plantarum を同定する際に有用なバイオマーカーとして選択した。これらバイ
オマーカータンパク質は、Table 3-1-3 に太文字で示した。リボソームタンパク質の精製を
行わなくても、簡単なビーズ破砕で調製できる菌体破砕液で 30 種類以上のバイオマーカー
タンパク質が観測されたことから、本法は、より簡易かつ迅速なバクテリアの同定法にな
り得ると考えられる。
(4) 市販製品中の Lb. plantarum の迅速同定
Lb. plantarum を同定するためのバイオマーカーとして選択した 35 種類のタンパク質を
指標として、市販のスターターカルチャーLb. plantarum KT と、Lb. plantarum を用いて
製造したとされる市販のヨーグルト中のバクテリアの迅速同定を試みた。なお、これらに
ついては、微生物学的な同定試験の結果は公表されていない。
Fig. 3-1-4 に、スターターカルチャーLb. plantarum KT(a)、ヨーグルト由来の菌株(b)、
および Lb. plantarum NCIMB 8826(c)の MALDI マススペクトルを拡大して示す。Fig.
3-1-4 に示した範囲では、Lb. plantarum NCIMB 8826(c)で 9 種類のバイオマーカーピーク
が観測されている（L27/S16（重複）
、S19、S17、S15、L21、L23、S6、L24、および S10）。
なお、いずれの試料でも m/z 10300 付近に高強度で観測されているピークは、精製リボソ
ームタンパク質ではほとんど観測されなかったため（Fig. 3-1-2 参照）
、リボソームタンパ
-84-
S10
L24
L23
L21
S15
S19
S17
S16
L27
S6
×5
(a)
(b)
*
*
*
*
(c)
10000
10500
11000
m/z
11500
12000
Fig. 3-1-4. Partial MALDI mass spectra of the cell lysates from the industrial starter culture (a),
the yogurt culture (b), and Lb. plantarum NCIMB 8826 (c). Dark circles (●) indicate biomarker
proteins. Asterisks (*) might correspond to mutated biomarker proteins.
ク質以外の成分であると考えられる。市販のスターターカルチャーLb. plantarum KT では、
示した範囲で全てのバイオマーカーピークが観測された（Fig. 3-1-4a）。また、他の範囲で
も、L9 以外のバイオマーカーピークが全て観測された。以上の結果から、市販のスタータ
ーカルチャー（Lb. plantarum KT）は、Lb. plantarum NCIMB 8826 と非常に類縁性が高
いことが示唆された。
一方、ヨーグルト由来の菌株については、マススペクトルのパターンは他の 2 株と類似
していたが、観測質量が一致したバイオマーカーは 35 種類中 18 種類であった。帰属され
なかったバイオマーカータンパク質の計算質量付近には、*で示す明瞭なピークが観測され
ているため、これらはアミノ酸配列が若干変異したタンパク質である可能性が考えられる
（Fig. 3-1-4b）。この結果は、ヨーグルトのスターターとして用いられている菌株は、Lb.
plantarum あるいは Lb. plantarum と近縁のバクテリアであると考えられるが、類縁性は、
ゲノム解読株である Lb. plantarum NCIMB 8826 およびスターターカルチャー Lb.
plantarum KT との関係よりは低いことを示唆している。このように、質量が一致するバイ
オマーカータンパク質の種類および数の違いから、Lb. plantarum の迅速同定を行うことが
できるだけではなく、その株レベルでの識別へ応用できる可能性が示された。
-85-
文献
[1]
Demirev, P. A.; Ho, Y. P.; Ryzhov, V.; Fenselau, C.: Anal. Chem. 1999, 71, 2732.
[2]
Demirev, P. A.; Lin, J. S.; Pineda, F. J.; Fenselau, C.: Anal. Chem. 2001, 73, 4566.
[3]
Pineda, F. J.; Antoine, M. D.; Demirev, P. A.; Feldman, A. B.; Jackman, J.;
Longenecker, M.; Lin, J. S.: Anal. Chem. 2003, 75, 3817.
[4]
Blattner, F. R.; Plunkett, G.; Bloch, C. A.; Perna, N. T.; Burland, V.; Riley, M.;
ColladoVides, J.; Glasner, J. D.; Rode, C. K.; Mayhew, G. F.; Gregor, J.; Davis, N. W.;
Kirkpatrick, H. A.; Goeden, M. A.; Rose, D. J.; Mau, B.; Shao, Y.: Science 1997, 277,
1453.
[5]
Wittmann, H. G.: Annu. Rev. Biochem 1982, 51, 155.
[6]
Kleerebezem, M.; Boekhorst, J.; van Kranenburg, R.; Molenaar, D.; Kuipers, O. P.;
Leer, R.; Tarchini, R.; Peters, S. A.; Sandbrink, H. M.; Fiers, M.; Stiekema, W.;
Lankhorst, R. M. K.; Bron, P. A.; Hoffer, S. M.; Groot, M. N. N.; Kerkhoven, R.; de
Vries, M.; Ursing, B.; de Vos, W. M.; Siezen, R. J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003,
100, 1990.
[7]
Suh, M. J.; Hamburg, D. M.; Gregory, S. T.; Dahlberg, A. E.; Limbach, P. A.:
Proteomics 2005, 5, 4818.
[8]
Running, W. E.; Ravipaty, S.; Karty, J. A.; Reilly, J. P.: J. Proteome Res. 2007, 6, 337.
[9]
Cobeci, A.: Food Microbiol. 2003, 20, 511.
[10]
Wada, A.: J. Biochem. 1986, 100, 1583.
[11]
http://www.matrix-science.com/search_form_select.html.
[12]
Agafonov, D. E.; Kolb, V. A.; Nazimov, I. V.; Spirin, A. S.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1999, 96, 12345.
[13]
Maki, Y.; Yoshida, H.; Wada, A.: Genes Cells 2000, 5, 965.
[14]
Ye, K. Q.; Serganov, A.; Hu, W. D.; Garber, M.; Patel, D. J.: Eur. J. Biochem. 2002,
269, 5182.
[15]
Pettijohn, D. E.: J. Biol. Chem. 1988, 263, 12793.
[16]
Dai, Y. Q.; Li, L.; Roser, D. C.; Long, S. R.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999, 13,
73.
-86-
[17]
Ryzhov, V.; Fenselau, C.: Anal. Chem. 2001, 73, 746.
[18]
Fagerquist, C. K.; Miller, W. G.; Harden, L. A.; Bates, A. H.; Vensel, W. H.; Wang, G.
L.; Mandrell, R. E.: Anal. Chem. 2005, 77, 4897.
[19]
van Bogelen, R. A.; Neidhardt, F. C.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 5589.
[20]
Sherman, F.; Stewart, J. W.; Tsunasawa, S.: Bioessays 1985, 3, 27.
[21]
Moerschell, R. P.; Hosokawa, Y.; Tsunasawa, S.; Sherman, F.: J. Biol. Chem. 1990,
265, 19638.
[22]
Varshavsky, A.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 12142.
[23]
Arnold, R. J.; Reilly, J. P.: Anal. Biochem. 1999, 269, 105.
[24]
Arnold, R. J.; Polevoda, B.; Reilly, J. P.; Sherman, F.: J. Biol. Chem. 1999, 274,
37035.
-87-
3-2
複数のゲノム解読株の比較解析によるリボソームタンパク質のアミノ酸
配列の登録情報および変異の検証
3-2-1 緒言
前節では、翻訳アミノ酸配列情報を用いて、MALDI マススペクトル上で実際に帰属でき
るリボソームサブユニットタンパク質がどの程度存在するのかを検証するために、モデル
微生物として、ゲノム解読された Lactobacillus (Lb.) plantarum NCIMB 8826 の発現リボ
ソームタンパク質のキャラクタリゼーションを行った研究[1]について述べた。この過程で、
いくつかのリボソームサブユニットタンパク質の観測質量は、 Lb. plantarum NCIMB
8826 のものとは異なっていることが明らかとなった。この結果から、リボソームサブユニ
ットタンパク質の中には、株レベルでアミノ酸配列が変異するものが存在していることが
示唆された。
バクテリアの「種」を同定するためにはアミノ酸配列の変異が起こりにくいリボソーム
サブユニットタンパク質をバイオマーカーとして選択する必要がある。一方、その変異が
起こりやすいリボソームサブユニットタンパク質に注目すれば、MALDI-MS により、バク
テリアを「株」レベルで識別して分類することが可能になると考えられる。この手法を開
発するためには、リボソームサブユニットタンパク質の変異が、同種のバクテリア間でど
の程度起こっているのかを、あらかじめ把握しておくことが重要である。もし同種のバク
テリアで複数のゲノム解読株の翻訳アミノ酸配列がタンパク質データベースに登録されて
いれば、アミノ酸配列の変異は、コンピュータ上で相同性解析により容易に調べることが
できる。しかし、これはタンパク質データベースの登録情報が正しいことが前提となる。
もし登録されている配列情報が誤っていると、株レベルでのアミノ酸配列の変異の有無を
誤って判断することになる。これまでに、リボソームタンパク質の発現質量が検証された
例は、数例に止まっており[1-5]、タンパク質データベース情報の信頼性はほとんど検証さ
れていない。その数少ない報告の中ですら、リボソームサブユニットタンパク質の翻訳ア
-88-
ミノ酸配列情報に誤りがいくつか見出されており、その誤りは、主として N 末端メチオニ
ン残基の位置を誤判定したものであった[4, 5]。そのため、これまで検証されていなかった
翻訳アミノ酸配列情報にも、ある程度の割合で誤りが含まれていることは想像に難くない。
これまで行われてきたリボソームタンパク質のキャラクタリゼーション[1-5]では、精製
したリボソームタンパク質が試料として用いられてきた。しかも、翻訳後修飾の解析が主
たる目的であったため、二次元液体クロマトグラフ(2D-LC)とエレクトロスプレー四重極飛
行時間型質量分析装置(ESI-QTOF)の複合システムなどを用いたトップダウンプロテオー
ム解析の手法と、酵素消化により得たペプチド断片の質量分析によるボトムアッププロテ
オーム解析の手法を組み合わせた、複雑かつ高度な解析技術が用いられてきた[3, 5]。一方、
前節 3-1 において、菌体破砕液を試料として用いても、MALDI-MS でリボソームサブユニ
ットタンパク質のピークが明確に観測できることを述べた。この菌体破砕液を分析する手
法は、精製やクロマトグラフィーによる分離を必要としないため、リボソームタンパク質
の網羅的な解析を行って、様々な微生物の翻訳アミノ酸配列情報をスクリーニング的に検
証する手段には適していると考えられる。
本研究では、MALDI-MS による菌体破砕液の直接分析法を用いて、ゲノム解読された同
種異株のバクテリアのリボソームサブユニットタンパク質のキャラクタリゼーションを行
った。ここでは、モデルバクテリアとして、ヨーグルトのスターターカルチャーとして伝
統的に用いられている典型的な乳酸菌である Streptococcus (St.) thermophilus と Lb.
delburueckii subsp. bulgaricus (Lb. bulgaricus)のゲノム解読株それぞれ 2 菌株を用いた。
これら 4 菌株のリボソームサブユニットタンパク質の翻訳アミノ酸配列情報は、全て
Swiss-Prot/TrEMBL タンパク質データベースから入手することができ、いくつかのリボソ
ームサブユニットタンパク質では、このデータベースに登録されている翻訳アミノ酸配列
が菌株間で異なっていることが分かっている。そこで、同種異株のバクテリアのマススペ
クトルを比較解析し、異なる菌株間でアミノ酸配列に変異が生じているリボソームサブユ
ニットタンパク質を明らかにすると共に、タンパク質データベース情報の信頼性を検証す
ることを試みた。
-89-
3-2-2 実験
St. thermophilus ATCC BAA-250（ゲノム解読株である LMG 18311 株[6]と同一）と
ATCC BAA-491（ゲノム解読株である LMD 9 株[7]と同一）、および Lb. bulgaricus ATCC
BAA-365 [7]は、アメリカの菌株分譲機関 American Type Culture Collection (ATCC)から
購入した。また、Lb. bulgaricus NBRC 13953T（ゲノム解読株である ATCC 11842T 株と
同一）は、製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門(NBRC)から購入した。これら 4 菌株
の培養および菌体破砕は、第 2 章で述べた方法に従って行った。まず、MRS 培地にて 37℃
で 18 時間培養し、TMA-I 緩衝液を用いて遠心洗浄した後に、ビーズ破砕処理した。なお、
破砕効率の良いビーズの種類を検討し、前節で用いたガラスビーズよりも比重が大きいジ
ルコニアシリカビーズ（直径 0.1 mm）を用いることにした。この菌体破砕液を MALDI-MS
測定に供した。比較実験のため、リボソームタンパク質の精製を、第 2 章で述べた方法に
より行った。各試料の MALDI-MS 測定は、第 2 章で述べた方法により行った。
3-2-3 結果および考察
(1) 精製リボソームタンパク質と菌体破砕液の MALDI マススペクトルの比較
Fig. 3-2-1 と Fig. 3-2-2 に、St. thermophilus ATCC BAA-491 および Lb. bulgaricus
NBRC 13953T から調製した精製リボソームタンパク質画分(a)および菌体破砕液(b)の m/z
4000～32000 における MALDI マススペクトルを、それぞれ比較して示す。各ピークは、
相対強度がある程度異なるものもあるが、前処理法の違いに関わらず、概ね同じ m/z 値で
観測されている。なお、ピークの帰属に関する詳細は、(2)以降の節で述べる。
St. thermophilus ATCC BAA-491 では、合計 42 種類のリボソームサブユニットタンパ
ク質が観測された（ピークが重複している L28 と S21 を含む）（Fig. 3-2-1）。但し、精製リ
ボソームタンパク質画分からは、L20 を観測することができなかった。また、Lb. bulgaricus
NBRC 13953T では、精製リボソームタンパク質画分については合計 34 種類のリボソーム
-90-
L28
S21
X5
S11
S13
L14
L19
L18
L22
S10
S16
S19
L23
L24
S6
S15
S17
L29
L34
S20
S18
L31
L35
S14
L32
Intensity %
L36
L33
100
L30
(a)
0
Intensity %
L20
(b)100
0
4000
6000
12000
14000
X5
L6
S9
10000
m/z
L15
L13
L2
S3
S4
L5
S5
L9
S7
S8
Intensity %
L17
100
S12
(a)
8000
0
Intensity %
(b)100
0
14000
16000
18000
20000
22000
24000
26000
28000
30000
32000
m/z
Fig. 3-2-1. MALDI mass spectra of purified ribosomal proteins (a) and cell lysate (b) of
St. thermophilus ATCC BAA-491.
-91-
(a)
X5
L22
S10
L18
L20
S11
S13
S16
S17
S19
L31
L24
S18
L28
L35
L34
L30
L33
L36
S14
Intensity %
L32
100
0
S20
S15
L29
Intensity %
S21
L23
(b)100
0
4000
8000
S9
(a)
6000
m/z
10000
12000
1400
X5
L3
L4
L2
L6
L13
S7
S5
L15
L16
S12
S8 L17
Intensity %
100
0
0
14000
S3
Intensity %
(b)100
16000
18000
20000
22000
24000
26000
28000
30000
320
m/z
Fig. 3-2-2. MALDI mass spectra of purified ribosomal proteins (a) and cell lysate (b)
of Lb. bulgaricus NBRC 13953T.
サブユニットタンパク質が帰属され、菌体破砕液ではさらに 6 種類のリボソームサブユニ
ットタンパク質（L23, L29, S3, S15, S20, および S21）が帰属された（Fig. 3-2-2）。但し、
菌体破砕液では L35 が観測されなかったため、結果として菌体破砕液で帰属されたリボソ
-92-
ームサブユニットタンパク質は合計 39 種類であった。なお、L35 のピークが観測されなか
ったのは、L29 が高強度で観測されたために、ピークが重複して隠されたためであると考
えられる。
精製リボソームタンパク質画分の MALDI-MS 測定では、ピークが観測されにくいリボソ
ームサブユニットタンパク質があることが知られている。例えば、大腸菌(Escherichia coli)
の L20 は、観測するのは困難であることが報告されている[2, 8]。E. coli の場合、70S リボ
ソーム内で、L20 と L23 は 23S rRNA と結合しており[9]、S15 と S20 は 16S rRNA と結
合している[10]。本研究で用いた各菌株の 70S リボソームも、E. coli と基本的には同じ高
次構造を有していると考えられる。
そのため、St. thermophilus ATCC BAA-491 の L20 や、
Lb. bulgaricus NBRC 13953T の L23、S15、および S20 が、精製リボソームタンパク質画
分では観測されなかったのは、これらが精製工程で rRNA と共に除去されたためであると
考えられる。このように、タンパク質の精製工程において特定のリボソームサブユニット
タンパク質の損失が起こり得るため、菌体破砕液を試料に用いる方が好ましい。
異なる試料調製法によって得られたリボソームサブユニットタンパク質のマススペクト
ルを詳細に比較したところ、精製リボソームタンパク質画分では、L33、L36、および S14
のピークが若干シフトしていることが分かった。Fig. 3-2-3 に、S14 付近の St. thermophilus
ATCC BAA-491 (a)と Lb. bulgaricus NBRC 13953T (b)の MALDI マススペクトルを示す。
いずれも上段に精製リボソームタンパク質画分、下段に菌体破砕液の MALDI マススペク
トルを示している。菌体破砕液の観測質量は、S14 の[M + H]+イオンの計算質量とよく一
致している。興味深いことに、両菌株で精製リボソームタンパク質画分の S14 の観測ピー
クは、計算質量よりも 4 Da だけ低質量側にシフトした。その他、L33 と L36 については、
精製リボソームタンパク質画分で、2 Da だけ低質量側へのピークシフトが起こっているこ
とが明らかになった。これらのリボソームサブユニットタンパク質は、亜鉛フィンガーモ
チーフ(zinc-finger motif)あるいは亜鉛リボンモチーフ(zinc-ribbon motif)として知られる
C-x-x-C 配列（C: システイン残基、x: いずれかのアミノ酸残基）を有している[11-15]。こ
れは、生体内で亜鉛イオン(Zn2+)と配位結合して、タンパク質の折りたたみ構造を維持する
-93-
(a)
(b)
MAKKSLIAKNKRPAKFSTQAYTRCERCGRPHSVYR
KFKLCRVCFRQLAHRGQIPGVTKASW
S14
S14
7025.9
6983.1
7026.0
6986.7
*
6965.7
6954.0
*
L32
-3.6 Da
6961.6
-4.1 Da
MAKTSQKVRNHRPAKFSSREYTRCERCGRPHSVYR
KFGLCRICLKELGHKGQIPGLKKASW
*
6900
6920
*
6940
m/z
6960
6980
7000
6950
6970
6990
m/z
7010
7030
7050
Fig. 3-2-3. MALDI mass spectra around the peak of S14 for St. thermophilus ATCC
BAA-491 (A) and Lb. bulgaricus NBRC 13953T (B), together with amino acid
sequence of S14. Upper trace: purified ribosomal protein, bottom: cell lysate.
Underlines in the amino acid sequences indicate C-x-x-C motif. The peaks with
asterisks would be non-ribosomal proteins.
役割をもつ。この C-x-x-C 配列は、S14 に 2 箇所、L33 と L36 には 1 箇所ずつ存在する。
すなわち、-4 Da および-2 Da のピークシフトは、Zn2+の解離により C-x-x-C 配列間でジス
ルフィド結合が形成したためであると考えられる。そこで、このことを検証するために、
1,5- ジ ア ミ ノ ナ フ タ レ ン (1,5-diaminonaphtharene, DAN) を マ ト リ ッ ク ス 剤 に 用 い た
MALDI-MS 測定を行った。このマトリックス剤は、試料分子中のジスルフィド結合を還元
する効果を有しており、他のマトリックス剤を用いた解析結果と比較することにより、ジ
スルフィド結合の有無や数を解析することができる[16, 17]。
Fig. 3-2-4 に、DAN を用いて観測された精製リボソームタンパク質の S14 付近のマスス
ペクトルを示す。DAN をマトリックス剤として用いた場合、S14 のピークは m/z 7027.1
に観測され、シナピン酸(SA)を用いた場合に観測される m/z 7025.0 よりも 2Da だけ増加し
ており、少なくとも 1 組のジスルフィド結合が存在することを示している。もう 1 組のジ
スルフィド結合は、立体構造の内部に存在するために還元されなかったのではないかと考
えられる。この結果から、C-x-x-C 配列を有するリボソームサブユニットタンパク質は、精
製リボソームタンパク質画分中では、ジスルフィド結合を形成していることが確認された。
-94-
リボソームタンパク質を精製する際に、rRNA の除去工程で氷酢酸を加えるが、その過程で
Zn2+の解離とジスルフィド結合の形成が起こった可能性が考えられる。
以上の結果から、特定のリボソームサブユニットタンパク質の損失と、タンパク質精製
工程でのジスルフィド結合の形成を防ぎ、
正確にリボソームサブユニットタンパク
質を観測するためには、精製リボソーム
タンパク質画分よりもむしろ菌体破砕液
を試料として用いることが好ましいこと
が分かった。しかも、タンパク質精製が
不要になることにより、試料調製は著し
く迅速かつ簡便になる。そのため、以降
の解析は、菌体破砕液のマススペクトル
を用いて行った。
Fig. 3-2-4. MALDI mass spectra of purified
ribosomal protein around the peak of S14
using DAN (upper) and SA (botom) as
matrices.
(2) St. thermophilus のリボソームタンパク質のキャラクタリゼーション
ゲノム解読された 2 株の St. thermophilus（ATCC BAA-250 株および ATCC BAA-491
株）の MALDI マススペクトルを比較解析して、各リボソームサブユニットタンパク質の
発現質量の検証を行った。Fig. 3-2-5 に、全範囲の MALDI マススペクトルを、Fig. 3-2-6
に m/z 9500-12000 における MALDI マススペクトルの拡大図を比較して示す。いくつかの
リボソームサブユニットタンパク質では、観測されたピークの m/z 値が異なっており、こ
れは菌株の違いによりアミノ酸配列が異なっていることを反映している。Table 3-2-1 およ
び Table 3-2-2 に、2 株の St. thermophilus で帰属されたリボソームサブユニットタンパク
質の種類、Swiss-Prot/TrEMBL のアクセッション番号、計算質量、および N 末端メチオニ
ン切断の有無をまとめて示す。帰属されたリボソームサブユニットタンパク質の数は、
ATCC BAA-250 株で 40 種類、ATCC BAA-491 株で 42 種類であった。
両菌株で同一の翻訳アミノ酸配列が登録されているリボソームサブユニットタンパク質
-95-
のうち、29 種類は実際に MALDI マススペクトル上で同一の m/z 値でピークが観測された。
これらの名称を、Table 3-2-1 および Table 3-2-2 において、太字で示した。これらは、St.
thermophilus を同定するためのバイオマーカーになり得る。
L20
correct L18
L14L19
S11
S13
L22
S10
L23
S6
S17
L24
S18
L31
S16
S15
S19
L32
L33
L34
L36
L30
S14
L28
S21
(a)
L35
L29
correct S20
X5
L18
S20
(b)
4000
6000
8000
10000
m/z
12000
14000
S4
S3
L5
S5
L9
S7
S8
L2
L13
L6
L15
S9
L17
(a)
S12
X5
(b)
14000
16000
18000
20000
22000
24000
26000
28000
30000
32000
m/z
Fig. 3-2-5. MALDI mass spectra of St. thermophilus ATCC BAA-250 (a) and ATCC
BAA-491 (b). Arrows indicate mass shifts of mutated ribosomal subunit proteins
compared with those of ATCC BAA-250.
-96-
L24
L23
S10
S6
S17
Intensity %
S15
(a)
S19
S16
100
0
100
S17
S10
L24
Intensity %
S19
(b)
0
9500
10000
10500
11000
11500
12000
m/z
Fig. 3-2-6. Partial MALDI mass spectra of cell lysates of St. thermophilus ATCC
BAA-491 (a) and ATCC BAA-250 (b).
一方、2 菌株間で異なる翻訳アミノ酸配列が登録されているリボソームサブユニットタン
パク質は、実際に異なる m/z 値でピークが観測された。これらのリボソームサブユニット
タンパク質は、St. thermophilus の株レベルでの識別に有用なバイオマーカーになり得る。
12 種類のリボソームサブユニットタンパク質（L1、L3、L7/L12、L10、L11、L16、L21、
L25、L27、S1、および S2）については、いずれの菌株でもピークは帰属されなかった。
S1（分子量約 44000）や S2（分子量約 28000）のように、分子量が大きいタンパク質は、
MALDI-MS でピークを観測するのが困難である。また、N 末端メチオニン残基の切断以外
の翻訳後修飾が起こったリボソームサブユニットタンパク質は、本法でピークの帰属を行
うことはできない。これまでに、E. coli [2]、Rhodopseudomonas palustris [3]、Thermas
thermophilus [4]、および Caurobacter crentus [5]について、L1、L3、L7/L12、L11、お
よび L27 の翻訳後修飾が報告されている。しかし、これらはいずれもグラム陰性菌であり、
これらとは系統分類学的にかなり遠縁のグラム陽性菌である St. thermophilus では、実際
にどのような翻訳後修飾が起こるのかは全く明らかになっていない。そのため、本研究で
-97-
Table 3-2-1. Assigned ribosomal subunit proteins for cell lysates of S. thermophilus
ATCC BAA-250.
Protein
m/z values
Errors
2nd
Met.
Accession
Intensity d
calculated c
observed in Da
in ppm residue
name a
loss
number b
Large subunit proteins
Q5M2B6
29828.4
29828.3
-0.1
-3
G
yes
+
L2
L5
Q5M2C5
19698.9
19698.5
-0.4
-20
A
yes
+
Q5M2C8
19327.9
19328.3
0.4
21
S
yes
+
L6
L9
Q5M252
17172.1
17170.7
-1.4
-82
K
+
Q5M6E7
16172.9
16174.0
1.1
68
N
+
L13
Q5M2C3
13080.2
13079.7
-0.5
-38
I
+
L14
L15
Q5M2D2
15545.9
15545.8
-0.1
-6
K
+
Q5M2E0
14330.4
14329.5
-0.9
-63
A
yes
+
L17
Q5M427
13147.4
13147.0
-0.4
-30
N
+
L19
Q5M472
13502.9
13502.5
-0.4
-30
A
yes
++
L20
Q5M2B8
12286.3
12286.3
0.0
0
A
yes
++
L22
Q5M2B5
10790.7
10791.9
1.2
111
N
+
L23
L24
Q5M2C4
10871.8
10872.0
0.2
18
F
++++
Q5M294
6782.1
6781.9
-0.2
-29
A
yes
++
L28
Q5M2C1
7901.2
7901.7
0.5
63
K
+++
L29
Q5M2D1
6268.3
6268.6
0.3
48
A
yes
++++
L30
Q5M4X0
9326.4
9326.5
0.1
11
K
++++
L31
Q5M278
6650.6
6650.1
-0.5
-75
A
yes
++++
L32
Q5M277
5926.0
5925.9
-0.1
-17
R
+
L33
Q5M2K7
5346.4
5346.7
0.3
56
K
++
L34
L35
Q5M471
7680.1
7679.7
-0.4
-52
P
yes
+++
Q5M2D6
4452.4
4452.7
0.3
67
K
++
L36
Small subunit proteins
S3
Q5M2B9
23942.6
23944.8
2.2
92
G
yes
+
Q5M255
22940.3
22939.2
-1.1
-48
S
yes
+
S4
Q5M2D0
16920.6
16918.5
-2.1
-124
A
yes
+
S5
Q5M2Q3
10980.4
10980.7
0.3
27
A
yes
+
S6
Q5M2M5
17633.3
17632.7
-0.6
-34
S
yes
+
S7
Q5M2C7
14656.0
14654.7
-1.3
-89
V
yes
+
S8
Q5M6E6
14109.2
14108.8
-0.4
-28
A
yes
++
S9
S10
Q5M2B2
11497.4
11497.7
0.3
26
A
yes
++
Q5M2D8
13255.2
13255.8
0.6
45
A
yes
+
S11
Q5M2M4
14926.4
14925.8
-0.6
-40
P
yes
++
S12
Q5M2D7
13290.4
13290.3
-0.1
-8
A
yes
++
S13
S14
Q5M2C6
6939.2
6938.5
-0.7
-101
A
yes
++++
Q5M6A7
10387.0
10387.0
0.0
0
A
yes
+++
S15
Q5M387
10267.9
10267.8
-0.1
-10
A
yes
++++
S16
S17
Q5M2C2
10008.6
10008.8
0.2
20
E
++
Q5M2Q5
9137.6
9137.4
-0.2
-22
A
yes
++++
S18
S19
Q5M2B7
10492.1
10492.2
0.1
10
G
yes
+++
S21
Q5M3E1
6794.0
6793.2
-0.8
-118
S
yes
++
a
The subunit proteins denoted by bold type have the same amino acid sequence as ATCC BAA-491.
b
Accession number of Swiss-Prot/TrEMBL. c Calculated considering N-terminal methionine loss. d
Judged by relative peak intensities to L30: +; <5%, ++; 5-25%, +++; 25-50%, ++++; 50-100%.
-98-
Table 3-2-2. Assigned ribosomal subunit proteins for cell lysates of S. thermophilus
ATCC BAA-491.
m/z values
Errors
2nd
Met.
Intensity d
Protein
Accession
c
a
b
observed
in
Da
in
ppm
calculated
residue
loss
name
number
Large subunit proteins
Q03IF4
29828.4
29825.2
-3.2
-108
G
yes
+
L2
L5
Q03IG3
19699.9
19700.6
0.7
36
A
yes
+
Q03IG6
19327.9
19327.8
-0.1
-9
S
yes
+
L6
L9
Q03I91
17100.0
17100.0
0.0
-4
K
+
Q03MU6
16172.9
16173.2
0.3
19
N
++
L13
Q03IG1
13080.2
13080.2
0.0
4
I
+
L14
L15
Q03IH0
15531.9
15531.2
-0.7
-42
K
+
Q03IH8
14330.4
14330.1
-0.3
-18
A
yes
++
L17
L18
Q03IG7
12924.9
12923.8
-1.1
-84
I
+
Q03KD6
13147.4
13146.7
-0.7
-56
N
+
L19
Q03KJ1
13502.9
13502.5
-0.4
-34
A
yes
++
L20
Q03IF6
12286.3
12286.2
-0.1
-9
A
yes
++
L22
Q03IF3
10790.7
10791.4
0.7
68
N
+
L23
L24
Q03IG2
10841.8
10842.4
0.6
56
F
+++
L28 e
Q03IC6
6782.1
6781.4
-0.7
-94
A
yes?
+++
Q03IF9
7901.2
7901.4
0.2
26
K
++++
L29
Q03IG9
6268.3
6268.3
0.0
-13
A
yes
++++
L30
Q03L85
9326.4
9326.6
0.2
16
K
+++
L31
Q03IB0
6650.6
6649.9
-0.7
-94
A
yes
+++
L32
Q03IA9
5926.0
5925.7
-0.3
-38
R
+
L33
Q03IQ3
5346.4
5346.5
0.1
13
K
++
L34
L35
Q03KJ0
7690.1
7690.1
0.0
-3
P
yes
+
Q03IH4
4452.4
4452.4
0.0
-14
K
++++
L36
Small subunit proteins
S3
Q03IF7
23964.6
23964.7
0.1
3
G
yes
+
Q03I94
22940.3
22938.5
-1.8
-80
S
yes
+
S4
Q03IG8
16920.6
16920.9
0.3
15
A
yes
+
S5
Q03IV3
10980.4
10981.5
1.1
97
A
yes
+
S6
Q03IS0
17633.3
17632.6
-0.7
-39
S
yes
+
S7
Q03IG5
14656.0
14655.4
-0.6
-45
V
yes
+
S8
Q03MU5
14109.2
14108.5
-0.7
-49
A
yes
++
S9
S10
Q03IF0
11425.3
11425.6
0.3
20
A
yes
++
Q03IH6
13255.2
13255.7
0.5
36
A
yes
++
S11
Q03IR9
14926.4
14925.2
-1.2
-82
P
yes
++
S12
Q03IH5
13290.4
13290.1
-0.3
-26
A
yes
++
S13
S14
Q03IG4
6966.3
6965.7
-0.6
-77
A
yes
+++
Q03MP3
10387.0
10387.1
0.1
14
A
yes
+++
S15
Q03JG3
10267.9
10267.5
-0.4
-40
A
yes
+++
S16
S17
Q03IG0
10027.7
10027.9
0.2
23
E
++
Q03IV5
9137.6
9137.4
-0.2
-20
A
yes
+++
S18
S19
Q03IF5
10420.0
10420.4
0.4
32
G
yes
++
S20
Q03L31
8290.5
8290.7
0.2
22
A
yes
++++
S21 e
Q03JL0
6779.9
6781.4
1.5
221
S
yes?
+++
a
The subunit proteins denoted by bold type have the same amino acid sequence as ATCC BAA-250.
b
Accession number of Swiss-Prot/TrEMBL. c Calculated considering N-terminal methionine loss. d
Judged by relative peak intensities to L30: +; <5%, ++; 5-25%, +++; 25-50%, ++++; 50-100%. e
L28 and S21 overlap.
-99-
は、サブユニットタンパク質の名称あるいは翻訳アミノ酸配列の情報だけでは、翻訳後修
飾を受けたリボソームサブユニットタンパク質を予測することはできないと考え、これら
をバイオマーカーの選択対象から除外している。
興味深いことに、2 種類のサブユニットタンパク質（L18 と S20）は、ATCC BAA-491
株でのみピークが帰属された。この結果から、タンパク質データベースに登録されている
ATCC BAA-250 株の L18 および S20 の翻訳アミノ酸配列情報（Swiss-Prot では、L18 は
Q5M2C9、および S20 は Q5M4T9）は、誤っている可能性が考えられる。そこで、これら
の翻訳アミノ酸配列を検証するために、アメリカ国立バイオテクノロジー情報センター
(National Center for Biotechnology Information, NCBI)の BLASTp 検索エンジン[18]を
用いて、ATCC BAA-250 株の S20 の N 末端側 40 アミノ酸残基と高い相同性を有する翻訳
アミノ酸配列を検索した。そして、相同性が高かった他のバクテリア 10 菌株の S20 の翻訳
アミノ酸配列について、日本 DNA データバンク(DNA Data Bank of Japan, DDBJ)の
Clustal W ソフトウェア[19]を用いて、マルチプルアライメント解析（３種以上のアミノ酸
配列の比較解析）を行った。その結果、Table 3-2-3 に示すように、N 末端アミノ酸配列の
Table 3-2-3. Comparison of amino acid sequences at N-terminal side of S20.
Bacteria name
Amino acid sequence (N-terminal side)
1
S. thermophilus LMG18311
S. thermophilus LMD-9
b
a
10
20
30
Accession number at
Swiss-Prot
40
MEVKTLANIK SAIKRAELNV KQNEKNSAQK SALRTVIKAF
Q5M4T9
-----MANIK SAIKRAELNV KQNEKNSAQK SALRTVIKAF
Q03L31
S. thermophilus CNRZ1066
MEVKTLANIK SAIKRAELNV KQNEKNSAQK SALRTVIKAF
Q5M080
S. agalactiae serogroup V
MEVKTLANIK SAIKRAELNV KQNEKNSAQK SAMRTAIKAF
Q8DZZ2
S. pyogenes serotype M2
MEVKTLANIK SAIKRAELNV KANEKNSAQK SAMRTAIKAF
Q1JGL9 c
S. agalactiae serogroup Ia
-----MANIK SAIKRAELNV KQNEKNSAQK SAMRTAIKAF
Q3K1D7 d
S. pneumoniae
-----MANIK SAIKRAELNV KQNEKNSAQK SAMRTAIKAF
Q97RH7 e
S. pyogenes serotype M1
-----MANIK SAIKRAELNV KANEKNSAQK SAMRTAIKAF
P66509 f
S. mutans
-----MANIK SAIKRAELNV KQNNRNSAQK SAMRSAIKAF
Q8DU30
L. lactis subsp. lactis
-----MANIK SAIKRAELNK VANERNAQQK SAMRTLIKKF
Q9CEU5
a
Same as S. thermophilus ATCC BAA-250. b Same as S. thermophilus ATCC BAA-491. c Same sequence is
registered for S. pyogenes serotype M4 (Q1J6D8), S. pyogenes serotype M12 (Q1JBK1 and Q1JLI3) and S.
pyogenes serotype M28 (Q48TC9). d Same sequence for S. agalactiae serotype III (Q8E5P3). e Same sequence
for S. pneumoniae ATCC BAA-255 (Q8CWS0). f Same sequence for S. pyogenes serotype M3 (P66510), S.
pyogenes serotype M6 (Q5XBZ3) and S. pyogenes serotype M28 (P66511).
-100-
長さが異なる 2 種類の配列情報が登録されていることが分かった。一方は、ATCC BAA-250
株の配列と同一の MEVKTLANIK-であり、他方は ATCC BAA-491 株と同じ配列である
MANIK-であった。
さらに詳細に検討するために、ATCC BAA-250 株と ATCC BAA-491 株の S20 遺伝子
(rpsT)について、翻訳開始領域付近の DNA 塩基配列を比較した。その結果、Table 3-2-4
に示すように、両菌株とも、この領域の DNA 塩基配列は全く同じであった。原核生物のメ
ッセンジャーRNA(mRNA)では、開始コドンの 10 残基程度上流側に、シャイン-ダルガー
ノ(Shine-Dalgarno, SD)配列と呼ばれる特徴的な塩基配列（典型的には AGGAGGU）をも
つことが知られている[20]。ATCC BAA-491 株では、S20 遺伝子の開始コドンの上流側に
ある DNA 塩基配列(GGAGGT)が、mRNA 上の SD 配列に対応すると考えられる。一方、
ATCC BAA-250 株では、開始コドンに対応する DNA 塩基配列よりも上流側には SD 配列
に相当する DNA 塩基配列を確認することができなかった。以上の結果から、 ATCC
BAA-250 株の翻訳アミノ酸配列上で 6 番目のロイシン(L)残基のコドン(UUG)に対応する
TTG が、実際には ATCC BAA-491 株の場合と同様に開始コドンに対応するものであると
考えられる（注：原核生物では AUG だけではなく、GUG および UUG も開始コドンにな
り得る。これに対応する DNA 塩基配列は、ATG、GTG、および TTG である）。この修正
を行うと、ATCC BAA-250 株の S20 の翻訳アミノ酸配列は、ATCC BAA-491 株のものと
同一になる。そこで実際に、ATCC BAA-250 株の MALDI マススペクトルにおいて、S20
の修正アミノ酸配列に基づき算出した計算質量に一致するピークが観測されているかどう
か検証した。
Table 3-2-4. Comparison of DNA sequences around the translation initiation site of S20
gene.
strain
DNA sequence and translated amino acid sequencec
LMG18311a GTA TAA TGA CAT AGT TAG ATA AAT TTG GAG GTG AAA ACA TTG GCA AAT ATT AAA
M
LMD-9b
E
V
K
T
L
A
N
I
K
GTA TAA TGA CAT AGT TAG ATA AAT TTG GAG GTG AAA ACA TTG GCA AAT ATT AAA
M A N I K
a
Same as S. thermophilus ATCC BAA-250. b Same as S. thermophilus ATCC BAA-491. c TTG indicates start codon.
Underlined section indicates putative Shine-Dalgarno (SD) sequence.
-101-
Fig. 3-2-7 に、両菌株の m/z 8200-9200 の範囲を拡大した MALDI マススペクトルを示
す。ATCC BAA-250 株のマススペクトル上(Fig. 3-2-7b)では、元の翻訳アミノ酸配列情報
から求めた計算質量 m/z 8992.4 には、ピークは観測されていないが、それよりも 700 Da
も 低 質 量 側 の m/z 8290.6 に 、
3-2-7a)と同様に S20 の計算質量
S20
S18
9137.4
(a)
8290.7
ATCC BAA-491 株 の 場 合 (Fig.
9137.4
(b)
結果から、Swiss-Prot に登録され
8992.4
なピークが観測されている。この
8290.6
(m/z 8290.5)とほぼ一致する明確
ている ATCC BAA-250 株の S20
の翻訳アミノ酸配列情報（アクセ
ッション番号 Q5M4T9）は誤って
おり、ATCC BAA-491 株のものと
同一の翻訳アミノ酸配列に修正す
8200
8400
8600
m/z
8800
9000
92
Fig. 3-2-7. Partial MALDI mass spectra in the
range of m/z 8200-9200 for St. thermophilus
ATCC BAA-491 (a) and ATCC BAA-250 (b).
べきであることが示された。
L18 のアミノ酸配列についても、同様に再解析を行った。Table 3-2-5 に、相同性が高か
った 10 種類のバクテリア由来の L18 の N 末端側アミノ酸配列について、マルチプルアラ
イメント解析の結果を示す。S20 の場合と同様に、長さが異なる 2 種類の N 末端アミノ酸
配列が登録されていた。一方は、ATCC BAA-250 株の配列と同じ MKIVISK-であり、他方
は ATCC BAA-491 株の配列と同じ MISK-であった。さらに、L18 遺伝子(rplR)の翻訳開始
領域の塩基配列を調べたところ、ATCC BAA-250 株の 4 番目のバリン(V)残基のコドン
(GUG)に対応する GTG が、実際には開始コドンに対応していることが示唆された。そこで、
4 番目のバリン残基を開始メチオニン残基に修正し、これが N 末端則（第 2 章参照）に従
って切断されることを考慮して L18 の計算質量(m/z 12938.1)を求め、ATCC BAA-250 株の
MALDI マススペクトルを調べたところ、その位置に明確なピークが観測された（Fig. 3-2-5
-102-
Table 3-2-5. Comparison of amino acid sequences at N-terminal side of ribosomal
protein L18.
Bacteria name
Amino acid sequence (N-terminal side)
1
S. thermophilus LMG18311
a
10
20
Accession number at
Swiss-Prot
30
40
MKIVISKPDK NKLRQKRHRR IRGKLSGTAD RPRLNIFRSN
Q5M2C9
S. thermophilus LMD-9b
---MISKPDK NKLRQKRHRR VRGKLSGTAD RPRLNIFRSN
Q03IG7
S. thermophilus CNRZ1066
MKIVISKPDK NKLRQKRHRR IRGKLSGTAD RPRLNIFRSN
Q5LXS7
S. pyogenes serotype M2
MKIVISKPDK NKIRQKRHRR VRGKLSGTAD RPRLNVFRSN
Q1JJ46 c
S. agalactiae serotype Ia
---MISKPDK NKIRQKRHRR VRGKLSGTAD RPRLNIFRSN
Q3K3V3 d
S. mutans
---MISKPDK NKIRQKRHRR VRGKLSGTAD RPRLNIFRSN
Q8DS29
S. pneumoniae
---MISKPDK NKLRQKRHRR VRGKLSGTAD RPRLNVFRSN
Q97SU6 e
S. pyogenes serotype M1
---MISKPDK NKIRQKRHRR VRGKLSGTAD RPRLNVFRSN
Q9A1V8 f
L. acidophilus
---MISKPDK NKLRLKRHRR IRGKISGTAE RPRLSIFRSN
Q5FM75
L. sakei subsp. sakei
---MISKPDK NKTRQKRHTR VRGKISGTAD CPRLNVFRSN
Q38US7
a
Same as S. thermophilus ATCC BAA-250. b Same as S. thermophilus ATCC BAA-491. c Same sequences are
registered for S. pyogenes serotype M4 (Q1J8Z7), S. pyogenes serotype M12 (Q1JE43 and Q1JP01), and S.
pyogenes serotype M28 (Q48VT3). d Same sequence for S. agalactiae serotype III (Q8E7S5) and S. agalactiae
serotype V (Q8E2B8). e Same sequence for S. pneumoniae ATCC BAA-255 (Q8CWV2). f Same sequence for S.
pyogenes serotype M3 (Q7CFK6), S. pyogenes serotype M6 (Q5XEB9), and S. pyogenes serotype M18
(Q7CNP3).
Table 3-2-6. Corrected ribosomal subunit proteins of S. thermophilus ATCC BAA-250.
protein
accession
m/z values
Errors
2nd
Met.
name
number a
in Da
residue
loss
L18
Q5M2C9
12938.9
12938.7
-0.2
-15
I
S20
Q5M4T9
8290.5
8290.6
0.1
12
A
intensity c
calculated
b
observed
in ppm
+
yes
++++
a
Accession number of Swiss-Prot/TrEMBL. b Calculated with considering to N-terminal
methionine loss. c Judged by relative peak intensities to L30: +; <5%, ++; 5-25%, +++; 25-50%,
++++; 50-100%.
参照）。以上のようにして帰属された ATCC BAA-250 株の S20 および L18 の解析結果は、
Table 3-2-6 にまとめた。
なお、Swiss-Prot に登録されている情報は、これまで何度か更新されており、2007 年 5
月 20 日のリリース 52. 3 までに、St. thermophilus ATCC BAA-250 の 8 種類のサブユニッ
トタンパク質（L9、L10、L15、L21、L31、S4、S6、および S21）について、N 末端アミ
ノ酸配列が冗長であるという誤りが修正された。これらのうち、L10 と L21 を除く 6 種類
のリボソームサブユニットタンパク質については、このデータベースの更新以前に、本研
-103-
究の遂行過程でこれらの誤りを指摘し、正しいアミノ酸配列を提案していた[21]。そこで指
摘したアミノ酸配列は、その後 Swiss-Prot が修正・更新した配列情報と同一であり、本研
究のアプローチの正しさが支持されている。
(3) Lb. burglarious の菌体破砕液中のリボソームタンパク質のキャラクタリゼーション
前節で述べたアプローチによって、次に Lb. bulgaricus のゲノム解読株 2 株（NBRC
13953T 株および ATCC BAA-365 株）のリボソームサブユニットタンパク質のキャラクタ
リゼーションを行った。この 2 株の MALDI マススペクトルを Fig. 3-2-8 に、ピークの帰属
に関する詳細な解析結果を Table 3-2-7 および Table 3-2-8 に示す。いずれの菌株でも、39
種類のリボソームサブユニットタンパク質が帰属された。そして、ATCC BAA-365 株の 3
種類のリボソームサブユニットタンパク質（L13、L20、および S4）について、翻訳アミノ
酸配列情報の誤りが見出された。
Table 3-2-9 に、両菌株の L13、L20、および S4 の Swiss-Prot/TrEMBL タンパク質デー
タベースに登録されている翻訳アミノ酸配列とアクセッション番号を示す。いずれのリボ
ソームサブユニットタンパク質でも、ATCC BAA-365 株の翻訳アミノ酸配列は、NBRC
13953T 株(ATCC 11842T 株として登録)のものよりも短い傾向がある。これら 3 種類のリボ
ソームサブユニットタンパク質は、NBRC 13953T 株ではいずれもピークが帰属されたため、
ATCC BAA-365 株の 3 種類のリボソームサブユニットタンパク質の N 末端アミノ酸配列が
不足していると考えられる。そこで、これらについて、NBRC 13953T 株の N 末端アミノ酸
配列情報を参考にして、ATCC BAA-365 株の N 末端アミノ酸配列を修正した。そして、修
正したアミノ酸配列をもとに BLAST 検索した結果、Lb. acidophilus, Lb. johnsonii, Lb.
casei, Lb. sakei, Lb. brevis, および Lb. plantarum など、他の Lactobacillus 属の乳酸菌の
登録情報が一致し、この N 末端側アミノ酸配列の修正結果が支持された。さらに N 末端ア
ミノ酸配列を確認するために、ATCC BAA-365 株の各リボソームサブユニットタンパク質
について、翻訳開始領域の上流側の DNA 塩基配列を NCBI Entrez ヌクレオチドデータベ
-104-
S13
L20
S11
L22
L18
S10
L23
S16
S17
L31
L34
L24
S15
S19
S20
S18
S21
S14
L32
L33
L36
L29
L30
X5
L28
(a)
(b)
correct L20
X2
4000
8000
10000
m/z
12000
S3
S4
L3
S7
S5
L4
L13
L15
L16
L2
L6
14000
16000
correct S4
correct L13
(b)
14000
X5
S9
S8 L17
S12
(a)
6000
18000
20000
22000
24000
26000
28000
30000
32000
m/z
Fig. 3-2-8. MALDI mass spectra of Lb. bulgaricus NBRC 13953T (a) and ATCC
BAA-365 (b). Arrows indicate mass shifts of mutated ribosomal subunit proteins
compared with those of NBRC 13953T.
-105-
Table 3-2-7. Assigned ribosomal subunit proteins of L. bulgaricus NBRC13953T.
protein
name
accession
number a
m/z values
calculated
b
Errors
observed
in Da
in ppm
2nd
residue
met. loss
intensity c
yes
+
large subunit proteins
L2
Q1GBL5
30139.5
30137.6
-1.9
-63
A
L3
Q1GBL8
22635.1
L4
Q1GBL7
22460.9
22638.2
3.1
137
T
yes
+
22462.1
1.2
53
A
yes
+
L6
Q1GBK3
19142.9
L13
Q1GBI6
16392.0
19141.9
-1.0
-52
S
yes
+
16392.4
0.4
24
R
L15
Q1GBJ9
15635.0
15635.3
L16
Q1GBL1
16192.9
16192.7
0.3
19
K
-0.2
-12
P
yes
++
L17
Q1GBJ1
14272.6
14272.2
L18
Q1GBK2
12926.8
12926.0
-0.4
-28
S
yes
++
-0.8
-62
I
L20
Q1G9B4
13323.7
13323.6
-0.1
-8
P
yes
+
L22
Q1GBL3
12612.6
12612.1
-0.5
-40
A
yes
++
L23
Q1GBL6
11259.0
11258.7
-0.3
-27
D
++
L24
Q1GBK7
8184.4
8185.3
0.9
110
F
++
L28
Q1G9J5
6726.9
6726.7
-0.2
-30
A
L29
Q1GBL0
7681.8
7682.0
0.2
26
K
L30
Q1GBK0
6543.7
6543.8
0.1
15
T
L31
Q1GBQ0
9407.6
9408.0
0.4
43
K
L32
Q1GAM0
7025.9
7026.0
0.1
14
A
yes
+++
L33
Q1G9D2
5730.6
5730.6
0.0
0
A
yes
++
L34
Q1G7Z1
5295.3
5294.8
-0.5
-94
S
yes
+
L36
Q1GBJ5
4409.4
4409.8
0.4
91
K
++
+
++
yes
++++
++++
yes
++++
+++
++
small subunit proteins
S3
Q1GBL2
24723.4
24725.6
2.2
89
G
yes
+
S4
Q1GAV4
23389.7
23387.2
-2.5
-107
S
yes
+
S5
Q1GBK1
17875.5
17876.9
1.4
78
A
yes
+
S7
Q1GBM1
17820.3
17821.0
0.7
39
P
yes
++
S8
Q1GBK4
14322.5
14323.2
0.7
49
V
yes
++
S9
Q1GBI5
14193.5
14193.5
0.0
0
A
yes
++
S10
Q1GBL9
11447.2
11447.1
-0.1
-9
A
yes
+++
S11
Q1GBJ3
13540.5
13542.1
1.6
118
P
yes
++
S12
Q1GBM2
14797.1
14796.4
-0.7
-47
P
yes
++
S13
Q1GBJ4
13040.9
13040.4
-0.5
-38
A
yes
++
S14
Q1GBK5
6987.2
6986.7
-0.5
-72
A
yes
+++
S15
Q1GAQ3
10341.7
10341.9
0.2
19
A
yes
+++
Q1G9L2
10377.0
10378.5
1.5
145
S
yes
++++
Q1GBK9
10380.0
10378.5
-1.5
-145
S
yes
++++
S16
e
S17e
S18
Q1GC35
8798.3
8798.3
0.0
0
P
yes
++++
S19
Q1GBL4
10152.7
10152.2
-0.5
-49
S
yes
++++
S20
Q1GAQ4
8832.3
8832.8
0.5
57
P
yes
++++
Q1G9W2
6965.9
6965.6
-0.3
-43
A
yes
+++
S21
a
The subunit proteins denoted by bold type have same amino acid sequence as ATCC BAA-365. b Accession number
of Swiss-Prot/TrEMBL. c Calculated with considering to N-terminal methionine loss. d Judged by relative peak
intensities to L28: +; <5%, ++; 5-25%, +++; 25-50%, ++++; 50-100%. e S16 and S17 are overlapped.
-106-
Table 3-2-8. Assigned ribosomal subunit proteins of L. bulgaricus ATCC BAA-365.
protein
name
accession
number a
m/z values
calculated b
Errors
observed
in Da
in ppm
2nd
residue
met. loss
intensity c
large subunit proteins
L2
Q04C12
30139.5
30139.0
-0.5
-17
A
yes
+
L3
Q04C15
22635.1
22635.8
0.7
31
T
yes
+
L4
Q04C14
22460.9
22461.8
0.9
40
A
yes
+
L6
Q04C00
19142.9
19143.2
0.3
16
S
yes
+
L13 correct
Q04BY3
16392.0
16392.2
0.2
12
R
++
L15
Q04BZ6
15635.0
15634.4
-0.6
-38
K
++
L16
Q04C08
16192.9
16192.6
-0.3
-19
P
yes
++
L17
Q04BY8
14272.6
14272.6
0.0
0
S
yes
++
L18
Q04BZ9
12926.8
12926.2
-0.6
-46
I
+++
L20 correct
Q049G3
13323.7
13324.9
1.2
90
P
+++
L22
Q04C10
12612.6
12612.2
-0.4
-32
A
L23
Q04C13
11259
11258.7
-0.3
-27
D
L24
Q04C04
8183.5
8184.7
1.2
147
F
L28
Q049Q0
6726.9
6726.8
-0.1
-15
A
L29
Q04C07
7681.8
7681.8
0.0
0
K
L30
Q04BZ7
6543.7
6543.7
0.0
0
T
L31
Q04C49
9407.6
9407.8
0.2
21
K
L32
Q04B07
7025.9
7026.2
0.3
43
A
yes
+++
L33
Q049I1
5730.6
5730.1
-0.5
-87
A
yes
++++
L34
Q047F6
5295.3
5295.4
0.1
19
S
yes
L36
Q04BZ2
4409.4
4409.9
0.5
113
K
24723.4
24725.9
2.5
101
G
yes
++
+++
++
yes
++++
++++
yes
++++
++++
+++
+++
small subunit proteins
S3
Q04C09
yes
+
S4 correct
Q04B92
23389.7
23392.4
2.7
115
S
yes
+
S5
Q04BZ8
17875.5
17875.9
0.4
22
A
yes
++
S7
Q04C18
17820.3
17820.9
0.6
34
P
yes
++
S8
Q04C01
14322.5
14322.6
0.1
7
V
yes
++
S9
Q04BY2
14193.5
14193.2
-0.3
-21
A
yes
++
S10
Q04C16
11447.2
11447.5
0.3
26
A
yes
+++
S11
Q04BZ0
13540.5
13541.4
0.9
66
P
yes
++
S12
Q04C19
14797.1
14796.6
-0.5
-34
P
yes
++
S13
Q04BZ1
13040.9
13041.7
0.8
61
A
yes
++
S14
Q04C02
6987.2
6987.1
-0.1
-14
A
yes
++++
S15
Q04B40
10341.7
10341.9
0.2
19
A
yes
+++
S16e
Q049R6
10377.0
10378.5
1.5
145
S
yes
++++
S17e
Q04C06
10380.0
10378.5
-1.5
-145
S
yes
++++
S18
Q04CW7
8867.4
8867.5
0.1
11
P
yes
++++
S19
Q04C11
10152.7
10152.5
-0.2
-20
S
yes
++++
S20
Q04B41
8832.3
8832.4
0.1
11
P
yes
++++
Q04A16
6965.9
6964.9
-1.0
-144
A
yes
+++
S21
a
T b
The subunit proteins denoted by bold type have same amino acid sequence as NBRC13953 . Accession number
of Swiss-Prot/TrEMBL. c Calculated with considering to N-terminal methionine loss. d Judged by relative peak
intensities to L28: +; <5%, ++; 5-25%, +++; 25-50%, ++++; 50-100%. e S16 and S17 are overlapped.
-107-
ース[22]より入手し、NBRC 13953T 株の各塩基配列と比較した。
Table 3-2-10 に、両菌株の L13 遺伝子(rplM)とその上流側の DNA 塩基配列を比較して示
す。両菌株に対して同定された N 末端メチオニン残基の位置が異なっているにもかかわら
ず、翻訳開始領域周辺の DNA 塩基配列は同一である。そのため、ATCC BAA-365 株の L13
の開始コドンに対応するとされる TTG は、正しくは NBRC 13953T 株の場合と同様に 18
番目のロイシン(L)残基のコドンに対応すると考えられる。しかも、NBRC 13953T 株の L13
遺伝子では、開始コドンに対応する TTG から約 10 塩基上流側で SD 配列に対応すると思
Table 3-2-9. Comparison of registered N-terminal amino acid sequences of L13, L20,
and S4 of L. bulgaricus ATCC 11842Tand ATCC BAA-365 on the TrEMBL database.
Subunit
protein
Strain
N-terminal amino acid sequences
L13
ATCC 11842T a
1
10
20
ATCC 11842T a
ATCC 11842T a
MID ATDVSLGRLS TAVATILRGK
Q04BY3
MPRVKGGTVT RARRKKVLKL AKGYRGSKHV QFKAASTQLF
Q1G9B4
MKL AKGYRGSKHV QFKAASTQLF
Q049G3
Q1GAV4
MSRYTGPSWK RSRRLGISLS GTGKELARRS YIPGQHGPNH
BAA-365
a
40
Q1GBI6
BAA-365
S4
30
MRTTPLAKTS EIERKWYLID ATDVSLGRLS TAVATILRGK
BAA-365
L20
Accession number at
Swiss-Prot/TrEMBL
Q04B92
MS GTGKELARRS YIPGQHGPNH
T
Same as NBRC 13953 used in this study.
Table 3-2-10. Comparison of DNA sequences around the translation initiation region of
the ribosomal protein L13 gene.
strains
DNA sequences and translated amino acid sequences b
ATCC 11842T a
AAT TAA ACG GAG GAA TTT ACA TTG CGT ACT ACA CCA TTA GCA AAG ACT AGT GAA
ATCC BAA-365
AAT TAA ACG GAG GAA TTT ACA TTG CGT ACT ACA CCA TTA GCA AAG ACT AGT GAA
M
R
T
T
P
L
A
K
T
S
E
continued
ATCC 11842T
ATT GAA CGT AAG TGG TAC TTG ATT GAC GCT ACT GAT GTT TCA TTG GGT CGT CTT
I
ATCC BAA-365
E
R
K
W
Y
L
I
D
A
T
D
V
S
L
G
R
L
ATT GAA CGT AAG TGG TAC TTG ATT GAC GCT ACT GAT GTT TCA TTG GGT CGT CTT
M
I
D
A
T
D
V
S
L
G
R
L
Same as NBRC 13953T used in this study. b TTG indicates start codon. Underlined section indicates putative SD
sequence.
a
-108-
われる DNA 塩基配列(GGAGGAA)が確認でき、MALDI マススペクトルでも NBRC 13953T
株の L13 のピークが確認された（Fig. 3-2-8a）。したがって、ATCC BAA-365 株の L13 の
N 末端アミノ酸配列は、NBRC 13953T 株のものと同一であり、[M + H]+イオンの計算質量
は m/z 16392.0 であると推測できる。Fig. 3-2-8 に示すように、その m/z 値に明確なピーク
が観測されており、以上の修正が正しいことが裏付けられた。
ATCC BAA-365 株の L20 と S4 の N 末端アミノ酸配列も同様に修正した。L20 の N 末
端側には 17 アミノ酸残基 (MPRVKGGTVTRARRKKV)を、S4 の N 末端側には 18 アミノ
酸残基 (MSRYTGPSWKRSR)をそれぞれ加え、もとの N 末端メチオニン残基をロイシン
残基に修正することによって、結果として NBRC 13953T 株のものと同じアミノ酸配列にな
った。修正した L20 と S4 は、m/z 13323.7 および m/z 23389.7 付近にそれぞれ明確なピー
クが観測されており（Fig. 3-2-8）、以上の修正結果が支持された。
(4) 翻訳アミノ酸配列の登録情報の誤りと変異に関する議論
以上のように、同種で菌株が異なるバクテリアの MALDI マススペクトルを比較して、
翻訳アミノ酸配列情報を検証した。その結果、Swiss-Prot/TrEMBL タンパク質データベー
スに登録されている翻訳アミノ酸配列に、いくつかの誤りを見つけることができた。これ
らの誤りは、全て N 末端メチオニン残基の位置が誤っていることが原因であった。このよ
うな誤りが起こる一つの理由として、原核生物の開始コドンに、通常の AUG に加えて 2 種
類（GUG と UUG）が存在することが関係していると考えられる。St. thermophilus ATCC
BAA-250 の S20 では、バリン(V)残基をコードするコドンと同じ GUG が正しい開始コドン
であり、L18 では、ロイシン(L)残基をコードするコドンと同じ UUG が正しい開始コドン
であった。しかも興味深いことに、開始コドンが誤って認識されている位置は、 St.
thermophilus ATCC BAA-250 では、いずれも実際より 3～5 アミノ酸残基分だけ上流側で
あり、一方 Lb. bulgaricus ATCC BAA-365 では、いずれも実際より 17～18 アミノ酸残基
分だけ下流側であった。このような開始コドンの誤認識の傾向は、それぞれのゲノム解読
プロジェクトで遺伝子領域や機能などの情報を注釈（アノテーション）する際に用いられ
-109-
たプログラムの特性の違いに起因している可能性が考えられる。
TrEMBL と SwissProt の各タンパク質データベースを包括する UniProt Knowledgebase
[23]では、バクテリアの全ゲノム解読結果が登録されると、コンピュータにより自動アノテ
ーションされた遺伝子の DNA 塩基配列が EMBL ヌクレオチドデータベースに登録され、
続いて機械的に翻訳されたアミノ酸配列が、まず TrEMBL タンパク質データベースに登録
される。そのため、この段階では遺伝子領域および翻訳アミノ酸配列の全長が誤っている
可能性が高い。この TrEMBL の登録情報は、専門家によって相同性解析などにより翻訳ア
ミノ酸配列情報が精査され、修正が加えられた後に、Swiss-Prot タンパク質データベース
に登録される。そのため、一般的には Swiss-Prot タンパク質データベースの登録情報は信
頼性が高いと考えられている。実際に、St. thermophilus ATCC BAA-250 の場合では、8
種類のリボソームサブユニットタンパク質の翻訳アミノ酸配列情報が TrEMBL から
Swiss-Prot に更新される過程で修正された。それでもなお、2 種類のリボソームサブユニ
ットタンパク質（L18 および S20）が修正されずに、Swiss-Prot に登録されている。もし
翻訳アミノ酸配列情報が誤って登録されると、新たに相同性解析して登録される類縁菌の
情報にも影響が及ぶ可能性がある。例えば、St. thermophilus ATCC BAA-250 の L18 と
S20 の翻訳開始領域の誤認識は、先にゲノム解読された St. thermophilus CNRZ 1066 およ
び他の Streptococcus 属バクテリアの翻訳アミノ酸配列情報（Table 3-2-4 および Table
3-2-5）を参照したことにより引き起こされた可能性が考えられる。したがって、タンパク
質の発現質量を MALDI-MS で確認することによって、登録されているアミノ酸配列情報を
検証することは、バクテリアの迅速同定だけでなく、プロテオーム解析などの解析精度を
高める上でも非常に重要であろう。
以上のように、アミノ酸配列情報を検証し、誤りを修正した結果、株レベルで変異して
いるリボソームサブユニットタンパク質の種類を明らかにすることができた。最終的に St.
thermophilus では、ピークが帰属された 42 種類のリボソームサブユニットタンパク質の
うち、12 種類でアミノ酸配列に変異が生じていることが確認された。一方、Lb. bulgaricus
では、株間でアミノ酸配列に変異が生じていることが確認されたリボソームサブユニット
-110-
タンパク質はわずか 2 種類（L24 および S18）だけであった。そこで、各菌種間の遺伝学
的類縁性を調べるために、バクテリアの分子系統解析でよく用いられる 16S rRNA 遺伝子、
DNA ジャイレースサブユニット B 遺伝子(gyrB)、およびシャペロンタンパク質 DnaJ 遺伝
子(dnaJ)の DNA 塩基配列を比較した。これらのうち、gyrB および dnaJ の各遺伝子の塩
基配列は、Streptococcus 属バクテリアについて、種および株レベルでの識別に用いること
ができることが報告されている[24]。しかし、St. thermophilus と Lb. bulgaricus のいず
れも、菌株間での DNA 塩基配列の違いは、16S rRNA 遺伝子では見出されず、gyrB（約
1950-bp）および dnaJ（約 1130-bp）でわずか 4～6-bp だけであった。この結果は、本研
究に用いた St. thermophilus と Lb. bulgaricus それぞれの 2 株間の遺伝学的類縁性が、非
常に高いことを示している。各リボソームサブユニットタンパク質のアミノ酸配列上での
変異もわずかであり、St. thermophilus の S14 では 2 箇所、それ以外ではわずか 1 箇所だ
けであった。このようなアミノ酸配列の変異は、遺伝子の DNA 塩基配列におけるわずか 1
箇所ないし 2 箇所の変異により引き起こされる。しかし、このようなわずかな変異であっ
ても、多くの場合、マススペクトル上では 10 ～ 72 Da ものピークシフト（但し、 St.
thermophilus の L5 と Lb. bulgaricus の L24 は、それぞれ 1 Da の違い）として反映され、
これは現在の MALDI-MS の測定技術では十分明確な違いとして検出することができる。
Lb. bulgaricus の場合では、明確なピークシフトを与えるリボソームサブユニットタンパク
質は S18 の 1 種類しか存在しないが、
それでも MALDI-MS で S18 のピークに注目すれば、
NBRC 13953T 株と ATCC BAA-365 株の違いを明確に識別することが可能である。この研
究成果を発展させて行った、MALDI-MS によるバクテリアの株レベルでの系統分類法の開
発については、第 4 章で述べる。
-111-
文献
[1]
Sun, L.; Teramoto, K.; Sato, H.; Torimura, M.; Tao, H.; Shintani, T.: Rapid Commun.
Mass Spectrom. 2006, 20, 3789.
[2]
Arnold, R. J.; Reilly, J. P.: Anal. Biochem. 1999, 269, 105.
[3]
Strader, M. B.; VerBerkmoes, N. C.; Tabb, D. L.; Connelly, H. M.; Barton, J. W.;
Bruce, B. D.; Pelletier, D. A.; Davison, B. H.; Hettich, R. L.; Larimer, F. W.; Hurst, G.
B.: J. Proteome Res. 2004, 3, 965.
[4]
Suh, M. J.; Hamburg, D. M.; Gregory, S. T.; Dahlberg, A. E.; Limbach, P. A.:
Proteomics 2005, 5, 4818.
[5]
Running, W. E.; Ravipaty, S.; Karty, J. A.; Reilly, J. P.: J. Proteome Res. 2007, 6, 337.
[6]
Bolotin, A.; Quinquis, B.; Renault, P.; Sorokin, A.; Ehrlich, S. D.; Kulakauskas, S.;
Lapidus, A.; Goltsman, E.; Mazur, M.; Pusch, G. D.; Fonstein, M.; Overbeek, R.;
Kyprides, N.; Purnelle, B.; Prozzi, D.; Ngui, K.; Masuy, D.; Hancy, F.; Burteau, S.;
Boutry, M.; Delcour, J.; Goffeau, A.; Hols, P.: Nat. Biotechnol. 2004, 22, 1554.
[7]
Makarova, K.; Slesarev, A.; Wolf, Y.; Sorokin, A.; Mirkin, B.; Koonin, E.; Pavlov, A.;
Pavlova, N.; Karamychev, V.; Polouchine, N.; Shakhova, V.; Grigoriev, I.; Lou, Y.;
Rohksar, D.; Lucas, S.; Huang, K.; Goodstein, D. M.; Hawkins, T.; Plengvidhya, V.;
Welker, D.; Hughes, J.; Goh, Y.; Benson, A.; Baldwin, K.; Lee, J. H.; Diaz-Muniz, I.;
Dosti, B.; Smeianov, V.; Wechter, W.; Barabote, R.; Lorca, G.; Altermann, E.;
Barrangou, R.; Ganesan, B.; Xie, Y.; Rawsthorne, H.; Tamir, D.; Parker, C.; Breidt,
F.; Broadbent, J.; Hutkins, R.; O'Sullivan, D.; Steele, J.; Unlu, G.; Saier, M.;
Klaenhammer, T.; Richardson, P.; Kozyavkin, S.; Weimer, B.; Mills, D.: Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 2006, 103, 15611.
[8]
Yamamoto, T.; Izumi, S.; Gekko, K.: FEBS Lett. 2006, 580, 3638.
[9]
Rohl, R.; Nierhaus, K. H.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, 79, 729.
[10]
Mizushima, S.; Nomura, M.: Nature 1970, 226, 1214.
[11]
Herfurth, E.; Briesemeister, U.; Wittmannliebold, B.: FEBS Lett. 1994, 351, 114.
[12]
Tsiboli, P.; Triantafillidou, D.; Franceschi, F.; Choli-Papadopoulou, T.: Eur. J.
Biochem. 1998, 256, 136.
-112-
[13]
Hard, T.; Rak, A.; Allard, P.; Kloo, L.; Garber, M.: J. Mol. Biol. 2000, 296, 169.
[14]
Krishna, S. S.; Majumdar, I.; Grishin, N. V.: Nucleic Acids Res. 2003, 31, 532.
[15]
Panina, E. M.; Mironov, A. A.; Gelfand, M. S.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100,
9912.
[16]
田中耕一: ぶんせき 1996, 253.
[17]
Fukuyama, Y.; Iwamoto, S.; Tanaka, K.: J. Mass Spectrom. 2006, 41, 191.
[18]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi.
[19]
http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html.
[20]
Shine, J.; Dalgarno, L.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1974, 71, 1342.
[21]
佐藤浩昭; 寺本華奈江; 孫麗偉; 鳥村政基; 田尾博明: 第 67 回分析化学討論会講演要旨
集 2006, 78.
[22]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide.
[23]
http://us.expasy.org/sprot/.
[24]
Itoh, Y.; Kawamura, Y.; Kasai, H.; Shah, M. M.; Nhung, P. H.; Yamada, M.; Sun, X.
S.; Koyana, T.; Hayashi, M.; Ohkusu, K.; Ezaki, T.: Syst. Appl. Microbiol. 2006, 29,
368.
-113-
3-3 乳酸菌ゲノム解読株のリボソームタンパク質の比較解析
3-3-1 緒言
リボソームサブユニットタンパク質をバイオマーカーとして、MALDI-MS によりバクテ
リアを迅速に同定する手法は、翻訳アミノ酸配列から計算される各リボソームサブユニッ
トタンパク質の質量（計算質量）を指標とするため、MALDI-MS で観測される発現タンパ
ク質の質量（観測質量）が異なっていると、同定結果の信頼性が低下する。そのためには、
ゲノム解読された菌株を試料に用いて、Swiss-Prot/TrEMBL などの公共タンパク質データ
ベースに登録されている翻訳アミノ酸配列を検証し、発現タンパク質の観測質量を確認す
ることが重要であることを、前節 3-1 および 3-2 で述べてきた。
ゲノム解読株であっても計算質量と観測質量が異なる要因として、第 1 章で述べたよう
に、翻訳後修飾および翻訳アミノ酸配列情報の誤りが考えられる。前節では、同種で複数
のゲノム解読株について、翻訳アミノ酸配列情報を比較し、マススペクトル上のピークを
確認すれば、翻訳アミノ酸配列情報の誤りをある程度修正できることを述べた。しかし、
ほとんどのバクテリアでは、1 種につき 1 株しかゲノム解読されないため、実際には 3-2 節
で述べたように同種のバクテリアの翻訳アミノ酸配列情報を比較して、タンパク質データ
ベース上の情報修正を行うのは困難である。しかし、リボソームタンパク質の構造は保存
性が高いため、ゲノム解読された類縁のバクテリア間でリボソームサブユニットタンパク
質の詳細なキャラクタリゼーションの結果を比較すれば、MALDI-MS で観測されやすいリ
ボソームサブユニットタンパク質の種類、翻訳後修飾、および翻訳アミノ酸配列情報の検
証を行うことができると考えられる。その上で、類縁菌株で共通して観測されたリボソー
ムサブユニットタンパク質は、実用的なバイオマーカータンパク質として利用することが
できるであろう。
そこで本研究では、各種乳酸菌の迅速同定に利用できるバイオマーカーを選択するため
に、 8 種の乳酸菌（前節で既に解析した 3 種を含む）のゲノム解読株の菌体破砕液を
-114-
MALDI-MS で測定し、観測されるリボソームタンパク質のキャラクタリゼーションを行っ
た。各乳酸菌に対して帰属されたリボソームサブユニットタンパク質を比較することによ
って、共通して翻訳後修飾が起こりやすいリボソームサブユニットタンパク質や検出され
にくいリボソームサブユニットタンパク質を調べ、さらにタンパク質データベースに登録
されている翻訳アミノ酸配列の誤りを修正することによって、信頼性の高い分析結果が得
られるバイオマーカーを選択する指針の提案を試みた。
3-3-2 実験
Table 3-3-1 に、本研究で用いた 8 種類の乳酸菌の名称と略称および培養温度を示す。こ
れらのうち、Lb. bulgaricus および St. thermophilus の解析結果は、前節 3-2 と同じデー
タを用いた。一方、3-1 節で解析を行った Lb. plantarum は、本研究では再測定を行った。
各試料のうち、株の名前が NCIMB のものはテクノスルガ・ラボから、NBRC のものは製
品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門(NBRC)から、ATCC のものは、American Type
Culture Collection からそれぞれ入手した。
Table 3-3-1. Names and cultivation temperatures of lactic acid bacteria used in this study.
Bacteria names
Strains
Abbreviations
Lactobacillus brevis
NCIMB 947
Cultivation
temperature (ºC)
Lb. brevis
30
NBRC 100676
Lb. bulgaricus
37
Lactobacillus gasseri
NCIMB 11718
Lb. gasseri
37
Lactobacillus plantarum
NCIMB 8826
Lb. plantarum
30
Lactococcus lactis subsp. cremoris
NCIMB 702004
Lc. cremoris
30
Leuconostoc mesenteroides subsp.
NCIMB 8023
Le. mesenteroides
25
Pediococcus pentosaceus
ATCC 25745
Pe. pentosaceus
37
Streptococcus thermophilus
ATCC BAA-491
St. thermophilus
37
Lactobacillus
delbrueckii
subsp.
T
bulgaricus
mesenteroides
これらの菌株の培養および菌体破砕は、第 2 章で述べた方法に従って行った。まず、乳
酸菌の培養に適した MRS 液体培地を用いて、Table 3-3-1 に示した各至適温度で 18 時間培
-115-
養した。培養した各菌株は、TMA-I 緩衝液を用いて遠心洗浄した後、ジルコニアシリカビ
ーズを用いて破砕し、ビーズと細胞断片を遠心分離した上澄みを菌体破砕液とした。菌体
破砕液の MALDI-MS 測定は、第 2 章で述べた方法により行った。
3-3-3 結果と考察
(1) 各乳酸菌の菌体破砕液の MALDI マススペクトルの比較
Fig. 3-3-1 に、各種乳酸菌の菌体破砕液に対して観測された MALDI マススペクトルにつ
いて、一例として m/z 12000-16000 の範囲を拡大して示す。また、翻訳アミノ酸配列から
計算された質量をもとにして帰属された各リボソームサブユニットタンパク質の名称を示
す。Table 3-3-2 に、各乳酸菌に対して帰属されたリボソームサブユニットタンパク質の種
類と大まかな相対ピーク強度をまとめて示す。なお、表中において枠で囲ったリボソーム
サブユニットタンパク質は、Swiss-Prot/TrEMBL タンパク質データベースに登録されてい
る翻訳アミノ酸配列を修正した結果、帰属されたものであり、詳細については後述する。
いずれの乳酸菌に対しても、53 種類のうちおよそ 40 種類のリボソームサブユニットタンパ
ク質が帰属された。また、帰属された全てのリボソームサブユニットタンパク質に対して、
N 末端則（第 2 章参照）が適用できることを確認した。
8 種類の乳酸菌に対して帰属されたリボソームサブユニットタンパク質の種類は、ある程
度共通しており、23 種類のリボソームサブユニットタンパク質（L2、L15、L17、L23、
L24、L28、L30～L32、L36、S5、S7～S13、S15～S19）は、翻訳アミノ酸配列情報のみ
を利用して全ての乳酸菌に対して帰属することができた。一方、5 種類のリボソームサブユ
ニットタンパク質（L1、L10、L11、L27、および S1）は、いずれの乳酸菌でも帰属されな
かった。その他のリボソームサブユニットタンパク質は、乳酸菌の種類によっては、帰属
されないものがあった。リボソームタンパク質を指標とした信頼性の高い乳酸菌の迅速同
定法を確立するには、確実に観測されるバイオマーカーを選択する必要がある。特定のリ
ボソームサブユニットタンパク質が帰属されない理由として、次の 3 点について、以下の
検証を行った。
-116-
L15
S8
S1
2
L17
S9
S11
L19
L18
L20
L14
L22
L7/L12
S13
% int.
(a) 100
0
L15
L17
S8
S12
L15
S12
S9
L17
S8
S11
S9
L7/L12
L22
S11
(c) 100
L20
S13
L18
0
L20
L18
S13
L14
L22
(b) 100
L15
S12
S9
S8
L17
L18
L14
L22
L7/L12
L20 S13
L19
S11
0
(d) 100
S12
L15
S9
L20
L17
L14
L19
S11
L22
L18
S13
0
(e) 100
L20
L15
S12
S16
S8
S9
L17
S11
S13
L19
L14
L22
L18
L7/L12
0
(f) 100
L15
S12
S8
L17
S9
S11
S13
L19
L14
L20
L18
L22
L7/L12
0
(g) 100
L15
S8
L17
S12
S9
L20
L14
L19 S11
S13
L18
L22
0
(h) 100
0
12000
13000
14000
m/z
15000
16000
Fig. 3-3-1. MALDI mass spectra of cell lysates of lactic acid bacteria. (a) Lb. brevis, (b)
Lb. bulgaricus, (c) Lb. gasseri, (d) Lb. plantarum, (e) Lc. cremoris, (f) Le.
mesenteroides , (g) Pe. pentosaceus, and (h) St. thermophilus.
-117-
Table 3-3-2. Identified ribosomal subunit proteins for genome-sequenced lactic acid bacteria.
Lb.
brevis
Large subunit proteins
L1
L2
+a)
L3
+
L4
L5
L6
+
L7/L12
+++
L9
+
L10
L11
L13
++
L14
+
L15
++
L16
L17
++
L18
++
L19
++
L20
++
L21
+
L22
++
L23
++
L24
+++
L27
L28
++++
L29
++++
L30
++++
L31
++
L32
++++
c)
L33
+/+
L34
++
L35
++
L36
++++
Small subunit proteins
S1
S2
S3
+
S4
S5
+
S6
+
S7
+
S8
+
S9
++
S10
+++
S11
+
S12
++
S13
++
S14d)
++++
S15
+++
S16
+++
S17
++
S18
++++
S19
+++
S20
+++
S21
++
Total
43
Lb.
bulgaricus
Lb.
gasseri
Lb.
plantarum
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+b)
+
++
+
++
++
+
++
++
++
++
++
+
+++
+
++
++
++
++++
++++
++++
+++
+++
++
+
++
+
+
+
++
++
++
+++
++
++
++
+++
+++
++++
++++
++++
++++
++++
+++
39
Lc.
cremoris
Le.
mesenteroides
Pe.
pentosaceus
St.
thermophilus
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+++
+
++
++++
+
++
+
++
+
-
++
++
++
+++
++
++
++
++
++
++
+
+
++
++
++
++
+++
++
+++
++
+
++
++
+++
++
+
+++
+++
+++
+++
++
+
++
+++
+
+++
+++
+++
++
+
+++
++++
++++
+++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
+++
++++
+
++
+++
++
+++
++++
++++
++++
++
++
+
+++
+++
++++
++++
++++
++++
++++
+
+++
++
++++
+++
++++
++++
++++
++
++
++
+++
++
+++
++++
++++
+++
+++
+
++
+
++++
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+++
++
++
++
++++
++++
++
+++
++
++++
++++
++++
45
+
++
+
+
++
++
++
+++
++++
+++
+++
++++
++++
++++
++++
41
+
+
+
++
+
+
++
++
++
+
++
++++
++
++
+++
+++
++++
++
46
+
+
+++
+++
++
+++
++
++++
++++
++++
++
++++
++++
++++
+++
42
+
+
+
+
++
+
+
+
+
++
+
+++
+++
+++
++
++
++++
+++
++++
+++
++++
+++
+++
42
++
+
+
++
+
+
++
+
+
+
+
+
+
++
++
++
++
++
+++
+++
+++
++
+++
+++
++
+++
42
a) Relative peak intensities to the strongest peak: +; <5%, ++; 5-25%, +++; 25-50%, and ++++; 50-100%. - means overlapped peaks.
b) Framed cell are identified subunit proteins whose amino acid sequence are corrected in this study.
c) L33 has three paralogous. See Table 3-3-6.
d) S14 has two paralogous. See Table 3-3-7.
①
イオン化効率ないし検出器の応答感度が低いために、観測されない。
②
N-末端メチオニン切断以外の翻訳後修飾が起こっているため、計算質量と観測質量
が一致しない。
③
タンパク質データベースに登録されている翻訳アミノ酸配列の情報が誤っているた
め、計算質量と観測質量が一致しない。
-118-
(2)
高質量成分のイオンサプレッションおよびマスディスクリミネーション効果による影
響
まず、①で述べたイオン化効率あるいは検出器の応答感度と、リボソームタンパク質の
ピーク強度に及ぼす影響について検討した。リボソームは、3 種類の rRNA と共に、等モ
ルの各リボソームサブユニットタンパク質が集合して形成されている（但し、L7/L12 は 4
倍量および S20 は 2 倍量発現する）
。そのため、MALDI 過程での脱離イオン化効率と検出
器の応答が等しいならば、各リボソームサブユニットタンパク質のピークは、等しい強度
で観測されるはずである。しかし実際には、Table 3-3-2 に示すように、観測されるピーク
強度はリボソームサブユニットタンパク質の種類によって大きく異なっている。そこで、
各リボソームサブユニットタンパク質のピーク強度に及ぼす要因を検討した。
Fig. 3-3-2 に、一例として Lb. brevis に対して観測された各リボソームサブユニットタン
パク質の分子量および等電点と相対ピーク強度の関係を示す。一般に、塩基性アミノ酸残
基を多く含む、等電点が高い分子ほど、[M + H]+イオンが形成されやすくなり、脱離イオ
ン化効率が向上する。しかし、実際には Fig. 3-3-2a に示すように、等電点と相対ピーク強
(b)
100
100
90
90
80
80
Relative intensity (%)
Relative intensity (%)
(a)
70
60
50
40
30
70
60
50
40
30
20
20
10
10
0
0
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14
pI
0
5
10
15
20
25 30
molecular weight (x1000)
35
Fig. 3-3-2. Relationships between relative peak intensity and pI (a) and molecular
weight (b) of Lb. brevis.
-119-
度の間には明確な相関は認められなかった。一方、相対ピーク強度と分子量の関係を見る
と、Fig. 3-3-2b 中の点線で示すように、分子量が増加するにつれて、一定の割合でピーク
強度が減少する傾向が含まれていることが分かった。このような傾向は、全ての乳酸菌に
対して観測された。これは、分子量分布が広い混合物を測定した際に高質量側の成分のイ
オン化が抑制されるイオンサプレッション効果と、測定装置の検出器の応答感度が m/z 値
に対して依存性があることによって生じるマスディスクリミネーション効果の影響を大き
く受けるためであると考えられる。それぞれの寄与の程度は不明であるが、少なくとも後
者の影響は確実に起こっていると考えられる。本研究で用いた AXIMA-CFR plus の検出器
には二次電子増倍管が用いられており、その他に飛行時間型質量分析計の検出器としてマ
イクロチャンネルプレート検出器が汎用されているが、いずれも高 m/z 値側におけるマス
ディスクリミネーションを回避することができない[1, 2]。
本実験条件下では、分子量が約 2 万以上である L1～L6 および S1～S4 の各リボソームサ
ブユニットタンパク質は明確なピークとして検出できないものが多く、観測されたリボソ
ームサブユニットタンパク質でも、大半の相対ピーク強度が 1%を下回った。そこで一つの
指針として、分子量が約 2 万以上のリボソームサブユニットタンパク質（L1～L6 および
S1～S4）は、乳酸菌を同定するためのバイオマーカーから除外することが好ましいと考え
られる。
(3) N 末端メチオニン切断以外の翻訳後修飾
②で述べた N 末端メチオニン切断以外の翻訳後修飾については、一部のリボソームサブ
ユニットタンパク質に対しては、メチル化やアセチル化などが起こり得ることが知られて
いる。Escherichia coli (E. coli)のリボソームタンパク質の翻訳後修飾は詳細に解析されて
おり、10 種のリボソームサブユニットタンパク質（L3、L7、L11、L12、L16、L33、S5、
S11、S12、および S18）で N 末端メチオニン残基の切断以外の翻訳後修飾が起こることが、
MALDI-MS による発現タンパク質の分析でも確認されている[3]。また、グラム陰性菌であ
る Rhodopseudomonas palustris [4]、Thermus thermophilus [5]、および Caulobacter
-120-
crescentus [6]についても、質量分析法を用いたリボソームタンパク質のキャラクタリゼー
ションが行われ、E. coli とほぼ同様の翻訳後修飾が起こることが報告されている。一方、
乳酸菌を含むグラム陽性菌については、リボソームタンパク質の翻訳後修飾を詳細に解析
した研究例は、著者の知る限り報告されていない。しかし、リボソームタンパク質は保存
性が高いため、近縁のバクテリアであれば翻訳後修飾の有無や種類は、ある程度共通して
いるのではないかと考えられる。すなわち、Table 3-3-2 において、大半の乳酸菌でピーク
が観測されなかったリボソームサブユニットタンパク質では、何らかの翻訳後修飾が起こ
っている可能性が考えられる。もし各種乳酸菌に共通する翻訳後修飾が起こっていること
が明らかになれば、その修飾を考慮したうえでそのリボソームサブユニットタンパク質を
バイオマーカーとして利用することができる。一方、もし共通性が見出せなければそれら
はバイオマーカーから除外すべきであろう。以下に、分子量約 2 万以下のリボソームサブ
ユニットタンパク質について、翻訳後修飾の可能性について検討した。
(3)-1 L7/L12
L7 と L12 は同一の遺伝子（rplL）から発現するリボソームサブユニットタンパク質であ
り、E. coli では L7 はアセチル化が起こり、L12 はメチル化が起こる[7]。Lb. bulgaricus
については、アミノ酸配列に基づいて計算された m/z 値よりも約+14 Da にピークが観測さ
れ、これはメチル化された L12 のピークであると考えられた。しかしながら、Lb. bulgaricus
および St. thermophilus 以外の 6 種の乳酸菌に対して、アミノ酸配列から計算された m/z
値に明確なピークが観測され、+14 Da（メチル化）および+42 Da（アセチル化）にはピー
クは観測されなかった。すなわち、これらについては翻訳後修飾が起こっていないと考え
られる。なお、St. thermophilus ついては、いずれの m/z 値にもピークが観測されず、翻
訳後修飾の有無が判断できなかった。
(3)-2 L10 および L27
L10 および L27 は、いずれも全ての乳酸菌試料でピークが観測されなかった。これまで
-121-
に L10 および L27 の翻訳後修飾は、著者らの知る限り報告されておらず、計算質量から共
通して起こるピークシフトは確認できなかった。そのため、これらのリボソームサブユニ
ットタンパク質が全く観測されないのは、明らかにされていない翻訳後修飾が起こってい
る可能性や、イオン化効率が極端に低いためである可能性が考えられる。詳細な理由は明
らかではないが、これらをバイオマーカーとして用いることはできない。
(3)-3 L11
L11 は、L11 メチル化酵素の働きによって複数のリジン残基がトリメチル化されるため、
3 の倍数のメチル基が導入されることが知られている[8]。例えば、E. coli の L11 では 9 残
基のメチル基が導入されることが確認されている[3]。本研究で用いた全ての乳酸菌で、翻
訳アミノ酸配列から計算された m/z 値にはピークが観測されず、いずれも L11 のメチル化
が起こったことが示唆された。そこで、各乳酸菌試料の MALDI マススペクトルについて、
L11 の計算質量よりも高質量側を調べた。Fig. 3-3-3 に、Lb. brevis (a)、Lb. bulgaricus (b)、
Δ 126 Da (+ 9Me)
Δ 84 Da (+ 6Me)
% int. Δ 42 Da (+3Me)
100
14795.2
14669.2
(a)
0
100
(c)
0
100
S12
14658.1
(b)
14752.2
14630.0
14671.7
0
100
(e)
0
100
14758.8
16091.9
14271.1
16049.3
(d)
14714.6
14797.1
0
0
20
40
60
80
100 120
Δ m/z
140
160
180
200
Fig. 3-3-3. MALDI mass spectra around methylated L11. (a) Lb. brevis, (b) Lb.
bulgaricus, (c) Lb. plantarum, (d) Le. mesenteroides, and (e) St. thermophilus. Horizontal
scale shows Δ m/z from the calculated m/z values of L11 indicated by arrows.
-122-
Lb. plantarum (c)、Le. mesenteroides (d)、および St. thermophilus (e)の L11 周辺の
MALDI マススペクトルを示す。Lb. brevis (a)、Lb. bulgaricus (b)、Lb. plantarum (c)、
および St. thermophilus (e)については、9 残基のメチル基の質量に相当する+126 Da のピ
ークシフトが観測された。さらに Lb. plantarum (c)については、3 残基および 6 残基のメ
チル化に、Lb. brevis (a)については 6 残基のメチル化に相当する位置にも明確なピークが
観測された。また、Le. mesenteroides (d)については、3 残基のメチル化に相当する位置に
ピークが観測された。このように、L11 にはメチル化が起こることが確認されたが、導入さ
れるメチル基の数が菌種によって異なるうえ、同一菌株でも導入されるメチル基の数に分
布をもつものがあった。なぜこのような現象が起こるのかは明らかにされていないため、
現時点では L11 はバイオマーカーには適していないと判断した。
(3)-4 L16
E. coli の L16 の翻訳後修飾は 2 箇所のメチル化（N 末端メチオニン残基と 81 番目のア
ルギニン残基）と水酸化（81 番目のアルギニン残基）によるものであり、計算質量から+44
Da のピークシフトが起こることが知られている[3]。Fig. 3-3-4 に、各乳酸菌試料について、
L16 の計算質量から+100 Da の範囲の MALDI マススペクトルを比較して示す。いずれの
2 箇所のメチル化と水酸化を示唆する+44 Da のピークは観測されなかった〔Lb.
乳酸菌でも、
bulgaricus (b) の m/z 16240.3 のピークは、約 +47 Da である〕。しかしながら、 Le.
mesenteroides (f)については約+14 Da の位置に、Lb. brevis (a)、Lc. cremoris (e)、Pe.
pentosaceus (g)、および St. thermophilus (h)については約+28 Da の位置にピークが観測
され、それぞれ 1 箇所および 2 箇所のメチル化が起こっていることが示唆された。また、
Lb. bulgaricus (b)と Lb. gasseri (c)は、翻訳後修飾が起こっていないことが示唆された。こ
のように、L16 は、乳酸菌の種類によって導入されるメチル基の数が異なることが示唆さ
れた。
-123-
+ 44 Da (+2Me + O)
+ 28 Da (+2Me)
+ 14 Da (+Me)
% int.
100
15958.7
15931.6
(a)
16192.9
(b)
16004.9
0
100
0
100
(d)
0
100
16033.8
(c)
16240.3
16075.8
16169.3
0
100
(f)
0
100
(g)
0
100
(h)
0
100
15371.1
15344.0
(e)
16103.5
15327.0
15341.9
16032.8
16061.4
15423.2
15450.2
0
0
10
20
30
40
50
60
Δ m/z
70
80
90
100
Fig. 3-3-4. MALDI mass spectra around methylated L16. (a) Lb. brevis, (b) Lb. bulgaricus,
(c) Lb. gasseri, (d) Lb. plantarum, (e) Lc. cremoris, (f) Le. mesenteroides, (g) Pe.
pentosaceus, and (h) St. thermophilus.
(3)-5 L33、S5、S11、S12、および S18
これらのリボソームサブユニットタンパク質は、E. coli などのグラム陰性菌では翻訳後
修飾が起こることが報告されている（L33 および S11: メチル化、S5 および S18: アセチル
化、S12: β-メチルチオール化）。しかしながら、本研究で用いた乳酸菌試料では、いずれも
計算質量の位置にピークが観測されており、これらは翻訳後修飾を考慮せずにバイオマー
カーとして利用することができる。
-124-
(4) 翻訳アミノ酸配列情報の誤り
③で述べたタンパク質データベースに登録されている翻訳アミノ酸配列の情報の誤りに
関する問題について、以下の検討を行った。
(4)-1 N 末端アミノ酸配列の誤り
前節 3-2 で、St. thermophilus および Lb. bulgaricus について、それぞれ 2 株のゲノム
解読株のリボソームタンパク質の発現質量を比較することによって、Swiss-Prot/TrEMBL
などのタンパク質データベースに登録されている翻訳アミノ酸配列情報に、いくつもの誤
りがあることを指摘した[9]。これらは、原核生物では、開始メチオニン残基をコードする
コドンに対応する DNA 塩基配列は、ATG だけではなく、GTG（バリンをコード）と TTG
（ロイシンをコード）を含む 3 種類存在するために、開始コドンの位置を誤って判断して
いることが原因であった。このような誤りは相同性解析を行うことによって推測すること
ができ、修正したアミノ酸配列は、計算質量の修正値を観測ピークの m/z 値と比較するこ
とによって容易に検証できる[9]。そこで、本研究で解析対象とした 8 種の乳酸菌の全ての
リボソームサブユニットタンパク質について、アミノ酸配列の検証を行った。その結果、9
種類のリボソームサブユニットタンパク質の登録情報に、N 末端側のアミノ酸配列に誤り
が見出された。これらのリボソームサブユニットタンパク質名、元のアミノ酸配列、修正
したアミノ酸配列、正しい N 末端メチオニン残基の位置、計算質量、および
Swiss-Prot/TrEMBL のアクセッション番号を、Table 3-3-3 にまとめて示す。本研究で見
出された N 末端アミノ酸配列の誤りのうち、8 種類は Lb. gasseri のものであった。これは
Lb. gasseri ゲノムの遺伝子領域の同定において、翻訳開始領域を実際よりも上流側に誤り
やすいアルゴリズムが用いられたことを示唆している。
-125-
Table 3-3-3. Correction of N-terminal amino acid sequences.
Ribosomal
protein name
Lb. gasseri
L9
Actual
N-terminal
MKFMKVIFIK DMKGKGKRGE VKNVPDGYAQMKVIFIK DMKGKGKRGE VKNVPDGYAQMSNRRKTEEF KVRTTPLAKT SDIKRKWYVIMRTTPLAKT SDIKRKWYVIMILNCFKRGM RVYCKSCICG NLTSATARLW
GKKRINVNST SYGESKYFFG GVQMYAVIKT-
M-4
16904.6
Q047E3
V-12
16369.9
Q045Z4
M-54
11452.3
Q044I6
M-5
7738.0
Q046B7
M-5
(Met loss)a
5738.7
Q041X4
M-9
(Met loss)
5336.4
Q040F0
M4
(Met loss)
9174.6
Q042T1
M12
(Met loss)
6937.9
Q042X8
13041.8
MITVISKPDK NKTRQRRHAR VRGKISGTAE- V-4
MISKPDK NKTRQRRHAR VRGKISGTAEa
Corrected N-terminal methionine residue are further removed by post-translational modification.
b
Mass of [M + H]+ ion.
c
Swiss-Prot/TrEMBL protein database.
Q88XX0
Original
Corrected
L13
Original
Corrected
L21
Original
Corrected
L29
Original
Corrected
L33
Original
Corrected
L34
Original
Corrected
S20
Original
Corrected
S21
Original
Corrected
Lb. plantarum
L18
MANLMKAKDI RALTTDQMLE
MKAKDI RALTTDQMLE
MVEKMAEHII LECTECGDRS
AEHII LECTECGDRS
MKNGGATLMS TKRTYQPKKR
S TKRTYQPKKR
MILMPQIKSA IKRVKTTATA
PQIKSAIKRVKTTATA
MCAKKWKEGS HMAKTIVHEN
AKTIVHEN
MYAVIKTKEKQYKEELFKEKQYKEELFYLSEKNKRKHYLSEKNKRKHHRSRVHGFMKHRSRVHGFMKNKRNAAELSKNKRNAAELSKESIDDALRRFESIDDALRRF-
Original
Corrected
Corrected
mass b
Accession
number c
Amino acid sequence (N-terminal side)
(4)-2 C 末端アミノ酸配列の誤り
L20 は、Lc. cremoris でのみ帰属されなかったことから、この翻訳アミノ酸配列情報が誤
っている可能性が考えられる。Lc. cremoris は、本研究で用いた NCIMB 702004 株（= SK11
株）以外に、MG1363 株の全ゲノムが解読されている。両者の L20 の翻訳アミノ酸配列を
比較した結果、NCIMB 702004 株の L20 の C 末端側は 18 アミノ酸残基も短く、アミノ酸
配列情報が欠落している可能性が考えられた。Table 3-3-4 に、L20 について、NCIMB
702004 株および MG1363 株の C 末端側のアミノ酸配列と、それをコードする DNA の塩
基配列を、比較して示す。両者の L20 遺伝子（rplT）の塩基配列を比較したところ、NCIMB
702004 株では 303 番目にシトシン（C）が挿入されたことによって、次のコドンが停止コ
ドンと見なされたために C 末端側のアミノ酸残基の情報が欠落したことが示唆された。303
番目のシトシン（C）以外の塩基配列は 2 株間で同一であるため、実際には NCIMB 702004
株の L20 のアミノ酸配列は MG1363 株と同一であると考えられる。N 末端メチオニン残基
の切断を考慮した L20 の[M + H]+イオンの計算質量は 13563.1 である。そこで、Lc. lactis
-126-
subsp. cremoris の MALDI マススペクトルを検証したところ、対応する位置に明確なピー
クが観測され、18 アミノ酸残基を追加した C 末端側のアミノ酸配列の修正が正しいことが
検証された。
Table 3-3-4. Comparison of DNA sequences around the C-terminal side of L20 gene of
two genome-sequenced strains of Lc. cremoris.
Strain name
NCIMB 702004
(=SK11)
DNA sequences and translated amino acid sequences
(C-terminal side)
292 ATC GCA ATC GCC TGA TGC TGC TGC ATT TAC
I
A
I
A stop
312
MG1363
ID of Entrez
Gene
4433760
Accession number at
Swiss-Prot/TrEMBL
Q02X10
4799086
A2RMR1
TGC ACT TGC TGA AGA AGC AAA AAA AGC TTT
342 GGC TAA ATA A
292 ATC GCA ATC GCT GAT GCT GCT GCA TTT ACT
I
A
I
A
D
A
A
A
F
T
312
GCA CTT GCT GAA GAA GCA AAA AAA GCT TTG
A
L
A
E
E
A
K
K
A
L
342
GCT AAA TAA
A
K Stop
(4)-3 内部アミノ酸配列の誤り
L22 は、Lb. plantarum でのみ帰属されなかったことから、この翻訳アミノ酸配列情報
が誤っている可能性が考えられる。そこで L22 について翻訳アミノ酸配列の相同性解析を
行った。Table 3-3-5 に、Lb. plantarum の L22 の部分アミノ酸配列（71-110 番目）を、他
の乳酸菌のものと比較して示す。この配列の中で、92 番目のアミノ酸残基が Lb. plantarum
ではアラニン(A)として登録されているが、他の乳酸菌ではプロリン(P)であることが分かっ
た。L22 の 88 番目から 107 番目付近のアミノ酸配列（Table 3-3-5 の Lb. plantarum のア
ミノ酸配列で下線で示した部分）は保存性が特に高い領域であり、リボソームで生合成さ
れるポリペプチド鎖が通過する｢ペプチドトンネル｣と呼ばれる特殊な空間の壁を形成する
重要な部位に相当する。Fig. 3-3-5 に、L22 の立体構造を示す。この立体構造の中で、92
番目のプロリン残基は、ポリペプチド鎖の向きが変わる「ヘアピンターン」と呼ばれる特
に重要な部位に位置しており、これがアラニン残基に置換されることは極めて考えにくい。
-127-
Table 3-3-5. Comparison of amino partial acid sequences of ribosomal protein L22.
Bacteria name
Partial amino acid sequence
71
80
90
Accession number at
Swiss-Prot/TrEMBL
100
110
Lb.plantarum
REDLVVSEAF VNEGPTLKRF RARAKGSASP INKRTSHITI
Q88XY1
Lb. brevis
RQDLVVSEAY VNEGPTLKRF RPRAKGSASP INKRTSHITV
Q03PW2
Lb. bulgaricus
SANLYVSEAY VNEGATLKRF RPRAKGSASP IMKRTSHVVV
Q1GBL3
Lc. cremoris
KANLVVSETF INEGPTMKRF RPRAKGSASP INKRTAHITV
Q02W29
Le. mesenteroides
REDLIVKEAF ANEGPTLKRF RPRAKGSASP INKRTSHLTI
Q03ZP0
Pe. pentosaceus
REDLVISKVF VNEGPTLKRF RPRAKGSASP INKRTSHITV
Q03EC1
St. thermophilus
KANLVVSETF ANEGPTMKRF RPRAKGSASP INKRTTHVTV
Q5LXR6
そこで、福岡工業大学吉川研究室に依
頼して、Lb. plantarum NCIMB 8826
の L22 遺伝子の DNA 配列を解読したと
ころ、データベースに登録されている
274 番目の塩基が誤っており、シトシン
92nd amino
acid residue
(C)ではなく、正しくはグアニン(G)であ
ることが明らかとなった。これにより、
対応するアミノ酸残基は、他の乳酸菌の
Fig. 3-3-5. Three dimensional structure of
L22 and the position of 92nd amino acid
residue.
場合と同様にプロリン残基となる。
Fig. 3-3-6 に 、 Lb. plantarum
NCIMB 8826 の L22 周辺の MALDI
calculated mass
12325.3
L22
マススペクトルを拡大して示す。元
L7/12
12351.0
の L22 の翻訳アミノ酸配列から計算
した質量 12325.3 Da に相当する位
12300
置にはピークは観測されていないが、
92 番目のアラニン残基をプロリン
12350
12400
m/z
12450
12500
Fig. 3-3-6. Expanded MALDI mass spectrum
around L22 of Lb. plantarum.
残基に修正した場合の計算質量
(12351.3 Da) と ほぼ一致する m/z
-128-
12351.0 に観測されているピークが L22 の[M+H]+イオンに帰属できることが分かった。
この例や上述の Lc. cremoris の L20 のように、タンパク質データベースには、シーケン
シングの誤りによるアミノ酸配列の誤りが存在する。そのため、特定の乳酸菌に対して帰
属されなかったリボソームサブユニットタンパク質は、アミノ酸配列が誤って登録されて
いる可能性がある。例えば、S21 は比較的高強度で観測されるリボソームサブユニットタン
パク質であるが、Pe. pentosaceus では帰属されなかった。このようなリボソームサブユニ
ットタンパク質については、今後遺伝子の塩基配列を再解読して検証する必要がある。
(4)-4 未登録のアミノ酸配列
Lc. cremoris の L3 のアミノ酸配列は、いずれの公共タンパク質データベースにも登録さ
れていなかった。そこで、同種で別のゲノム解読株である MG1363 株の L3 遺伝子（rplC）
の DNA 塩基配列を用いて、本研究で用いた Lc. cremoris NCIMB 702004 の全ゲノム塩基
配列上で L3 遺伝子領域を検索した結果、2230272bp-2230896bp の DNA 塩基配列の相補
配列が、極めて相同性が高いことがわかった。この DNA 塩基配列を MG1363 株の L3 遺伝
子の DNA 塩基配列と比較したところ、366 番目のアデニンと 367 番目のシトシンの間にア
デニンが挿入されている以外は、完全に一致していた。もしこのアデニンの挿入が誤りで
あるとすれば、NCIMB 702004 株の L3 のアミノ酸配列は、MG1363 株のものと同一にな
る。そこで、MG1363 株の L3 のアミノ酸配列を用いて[M + H]+イオンの質量（m/z 21788.3）
を計算し、NCIMB 702004 株の MALDI マススペクトルを調べたところ、その位置にピー
クが観測されていることを確認した。このことから、NCIMB 702004 株の DNA 塩基配列
情報には、上記アデニンの挿入という誤りがあり、この菌株の L3 のアミノ酸配列は、
MG1363 株のものと同一であることが支持された。
(4)-5 複数の遺伝子をもつリボソームサブユニットタンパク質
リボソームサブユニットタンパク質の中には、あるリボソームサブユニットタンパク質
に対して複数の遺伝子が重複する、パラロガス遺伝子(paralogous gene)が存在する[8]。パ
-129-
ラロガス遺伝子には、3-2 節で述べた亜鉛フィンガーモチーフに相当する C-x-x-C 配列（C:
システイン残基、x：任意のアミノ酸残基）をコードするものがあり、この遺伝子は水平伝
播によって導入されたものであると考えられている[10]。本研究で用いた乳酸菌では、L33
および S14 がパラロガス遺伝子を有している。
L33 は、最大で 3 種類の翻訳アミノ酸配列が Swiss-Prot/TrEMBL に登録されている。
Table 3-3-6 に、各乳酸菌について、L33 の Swiss-Prot/TrEMBL のアクセッション番号（上
段）と N 末端メチオニン切断を考慮した[M + H]+イオンの計算質量（下段）を示す。ここ
で、L33-1 は C-x-x-C モチーフをもたないもの、L33-2 は C-x-x-C モチーフを 2 つもつもの、
L33-3 は C-x-x-C モチーフを 1 つだけもつものとして分類した。これらのうち、L33-2 およ
び L33-3 は、C-x-x-C モチーフをもつことから、水平伝播によって導入されたものである可
能性がある。これらのうち、発現タンパク質のピークが MALDI マススペクトル上で観測
されたものについて、表中で背景をつけて示した。実際に発現する L33 の種類は乳酸菌の
種類によって異なっていることが分かった。
Table 3-3-6. Three types of L33 with their accession numbers of Swiss-Prot/TrEMBL and calculated
mass of [M + H]+ ions.
L33-1
Lb.
brevis
-
Lb.
bulgaricus
-
Lb.
gasseri
-
Lb.
plantarum
-
Lc.
cremoris
P04A490
5998.1
Le.
mesenteroides
Q03WG8
5872.9
Pe.
pentosaceus
-
St.
thermophilus
Q03IA9
5926.0
L33-2
Q03RN9
6090.0
Q1G9D2
5730.6
Q041X4
5738.7
-
P0A488
5508.5
-
Q03G83
6040.0
Q03LJ1
5571.6
L33-3
Q03SU2
5474.5
Q1G8Z5
5367.3
Q045W4
6364.5
Q88YX4
5526.4
Q02W18
5554.6
Q03ZH9
6601.6
Q03E45
5841.3
Q03MJ7
5520.4
The upper in the cell is the accession numbers of Swiss-Prot/TrEMBL and the lower is the calculated mass of [M + H]+ ions
considering with N-terminal methionine loss. Cells with background indicate the assigned L33 observed by MALDI-MS.
S14 には、
2 種類のパラロガス遺伝子（rpsN および rpsZ）が見出されている（Table 3-3-7）。
これらのうち、rpsZ は２つの C-x-x-C 配列をもつアミノ酸配列をコードしており、対応す
るリボソームサブユニットタンパク質は S14 type Z と呼ばれている。本研究では、Lb.
gasseri および Le. mesenteroides を除く 6 種類の乳酸菌で、S14 type Z が発現することを
-130-
Table 3-3-7. Two types of S14 with their accession numbers of Swiss-Prot/TrEMBL and calculated
mass of [M + H]+ ions.
S14
S14
type Z
Lb.
brevis
Q03TE7
9960.6
Lb.
bulgaricus
-
Lb.
gasseri
Q046P2
9762.4
Lb.
plantarum
Q88V67
10009.7
Lc.
cremoris
-
Le.
mesenteroides
Q03WG9
9871.4
Pe.
pentosaceus
Q03HJ9
10378.0
St.
thermophilus
-
Q03PX0
6974.3
Q1GBK5
6987.2
-
Q88XX3
7030.3
Q02W37
7004.3
-
Q03EC9
7006.3
Q03IG4
6966.3
The upper in the cell is the accession numbers of Swiss-Prot/TrEMBL and the lower is the calculated mass of [M +
H]+ ions considering with N-terminal methionine loss. Cells with background indicate the assigned S14 observed in
the MALDI mass spectra.
確認した。Le. mesenteroides subsp. mesenteroides については、rpsN から発現した S14
の ピ ー ク を MALDI マ ス ス ペ ク ト ル 上 で 確 認 し た 。 Le. mesenteroides subsp.
mesenteroides では、rpsN からの翻訳アミノ酸配列のみがタンパク質データベースに登録
されており、rpsZ 遺伝子が存在しない可能性が考えられる。一方、Lb. gasseri は S14 のピ
ークは確認できなかった。他の Lactobacillus 属の乳酸菌では全て S14 type Z の発現が確
認されていることから、実際には Lb. gasseri でも、未同定の遺伝子 rpsZ から S14 type-Z
が発現しているのではないかと推測される。しかしながら、Lb. gasseri の全ゲノム塩基配
列上で、rpsZ 遺伝子領域を見出すことはできなかった。
(5) 乳酸菌同定のためのリボソームタンパク質データベース
以上のようにして、ゲノム解読された 8 種の乳酸菌について、菌体破砕液で観測される
リボソームタンパク質のキャラクタリゼーションを行った。その結果、分子量約 2 万以上
のリボソームサブユニットタンパク質はマスディスクリミネーション効果のためピーク強
度が著しく弱くなることが分かった。また、翻訳後修飾を受けるリボソームサブユニット
タンパク質の種類は、これまで E. coli に対して知られているものとは異なっており、しか
も乳酸菌の種類によって導入される官能基の数や修飾の有無が異なっていた。そのため、
リボソームサブユニットタンパク質の名称から一義的に翻訳後修飾を予測することはでき
ないことが分かった。したがって、分子量が約 2 万以上である L1～L6 および S1～S4、翻
訳後修飾が起こりうる L7/L12、L11、および L16、および全くピークが確認できなかった
-131-
L10 および L27 を、乳酸菌同定のためのバイオマーカーから除外すべきであると判断した。
また、L33 は、最大で 3 種類あるパラロガス遺伝子のうち、どれが実際に発現するのか特
定できないため、これについてもバイオマーカーから除外すべきであると判断した。一方、
S14 は、S14 type Z が存在する場合は、これが選択的に発現することが示唆されたため、
これはバイオマーカーとして利用できるであろう。
上記以外にも、一部の乳酸菌に対してピークが帰属できなかったリボソームサブユニッ
トタンパク質が存在した。これらは、高質量側に翻訳後修飾を示唆するピークも観測され
なかったため、明らかにされていない翻訳後修飾が起こっているか、アミノ酸配列が誤っ
ているか、脱離イオン化効率が低いためにピークが検出できなかったものであると考えら
れる。そのため、ピークが帰属できたものに限って、バイオマーカーとして利用すること
ができると判断した。
以上の指針を元に、最終的に 27 種類のリボソームサブユニットタンパク質を選択した。
Table 3-3-8 に、各乳酸菌に対する各バイオマーカーの m/z 値をまとめて示す。このデータ
ベースを用いれば、未知の乳酸菌試料が、本研究で用いた 8 種類の乳酸菌と遺伝学的に類
縁であるか否かを、迅速かつ高い信頼性で判定することができるであろう。
2007 年 12 月 1 日の時点で全ゲノム塩基配列が公開されているバクテリアは 798 株（ド
ラフト状態を含む）に達し、その数は毎月 10 株以上のペースで増加している。これら全て
のバクテリアに対して、個々のリボソームサブユニットタンパク質を、ゲル電気泳動や高
速液体クロマトグラフィーによる各サブユニットの単離と酵素消化を組み合わせたプロテ
オーム解析の手法により詳細に解析することは現実的ではない。一方、菌体破砕液を試料
として用いた MALDI-MS によるリボソームタンパク質のキャラクタリゼーションによっ
て、遺伝学的に近縁のバクテリア間で共通する翻訳後修飾などを解析すれば、リボソーム
タンパク質の発現質量を包括的に検証することができる。今後、この手法を用いて、より
多くのバクテリアについてリボソームタンパク質の観測質量の検証が進むことが望まれる。
-132-
Table 3-3-8. Calculated mass of [M + H]+ ions of ribosomal subunit proteins used as
reliable biomarkers for identification of lactic acid bacteria.
Lb.
brevis
Lb.
bulgaricus
Lb.
gasseri
Lb.
plantarum
Lc.
cremoris
Le.
mesenteroides
Pe.
pentosaceus
St.
thermophilus
L9
17161.9
-
16904.6
16470.2
16351.3
16488.0
16510.3
17100.0
L13
16214.5
16392.0
16369.9
16169.7
16195.8
16325.8
16428.0
16172.9
L14
13296.4
-
-
13149.2
12923.1
13125.2
13206.4
13080.2
L15
15281.6
15635.0
15858.4
15345.6
15349.5
15440.8
15444.9
15531.9
L17
14097.2
14272.6
14392.8
14036.1
14125.3
14176.2
14109.2
14330.4
L18
13066.0
12926.8
13118.0
13041.8
12405.2
12720.5
12959.8
12924.9
L19
13655.9
-
-
13610.7
13102.3
13557.8
13650.9
13147.4
L20
13210.7
13323.7
13317.7
13459.9
13563.1
15824.4
13243.7
13502.9
L21
10969.7
-
11452.3
11049.6
-
10867.5
11130.8
-
L22
12580.4
12612.6
12640.6
12351.3
12339.3
12977.9
12741.7
12286.3
L23
11051.9
11259.0
11349.1
11152.9
10698.4
10961.7
10959.8
10790.7
L24
11195.0
8184.4
8438.8
11381.1
10877.8
10992.7
11230.1
10841.8
L28
6883.1
6726.9
6800.1
6871.0
7043.2
7133.3
6879.0
6782.1
L29
7581.8
7681.8
7738.0
7538.8
7860.2
7626.8
7579.8
7901.2
L30
6565.7
6543.7
6497.8
6550.8
6063.2
6411.6
6511.6
6268.3
L31
9389.2
9407.6
9364.6
9136.2
9353.5
9910.0
9071.2
9326.4
L32
6692.9
7025.9
7110.0
6504.6
6532.4
6241.0
6533.6
6650.6
L34
5336.3
5295.3
5336.4
4745.4
5183.1
5321.3
5377.4
5346.4
L35
7318.6
-
7647.0
7288.7
7688.1
7300.6
7367.6
7690.1
L36
4518.6
4409.4
4413.4
4560.6
4422.4
4442.4
4564.6
4452.4
S5
17341.1
17875.5
18586.5
17130.8
17422.1
17399.1
17421.1
16920.6
S6
11381.9
-
11425.9
11297.6
-
11190.6
10687.1
10980.4
S7
17895.6
17820.3
17651.3
17711.2
17684.4
17934.5
17742.5
17633.3
S8
14655.1
14322.5
14510.7
14644.0
14539.9
14557.8
14692.1
14656.0
S9
14195.4
14193.5
14266.5
14464.6
13968.1
14130.3
14236.4
14109.2
S10
11561.5
11447.2
11341.1
11605.6
11611.5
11632.6
11519.5
11425.3
S11
13518.5
13540.5
13489.5
13647.7
13157.1
13321.3
13553.5
13255.2
S12
14960.4
14797.1
14797.2
15059.5
14993.6
14969.5
15046.5
14926.4
S13
13485.5
13040.9
12999.9
13507.6
13361.4
13460.5
13621.7
13290.4
S14
6974.3
6987.2
-
7030.3
7004.4
9871.5
7006.2
6966.3
S15
10308.9
10341.7
10271.8
10405.9
10212.8
10307.8
10289.8
10387.0
S16
10267.8
10377.0
10455.1
10077.7
10135.7
15037.3
10185.8
10267.9
S17
9998.5
10380.0
10383.9
10217.0
10163.8
10051.6
10087.7
10027.7
S18
9016.5
8798.3
8795.3
8972.4
9240.9
10904.5
9030.6
9137.6
S19
10232.8
10152.7
10496.1
10160.6
10442.0
10357.0
10355.9
10420.0
S20
9060.4
8832.3
9174.6
8954.4
8236.5
9158.5
9151.7
8290.5
S21
7392.7
6965.9
6937.9
7429.7
6888.0
7080.2
-
6779.9
The figures with underline indicate corrected masses.
-133-
文献
[1]
Geno, P. W.; Macfarlane, R. D.: Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 1989, 92, 195.
[2]
Alexandrov, M. L.; Gall, L. N.; Krasnov, N. V.; Lokshin, L. R.; Chuprikov, A. V.:
Rapid Commun. Mass Spectrom. 1990, 4, 9.
[3]
Arnold, R. J.; Reilly, J. P.: Anal. Biochem. 1999, 269, 105.
[4]
Strader, M. B.; VerBerkmoes, N. C.; Tabb, D. L.; Connelly, H. M.; Barton, J. W.;
Bruce, B. D.; Pelletier, D. A.; Davison, B. H.; Hettich, R. L.; Larimer, F. W.; Hurst, G.
B.: J. Proteome Res. 2004, 3, 965.
[5]
Suh, M. J.; Hamburg, D. M.; Gregory, S. T.; Dahlberg, A. E.; Limbach, P. A.:
Proteomics 2005, 5, 4818.
[6]
Running, W. E.; Ravipaty, S.; Karty, J. A.; Reilly, J. P.: J. Proteome Res. 2007, 6, 337.
[7]
Gudkov, A. T.: FEBS Lett. 1997, 407, 253.
[8]
Dognin, M. J.; Wittmann-Liebold, B.: Eur. J. Biochem. 1980, 112, 131.
[9]
Teramoto, K.; Sato, H.; Sun, L.; Torimura, M.; Tao, H.: J. Proteome Res. 2007, 6,
3899.
[10]
Makarova, K. S.; Ponomarev, V. A.; Koonin, E. V.: Genome Biolog. 2001, 2,
research0033.1 (in electric version available through PubMed Central. URL:
<http://www.pubmedcentral.nih.gov/>).
-134-
-135-
3-4 MALDI-MS を用いたバクテリアの迅速識別法の菌株保存管理への応用
3-4-1 緒言
バクテリア菌株を保存管理するためには、定期的にバクテリアの植え継ぎを行う必要が
ある。しかし、注意深く作業を行っても、雑菌汚染（コンタミネーション）の可能性は排
除できない。バクテリアのコンタミネーションは、グラム染色での染まり具合や細胞の形
などの、顕微鏡観察により確認できる場合がある[1]。しかしながら、これらの方法で、近
縁種によるコンタミネーションを判定するのは相当の経験と熟練をもってしても困難であ
る。一方、信頼性の高いバクテリアの同定には、DNA 塩基配列の比較による方法が有効で
あるが、この手法は操作が煩雑であるうえ迅速性を欠くため、日常的な保存菌株の管理を
目的とした解析手段としては、あまり現実的ではない。そのため、迅速、簡便かつ信頼性
の高いバクテリアの識別法の開発が求められている。
一方、リボソームサブユニットタンパク質群の質量は各種乳酸菌に固有であり、それら
をバイオマーカーとすれば、各種乳酸菌を迅速に同定できることは、前節 3-3 で述べた。本
法を利用すれば、保存バクテリアの種類を迅速に確認し、コンタミネーションの有無を容
易かつ迅速に検証することが可能であると考えられる。本研究では、発酵食品に使用され
ている代表的な乳酸菌 3 種類をモデルとした迅速識別を試み、その MALDI マススペクト
ル情報をもとにして、実際に研究室で保存している乳酸菌試料のコンタミネーションを判
定した。
3-4-2 実験
T
乳酸菌試料は Lactococcus lactis subsp. lactis (Lc. lactis) JCM 5805（理化学研究所より
入 手 ）、 Lactococcus lactis subsp. cremoris (Lc. cremoris) NBRC 100676T お よ び
Streptococcus (St.) thermophilus NBRC 13957（製品評価技術基盤機構より入手）の計 3
菌株を用いた。各乳酸菌は、MRS 液体培地を用いて Lc. lactis、および Lc. cremoris は 30℃、
S. thermophilus は 37℃にて、それぞれ 18 時間培養した。培養した各乳酸菌は、第 2 章で
-136-
述べた方法により、菌体破砕液を調製し、MALDI-MS 測定を行った。
3-4-3 結果および考察
(a) 菌体破砕液の MALDI マススペクトルによる 3 種の乳酸菌の識別
Lc. lactis を目的菌株と見なして、これと属レベルで異なる St. thermophilus および亜種
レベルで異なる Lc. cremoris の MALDI マススペクトルを比較し、目的菌株と同一の m/z
値に観測されるピークの有無を調べた。Fig. 3-4-1 に、各乳酸菌株から調製した菌体破砕液
の MALDI マススペクトルについて、m/z 10100～10500 を拡大して示す。この範囲におい
て、Lc. lactis (Fig. 3-4-1a)について帰属されたリボソームサブユニットタンパク質は、S16、
S15、および S19 であった。次に、属レベルで異なる St. thermophilus のマススペクトル
(Fig. 3-4-1b)と比較すると、同じ m/z 値に観測されるピークは認められない。一方、亜種レ
ベルで異なる Lc. cremoris のマススペクトル(Fig. 3-4-1c)と比較すると、S15 のピークが共
通して観測されている。しかし、S16 と S19 のピーク位置は一見すると一致しているよう
に見えるが、
それぞれ約 4.5 Da (443 ppm)および 2 Da (196 ppm)の違いが認められ、かつ、
この 150 ppm 以上の差は有意であることを繰り返し測定によって確認した。このように、
本法では MALDI-MS の質量精度の高さを利用して、リボソームタンパク質のわずかな質量
の違いを、明確に識別することが可能である。
S15
10100
10439.6
10385.4
10441.6
10213.1
10145.1
10121.9
10266.2
(b)
(c)
S19
10212.2
10149.6
(a) S16
10200
10300
m/z
10400
10500
Fig. 3-4-1. MALDI mass spectra of cell lysates of Lc. lactis (a), St. thermophilus
(b), and Lc. cremoris NBRC 100676 (c).
-137-
以上のようにして調べた、Lc. lactis と共通して観測された St. thermophilus および Lc.
cremoris のリボソームサブユニットタンパク質を、Table 3-4-1 にまとめて示す。Lc. lactis
について帰属されたリボソームサブユニットタンパク質は 30 種であり、全 55 種類のリボ
ソームサブユニットタンパク質の過半数であった。この 30 本のピークを基準として、属レ
ベルで異なる St. thermophilus のマススペクトルを調べたところ、同じ m/z 値に観測され
Table 3-4-1. Observed biomarker peaks of cell lysate of Lc. cremoris and St.
thermophilus common to those of Lc. lactis
Protein name
Calculated m/z
values
Observed peaksa)
St. thermophilus
Lc. cremoris
L3
21801.6
―
L13
16195.8
―
―
✓
L14
12923.1
―
✓
L15
15377.6
―
L17
14124.6
―
―
✓
L18
12391.2
―
―
L19
13120.3
―
―
L20
13534.4
―
L22
12338.6
―
―
✓
L23
10612.6
―
L24
10877.8
―
―
✓
L28
7042.5
―
✓
L29
7860.2
―
✓
L30
6062.5
―
✓
L31
9337.5
―
―
✓
L32
6531.7
―
L34
5183.1
―
―
L35
7745.4
―
L36
4422.4
―
―
✓
S9
13967.4
―
✓
S10
11610.8
―
✓
S11
13156.4
―
✓
S12
14992.9
―
✓
S13
13360.7
―
✓
S14
7002.7
―
✓
S15
10212.1
―
✓
S16
10150.1
―
―
S19
10439.3
―
―
S20
8221.8
―
S21
Number of the
identified
peaks
6887.3
―
―
✓
0
18
―
a) ✓：Peak present; ―：Peak not found
-138-
たピークは 1 本も存在しておらず、Lc. lactis とは全く異なるバクテリアであることを容易
に識別することが可能である。一方、亜種レベルで異なる Lc. cremoris では、18 本のピー
クが共通して観測され、リボソームタンパク質のアミノ酸配列が同一であるリボソームサ
ブユニットタンパク質がある程度存在していることが分かった。しかしながら、一方で 12
本ものピークが異なっており、こうした違いに着目すれば、亜種レベルで異なるバクテリ
アであっても容易に識別できる可能性が示唆された。
(b) 保存菌株のコンタミネーションの検証例
同じ種類の培地で増殖する近縁バクテリアの植え継ぎを同一環境下で連続して行うと、
コンタミネーションが起こる可能性が高くなるため、バクテリアを使用する実験の前には、
コンタミネーションの有無を確認することが望ましい。実際に我々は、実験前に培養した
菌株の MALDI-MS 測定し、実験菌株の確認を行っているが、その際に Lc. lactis として保
存した菌株のコンタミネーションが疑われた。そこで、MALDI マススペクトルの比較によ
る混入菌株の特定を試みた。まず、被検菌体の MALDI マススペクトル（Fig. 3-4-2a）を、
コンタミネーションがないことが確認されている Lc. lactis JCM 5805 の MALDI マススペ
クトルと比較した。その結果、Lc. lactis JCM 5805 のリボソームサブユニットタンパク質
のピークと一致した被検菌体のピークは、Fig. 3-4-2a 中*で示したわずか 8 本であり、明確
に観測されたピークの大半は一致しないことが分かった。そこで、その他の保存菌株の
MALDI マ ス ス ペ ク ト ル と 比 較 し た と こ ろ 、 Fig. 3-4-2b に 示 す Lactobacillus (Lb.)
plantarum NCIMB 8826 の MALDI マススペクトルのリボソームサブユニットタンパク質
5)のピークと、▽で示した
31 本のピークが一致することが分かった。以上の結果から、保
存していた Lc. lactis には、Lb. plantarum が混入していたことが示唆された。実際に、こ
の植え継ぎ操作の前に、Lb. plantarum の植え継ぎを行った記録があり、それが原因で Lb.
plantarum によるコンタミネーションが起こったものと考えられる。球菌である Lc. lactis
と桿菌である Lb. plantarum は、その形状の違いから従来法である顕微鏡観察でもコンタ
ミネーションを確認できるが、本法によれば混入した菌種まで特定できる可能性が示唆さ
-139-
れた。
以上のように、保存バクテリアのリボソームタンパク質の基準 MALDI マススペクトル
を記録しておき、菌体の植え継ぎや分譲に際して MALDI-MS 測定を行って、その基準マス
スペクトルと比較すれば、コンタミネーションやその原因菌の特定、および菌株の取り違
えを容易かつ高い信頼性で検証することが可能となるであろう。今後基礎検討を進め、デ
ータを蓄積していくことによって、本法は、バクテリア管理および認証システムや、食中
毒菌が検出された際には汚染源の特定への応用などに有効な手法になり得ると考えられる。
(a)
IS
×10
IS
*
*
*
*
*
**
*
(b)
×10
IS
IS
4000
6000
8000
10000
12000
m/z
14000
16000
18000
20000 22000
Fig. 3-4-2. MALDI mass spectrum of the stored lactic acid bacteria (a) and
reference MALDI mass spectra of Lb. plantarum NCIMB 8826 (b)
The labels indicate ribosomal proteins identified for Lc. lactis subsp. lactis (*), and
Lb. plantarum (∇).
-140-
文
[1]
献
以後崎陽子; 資延淳二; 宮本恭惠: 特許生物寄託センター技術報告集 2005, 3, 1.
-141-
3-5 MALDI-MS による火落ち菌の迅速同定
3-5-1 緒言
乳酸菌の中には 12～16％のエタノールに耐性を有するものがあり、それらが清酒の貯蔵
中で増殖すると清酒が白濁すると共に香りが損なわれ、製品としての価値が失われる[2]。
このような乳酸菌を｢火落ち菌｣と言い、基本的に Lactobacillus (Lb.)属の乳酸菌であり、醸
造現場でよく検出されるものとして Lb. fructivorans、Lb. hilgardii、Lb. paracasei、およ
び Lb. rhamnosus が挙げられる。清酒の品質管理および汚染源の特定のために、火落ち菌
を迅速・簡便に識別あるいは同定して検出する手法の開発が望まれる。
火落ち菌の同定には、火落ち菌抗体に対する抗原遺伝子[3]や 16S rRNA 遺伝子および
23S rRNA 遺伝子のスペーサー領域[4]の塩基配列に基づいた相同性解析が報告されている。
現在、後者の技術を利用した火落ち菌検出キットも市販されている。しかしながら、遺伝
子解析に基づく方法は、煩雑な前処理や数日程度の解析時間が必要である。
そこで、本研究では、リボソームタンパク質を指標とした MALDI-MS によるバクテリア
の迅速同定法を用いて、清酒醸造所で発生した火落ち菌の同定を試みた。これまで述べて
きた研究では、試料菌株はすべてリボソームサブユニットタンパク質の翻訳アミノ酸配列
情報が入手できるものであった。しかし、火落ち菌として知られる乳酸菌は、いずれもゲ
ノム解読情報が公開されていないため、これまでのようにバイオマーカーとして用いるリ
ボソームサブユニットタンパク質群の質量をアミノ酸配列から計算により推測することが
できない。そこで、清酒製造現場でしばしば検出される代表的な火落ち菌 5 種について、
精製したリボソームタンパク質と菌体破砕液に共通して観測される MALDI マススペクト
ルのピークを調べ、各火落ち菌に特有の m/z 値をまとめたデータベースを作成した。さら
に、このデータベースを用いて、実際に清酒醸造所で発生した火落ち菌の同定を試みた。
3-5-2 実験
代表的な火落ち菌として知られる Lactobacillus 属の乳酸菌 5 種(Lb. fructivorans JCM
-142-
1117、Lb. hilgardii JCM 1155、Lb. paracasei subsp. paracasei JCM 1053、Lb. paracasei
subsp. tolerans JCM 1171、および Lb. rhamnosus JCM 1136)を理化学研究所から購入し、
データベース作成用の参照試料とした。醸造現場では、貯蔵した清酒をフィルターろ過し、
そのフィルターを培養に供することによって生菌増殖の有無を確認している。本研究では、
月桂冠より提供された、
メンブレンフィルター（直径 37 mm、ポアサイズ 0.45µm, ADVANTEC）
上に捕集された火落ち菌を実試料として用いた。この火落ち菌の 16S rRNA 遺伝子の部分塩基
配列約 500bp をテクノスルガ・ラボに依頼して解読した。
購入した各火落ち菌の培養は、第 2 章で述べた方法により、乳酸菌の培養に適した MRS
培地を用いて、37℃で 24 時間、液体培養により行った。メンブレンフィルター上に捕集され
た火落ち菌は、37℃で 72 時間、MRS 液体培地を用いて再培養した。培養した各火落ち菌から
菌体破砕液および精製リボソームタンパク質画分を調製し、MALDI-MS 測定を行った。
3-5-3 結果および考察
(a) 火落ち菌同定用バイオマーカーの選択
Fig. 3-5-1 に、本研究で用いた 5 種類の火落ち菌の精製リボソームタンパク質画分の
MALDI マススペクトルを比較して示す。ここでは、ピークが比較的高強度で観測された
m/z 6000-12000 の範囲に注目した。本章でこれまで実証してきたように、シナピン酸をマ
トリックス剤として用い、比較的高濃度（1%以上）のトリフルオロ酢酸を加えた溶媒を用
いて測定用の結晶を調製した場合、リボソームサブユニットタンパク質は主として 1 価の
プロトン化分子([M + H]+)として観測される。そのため、Fig. 3-5-1 中の観測ピークも同様
であると考えられる。
Table 3-5-1 に、バイオマーカーの候補として選択したピークの m/z 値をまとめて示す。
まず始めに、それぞれの火落ち菌について、図示した範囲でピーク強度が高い順に 15 本の
ピークをバイオマーカーの候補として選択した。これらは、Fig. 3-5-1 および Table 3-5-1
において太字で示した。さらに、上位 15 本に含まれなかったピークについても、他の火落
ち菌で選択されたピークと 2 Da 以内で m/z 値が一致する場合、同一の質量をもつ成分であ
-143-
(e)
6000
7000
8000
9000
m/z
rhamnosus JCM 1136
-144-
10000
11000
11443
11247
10392
10447
9986
11441
11589
11203
10071
10170
9548
10447
8997
9229 9186
7649
9396
6618
(d)
9614
8998
9100
9229
9383
7579
7479
6819
6849 6965
11231
11351
11441
10071
10171
10392
10447
8999
9100
9187
9229
9396
9549
7479
7649
6848
6617
6980
6819
(c)
7649
7786
6794
6820
6836
6952
7004
10175
10361
9199
9337
9454
9508
8989
7786
7305
7545 7580
6873
7020
6714
6343
(b)
6874
6715
6112
10933
11039
10191
10307
10404
9335
9573
7611
7786
7308
6932
7032
6495
6113
6433
(a)
12000
Fig. 3-5-1. MALDI mass spectra of isolated ribosomal proteins of hiochi bacteria. (a)
Lb. fructivorans JCM 1117, (b) Lb. hilgardii JCM 1155, (c) Lb. paracasei subsp.
paracasei JCM 1053, (d) Lb. paracasei subsp. tolerans JCM 1171, and (e) Lb.
Table 3-5-1 The m/z values of biomarkers peaks selected from isolated ribosomal proteins of five
reference hiochi bacteria
L. fructivorans
L. hilgardii
L. paracasei subsp.
L. paracasei subsp.
L. rhamnosus
JCM1117
JCM1155
paracasei JCM1053
tolerans JCM1171
JCM1136
6113
6112
6343
6433
6495
6618
6617
6715
6714
6794
6820
6819
6819
6836
6848
6847
6874
6873
6932
6952
6965
6980
7004
7020
7032
7305
7308
7479
7479
7545
7580
7579
7611
7648
7649
7649
7786
7786
7786
8989
8999
8997
8998
9100
9100
9187
9186
9199
9229
9229
9229
9335
9337
9383
9396
9396
9454
9508
9549
9548
9573
9614
9986
10071
10071
10171
10170
10175
10191
10307
10361
10392
10392
10404
10447
10447
10447
10933
11039
11203
11231
11247
11351
11441
11443
11441
11589
The bold types correspond to the 15 strongest biomarkers for each reference hiochi bacteria. The italic types ar
additional biomarkers whose m/z values are common to the selected biomarkers of other bacteria within error (2 Da).
-145-
ると判断して各火落ち菌のリストに追加した。これらは、Fig. 3-5-1 および Table 3-5-1 に
おいてイタリック体で示した。なお、選択した各ピークは、菌体破砕液の MALDI マスス
ペクトルでも観測されることを確認した。
Table 3-5-1 に示すように、選択した各ピークの m/z 値は、火落ち菌の種類の違いによっ
て共通するものと異なるものが混在している。各火落ち菌に対して観測されたピークをよ
り詳細に比較するために、Fig. 3-5-2 に m/z 6600-7100 の範囲（Fig. 3-5-1 のグレー部分）
を拡大して示す。この範囲では、Lb. fructivorans (a)および Lb. hilgardii (b)に対して観測
6932
7020
6980
6952
6874
(e)
7004
6965
6848
6847
6819
6794
6820
6836
(d)
6617
6618
6819
6714
(b)
6873
(a)
(c)
7032
されたピークの m/z 値は、それぞれの火落ち菌に固有のものであることが分かる。この傾
6600
6700
6800
6900
7000
7100
m/z
Fig. 3-5-2. Expanded MALDI mass spectra of Figure 3-5-1. (a) Lb. fructivorans
JCM 1117, (b) Lb. hilgardii JCM 1155, (c) Lb. paracasei subsp. paracasei JCM
1053, (d) Lb. paracasei subsp. tolerans JCM 1171, and (e) Lb. rhamnosus JCM
1136.
-146-
向は、Table 3-5-1 に示すように、今回解析対象とした m/z 6000-12000 の範囲で同様に観
測され、わずかに Lb. fructivorans の m/z 6113 および 9335 の各ピークが Lb. hilgardii の
ものと共通していること、Lb. hilgardii の m/z 6714、6873、および 7580 が Lb. rhamnosus
のものと共通していること、および m/z 7786 のピークが上記 3 種で共通している程度であ
った。
一方、Lb. paracasei で亜種(subsp.)が異なる 2 株のマススペクトル（Fig. 3-5-2c および d）
を比較すると、m/z 6618、6819、および 6848 付近のピークは測定誤差範囲内で一致して
いる。前節 3-4 で、Lactococcus lactis に属するが亜種が異なる 2 株の乳酸菌（Lb. lactis
subsp. lactis および subsp. cremoris）について、MALDI-MS で高強度で観測された 30 本
のサブユニットタンパク質のピークのうち、18 本が亜種間で同一の m/z 値に観測されたこ
とを述べた。これは各サブユニットタンパク質のアミノ酸配列が共通しているためである
[5]。同様に、Lb. paracasei subsp. paracasei JCM1053 と Lb. paracasei subsp. tolerans
JCM1171 に共通して観測されるピーク成分は、偶然に m/z 値が一致したのではなく、亜種
間で同一のアミノ酸配列を有している可能性が高い。すなわち、同一の m/z 値に観測され
るピーク成分は Lb. paracasei の種レベルでの同定に、また異なる m/z 値に観測されるピー
ク成分は亜種レベルでの同定に、それぞれ有用なバイオマーカーになり得ると考えられる。
興味深いことに、m/z 6819 付近のピークは、Lb. paracasei だけではなく Lb. rhamnosus
JCM1136 でも観測されている。その他にも、Lb. rhamnosus JCM1136 で観測された m/z
6820、7649、8998、9229、10392、10447、および 11443 の各ピークが、Lb. paracasei
の 2 株あるいは一方と共通して観測された。Lb. rhamnosus は Lb. paracasei と遺伝学的に
近縁の種であり、かつては Lb. paracasei の 2 亜種と共に Lb. casei に分類され、亜種が異
なる（それぞれ Lb. casei subsp. casei、subsp. tolerans、および subsp. rhamnosus）とさ
れていた[6]。そのため、上記の各ピーク成分は、Lb. paracasei と同一のアミノ酸配列を有
するリボソームサブユニットタンパク質である可能性が十分に考えられる。
以上のようにして、5 種類の火落ち菌参照試料から、m/z 値が重複するものを含めて、58
本のピークをバイオマーカーとして選択し、火落ち菌同定用のデータベースを作成した。
-147-
(b) Lb. paracasei のバイオマーカーピークの帰属
上述のように Lb. paracasei はかつて Lb. casei から独立して新たな種として分類された
が、最近、両者の様々な特性が明らかになるにつれ、Lb. casei と Lb. paracasei を再度統合
する提案がなされている[7]。その根拠として、全ゲノム解読された Lb. casei ATCC 334 [8]
は、Lb. paracasei と遺伝学的な特性がほぼ同一であることが挙げられている[7]。そこで、
ゲノム解読株である Lb. casei ATCC 334 の各リボソームサブユニットタンパク質の翻訳ア
ミノ酸配列から計算される質量を元に、バイオマーカーとして選択した Lb. paracasei
subsp. paracasei JCM 1053 および subsp. tolerans JCM 1171 のリボソームサブユニット
タンパク質の帰属を試みた。
Table 3-5-2 に、各バイオマーカーとして選択したピークに対して帰属された Lb. casei
ATCC 334 のリボソームサブユニットタンパク質の名称、[M + H]+の計算質量、および
Swiss-Prot のアクセッション番号を示す。Lb. paracasei subsp. paracasei JCM 1053 およ
び subsp. tolerans JCM 1171 に対して最終的にバイオマーカーとして選択したピークのう
ち、それぞれ 15 本および 13 本が Lb. casei ATCC 334 の翻訳アミノ酸配列から計算される
リボソームサブユニットタンパク質の[M + H]+の計算質量と一致した。これまでにゲノム
解読された様々なバクテリアのリボソームタンパク質についてアミノ酸配列の相同性検索
を行うと、種を超えてアミノ酸配列が同一（すなわちタンパク質の質量が同一）であるこ
とは、まれであることが分かる。このことから、Table 3-5-2 に示した結果は、Lb. paracasei
が Lb. casei と極めて近縁（あるいは同種）であることを強く支持すると共に、Lb. paracasei
に対してバイオマーカーとして選択されたピークが主としてリボソームサブユニットタン
パク質であることを裏付けている。なお、Lb. casei のリボソームタンパク質と質量が一致
しなかったピークについては、Lb. paracasei subsp. paracasei JCM 1053 および subsp.
tolerans JCM 1171 に固有の質量をもつリボソームサブユニットタンパク質である可能性
が考えられる。
-148-
Table 3-5-2. Identification of biomarker peaks of two L. paracasei subspecies by
comparing to the calculated masses of ribosomal proteins of genome-sequenced L. casei
ATCC 334
m/z values of biomarkers
L. paracasei subsp.
L. paracasei subsp.
paracasei JCM 1053
tolerans JCM 11171
6618
6819
6848
6980
7479
7649
8999
9100
9187
9229
9396
9549
10071
10171
10392
10447
11231
11351
11441
-
Ribosomal
protein name
L. casei ATCC334
Calculated mass
as [M + H]+
L30
S21
L28
L32
L29
L35
S18
S20
L31
S17
S15
S16
S19
L24
L21
S6
-
6619
6818
6847
6965
7480
7648
8997
9187
9549
10072
10170
10391
10447
11231
11351
11442
-
6617
6819
6847
6965
7974
7648
8997
9186
9229
9396
9548
10071
10170
10447
11203
11441
11589
Swiss-prot
accession
number
Q035A1
Q038S6
Q038I0
Q039I6
Q034Z1
Q038A1
Q03D45
Q039L4
Q034T0
Q034Z2
Q039L3
Q038J7
Q034Y7
Q034Z4
Q038F2
Q03D47
-
(c) 醸造所で発生した火落ち菌の同定への応用
清酒醸造所では、清酒を出荷する前に、貯蔵タンクから清酒を抜き取ってメンブレンフ
ィルターでろ過し、そのフィルターを培地に加えて培養することによって、清酒に火落ち
菌が発生していないか確認する作業が日常的に行われている。この工程で検出された火落
ち菌について、リボソームタンパク質を指標とする MALDI-MS による同定を試みた。
Fig. 3-5-3 に、醸造所で発生した火落ち菌の菌体破砕液の MALDI マススペクトルを示す。
観測された各ピークの m/z 値を、データベース（Table 3-5-1）にまとめたバイオマーカー
の m/z 値と比較し、それらと一致したピークを Table 3-5-3 に示す。なお、一致したピーク
については、Fig. 3-5-3 のマススペクトル中に太字で示した。ここでは、比較的高強度で観
測された 19 本のピークが、データベースに登録したバイオマーカーピークと一致した。そ
の内訳は、Lb. paracasei subsp. paracasei JCM1053 について 17 本、Lb. paracasei subsp.
-149-
6500
7710
7500
9099
9186
9253
9334
8997
8619
8413
8451
8265
0 mV
10000
9000
m/z
10000
9500
10500
11000
m/z
11605
11442
11351
11231
10391
10447
10072 10040
8500
10170
20 mV
8000
9395
61 mV
0 mV
8000
7479
7231
6964
6992
7000
m/z
9493
9548
0 mV
6000
6818
6847
6502
6599
6300
6195
6618
7383
7203
60 mV
11500
12000
Fig. 3-5-3. MALDI mass spectra of cell lysate of hiochi bacteria generated in a sake
brewery. Bold types indicate the peaks commonly observed for biomarker peaks
selected from five reference hiochi bacteria.
-150-
Table 3-5-3. Matched biomarkers of hiochi bacteria detected in a sake brewery
Observed
peaks
(m/z) of hiochi
bacteria sample
L. fructivorans
JCM1117
6618
6818
6847
6964
7479
8997
9099
9186
9229
9334
9395
9548
10072
10170
10391
10447
11231
11351
11442
9335
-
Numbers of matched
biomarkers
1
Matched biomarkers (m/z) for each reference hiochi bacteria
L. hilgardii
L. paracasei
L. paracasei
L. rhamnosus
JCM1155
subsp. paracasei
subsp. tolerans
JCM1136
JCM1053
JCM1171
6618
6617
6819
6819
6820
6848
6847
6965
7479
7479
8999
8997
8998
9100
9100
9187
9186
9229
9229
9229
9396
9396
9549
9548
10071
10071
10171
10170
10392
10392
10447
10447
10447
11231
11351
11441
11441
11443
0
17
14
7
tolerans JCM1053 について 14 本、Lb. rhamnosus JCM1136 について 7 本であった。こ
れらの大半は、Lb. casei ATCC334 のリボソームサブユニットタンパク質の計算質量(Table
3-5-2)とも一致した。一方、Lb. fructivorans JCM 1117 については m/z 9334 のピークが一
致しただけであり、Lb. hilgardii JCM 1155 については、2 Da 以内で一致するバイオマー
カーはなかった。すなわち、醸造所で発生した火落ち菌は、Lb. fructivorans および Lb.
hilgardii ではないと判断することができる。
醸造所で発生した火落ち菌は、Lb. paracasei subsp. paracasei、Lb. paracasei subsp.
tolerans、および Lb. rhamnosus のいずれと近縁であるか、MALDI マススペクトルを詳細
に調べた。Fig. 3-5-4 に、観測されたピークが異なっていた m/z 11100-11700 の領域につい
て、各火落ち菌の MALDI マススペクトルを比較して示す。この範囲では、醸造所で発生
した火落ち菌 (a) の m/z 11442 のピークが、 Lb. paracasei subsp. paracasei (b) 、 Lb.
paracasei subsp. tolerans (c)、および Lb. rhamnosus (d)に共通するバイオマーカーピーク
-151-
11100
11300
11605
11589
11605
11500
11573
11533
11441
11443
m/z
11605
11561
11561
11442
11441
11351
11321
11307
11335
11247
(d)
11203
(c)
11231
(b)
11351
11231
(a)
11700
Fig. 3-5-4. Comparison of MALDI mass spectra (m/z 11100-11700) of cell lysate of
hiochi bacteria generated in a sake brewery (a) and isolated ribosomal proteins of Lb.
paracasei subsp. paracasei JCM 1053 (b), Lb. paracasei subsp. tolerans JCM 1171 (c),
and Lb. rhamnosus JCM 1136 (d) as references.
と一致して観測されている。一方、
m/z 11231 および 11351 のピークは、Lb. paracasei subsp.
paracasei (b)のバイオマーカーピークとのみ一致した。その上、ピーク強度が上位 15 本に
入らなかったためバイオマーカーから除外した m/z 11561 および 11605 の各ピークも、前
者は Lb. paracasei subsp. paracasei (b)にのみ、後者は 2 亜種の Lb. paracasei (b, c)で観測
されており、いずれも Lb. rhamnosus (d) では観測されていない。以上のようにして、
MALDI マススペクトルの観測範囲全体に渡って共通するピークを精査したところ、醸造所
で発生した火落ち菌 (a)は、Lb. rhamnosus (d)に特徴的なバイオマーカーピークは全く観
測されず、Lb. paracasei subsp. paracasei (b)のバイオマーカーピークと共通するピークが
多く観測された。すなわち、この火落ち菌(a)は、少なくとも Lb. paracasei（あるいは Lb.
casei）であり、特に subsp. paracasei あるいはそれと遺伝学的に近縁のバクテリアである
ことが強く示唆された。そこで、この火落ち菌の 16S rRNA 遺伝子の部分塩基配列(552 bp)
-152-
を解読したところ、Lb. paracasei の各 subsp.および Lb. casei と 100%の相同性が得られた
一方で、Lb. fructivorans では 78%、Lb. hilgardii では 81%、Lb. rhamnosus では 88%の
相同性であり、醸造所で発生した火落ち菌が Lb. paracasei あるいは Lb. casei であるとい
う MALDI-MS による同定結果が支持された。
以上のように、翻訳アミノ酸配列情報が入手できない火落ち菌についても、リボソーム
タンパク質のマススペクトルを測定し、それらの中から比較的高強度で観測されるピーク
の m/z 値をデータベースにまとめた。そのデーターベースと、実際に清酒醸造所で発生し
た火落ち菌について MALDI-MS で観測されたピークの m/z 値を比較することにより、そ
れが Lb. paracasei あるいはそれと遺伝学的に近縁のバクテリアであると同定することがで
きた。その結果は、従来法である 16S rRNA 遺伝子解析により支持され、本法の有用性を
検証することができた。本法は、従来の遺伝子解析法と比較して迅速であり、清酒の品質
管理や汚染源の特定などに有効な手段として、検査機関等での実用分析法への発展が望ま
れる。
-153-
文
献
[1]
以後崎陽子; 資延淳二; 宮本恭惠: 特許生物寄託センター技術報告集 2005, 3, 1.
[2]
岡田早苗: 乳酸菌の科学と技術; 乳酸菌研究集談会, 編; 学会出版センター: 東京, 1996,
pp. 280-286 (3 乳酸菌による食品の変敗).
[3]
Nakamura, J.; Ito, D.; Nagai, K.; Umehara, Y.; Hamachi, M.; Kumagai, C.: J.
Ferment. Bioeng. 1997, 83, 161.
[4]
Nakagawa, T.; Shimada, M.; Mukai, H.; Asada, K.; Kato, I.; Fujino, K.; Sato, T.:
Appl. Environ. Microbiol. 1994, 60, 637.
[5]
寺本華奈江; 佐藤浩昭; 孫麗偉; 鳥村政基; 田尾博明: 分析化学 2006, 55, 987.
[6]
Collins, M. D.; Phillips, B. A.; Zanoni, P.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39, 105.
[7]
Dellaglio, F.; Felis, G. E.; Torriani, S.: Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002, 52, 285.
[8]
Makarova, K.; Slesarev, A.; Wolf, Y.; Sorokin, A.; Mirkin, B.; Koonin, E.; Pavlov, A.;
Pavlova, N.; Karamychev, V.; Polouchine, N.; Shakhova, V.; Grigoriev, I.; Lou, Y.;
Rohksar, D.; Lucas, S.; Huang, K.; Goodstein, D. M.; Hawkins, T.; Plengvidhya, V.;
Welker, D.; Hughes, J.; Goh, Y.; Benson, A.; Baldwin, K.; Lee, J. H.; Diaz-Muniz, I.;
Dosti, B.; Smeianov, V.; Wechter, W.; Barabote, R.; Lorca, G.; Altermann, E.;
Barrangou, R.; Ganesan, B.; Xie, Y.; Rawsthorne, H.; Tamir, D.; Parker, C.; Breidt,
F.; Broadbent, J.; Hutkins, R.; O'Sullivan, D.; Steele, J.; Unlu, G.; Saier, M.;
Klaenhammer, T.; Richardson, P.; Kozyavkin, S.; Weimer, B.; Mills, D.: Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 2006, 103, 15611.
-154-
第
4
章
リボソームタンパク質のアミノ酸配列の
変異に基づく MALDI-MS による
バクテリアの分子系統分類法の開発
-155-
4-1
環境微生物 Pseudomonas putida をモデルとしたリボソームタンパク質の
プロファイリングによる分子系統分類法の開発
4-1-1
緒言
バクテリアの機能や毒性などの諸特性は、クローンの集団である「株(strain)」ごとに異
なることが多いため、環境微生物学における生物多様性解析、病原菌や食中毒菌の疫学解
析、あるいは醗酵産業での有用バクテリアの探索などをはじめとする様々な分野で、バク
テリアを種レベルで同定するだけではなく、株レベルで識別あるいは分類することが重要
になる。バクテリアを遺伝子解析により分類するための手法としては、第 1 章でも概説し
たとおり、ゲル電気泳動法による DNA フラグメント解析と DNA 塩基配列解析が主に用い
られている。バクテリアの株レベルでのキャラクタリゼーションに用いられる DNA フラグ
メント解析の代表的な方法として、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)法[1]、randomly
amplified polymorphic DNA (RAPD)法[2]、amplified fragment length polymorphism
(AFLP)法[3, 4]などがあり、その他にも、制限酵素による切断、PCR による DNA の増幅、
ハイブリダイゼーションなどを組み合わせた様々な手法が提案されている[5]。しかし、フ
ラグメント解析は、電気泳動ゲル上の制限酵素処理により切断して得た DNA フラグメント
の数や移動度を解析する手法であるため、バンドの広がりにより移動度の再現性が低くな
るなど、再現性の高い結果を得るのが困難である。
最近では、バクテリアの DNA 塩基配列解析と相同性解析を組み合わせた分類法が主流に
なってきている。この方法で最も多く利用されているのが 16S rRNA 遺伝子の DNA 塩基
配列であるが、これは属～種レベルでの分類・同定が適用の限界である。それよりもさら
に詳細な分類区分である種～株レベルでバクテリアを分類するために、DNA ジャイレース
サブユニット遺伝子(gyrB)[6, 7]、RNA ポリメラーゼσ70 因子遺伝子(rpo D)[8]、およびシ
ャペロンタンパク質 DnaJ 遺伝子(dnaJ)[9]など、比較的進化速度が速い遺伝子を対象とし
た方法が提案されている。しかしながら、遺伝子の DNA 塩基配列には、分子進化による局
-156-
所的な変異だけではなく、水平伝播や相同組み換えなど、分子進化とは無関係な変異（組
み換え）も頻繁に起こっていることが明らかになり、1 種類の遺伝子の DNA 塩基配列の相
同性解析に頼って分類することに対して、その有効性に限界があることが指摘されている
[10-12]。
この問題を回避するために、multi-locus sequence typing (MLST)法が、バクテリアの株
レベルでの分類に有効な手法として、特に疫学解析の分野を中心に注目されている[13, 14]。
これは、分子進化を反映した複数のハウスキーピングタンパク質（多くの生物種が共通し
てもつ生命維持に必須のタンパク質群：第 1 章参照）をコードする遺伝子の部分 DNA 塩基
配列（通常 7 領域以上）に生じた変異のタイプをもとにして分類する手法である。MLST
では、1 箇所の塩基の違いであれ、大幅な相同組み換えであれ、いずれも部分塩基配列内に
生じた変異のタイプだけが注目される。そのため、従来の相同性解析で過大視されてきた
水平伝播と相同組み換えの影響を受けにくく、しかも異なる研究室間でデータが共有でき
ることが、MLST の大きな利点である[14]。しかし、この手法でも DNA の増幅と塩基配列
の解読に煩雑な操作と数日程度の時間が必要である。
本論文でこれまで述べてきたとおり、MALDI-MS で観測されるバクテリア菌体中のリボ
ソームタンパク質の観測質量を、ゲノム情報から推測される計算質量と比較することによ
って、迅速かつ簡便に、遺伝型(genotype)に基づくバクテリア種の同定を行うことができる。
その過程で、いくつかのリボソームサブユニットタンパク質で、菌株の違いにより、アミ
ノ酸配列に変異が生じていることが明らかになった。すなわち、このような変異に注目す
れば、バクテリアを株レベルで分類することが可能になると考えられる。
そこで本研究では、このような菌株の違いによって生じるリボソームサブユニットタン
パク質のアミノ酸配列の変異の有無を、MALDI マススペクトル上のピークシフトとして検
出し、そのデータをまとめて統計学的に解析することによって、バクテリアを株レベルで
分類する手法の開発を試みた。具体的には、基準となる菌株（通常はゲノム解読株）と試
料菌株のリボソームサブユニットタンパク質の観測質量を比較し、基準となる菌株のもの
と同じ質量で観測されたリボソームサブユニットタンパク質の有無を表にまとめ（プロフ
-157-
ァイル化）、そのデータをクラスター解析してデンドログラム（樹形図）を作成し、分類す
るものである。これまで提案されてきた MALDI-MS によるバクテリアの指紋判定法は、表
現型(phenotype)の違いに基づく「化学分類(chemotaxonomy)」に留まっているが、本研究
で提案する手法は、解析結果がリボソームサブユニットタンパク質の分子進化によるアミ
ノ酸配列の変異に基づいているため、遺伝子型(genotype)の違いを進化系統と関連付けて解
析する「分子系統分類(phylogenetic classification)」が達成できる可能性がある。上述した
MLST 法では、複数のハウスキーピング遺伝子の DNA 塩基配列をもとにしてバクテリアを
分類するが、本法は発現したハウスキーピングタンパク質の変異に基づいて分類する。す
なわち、「設計図」である遺伝子の DNA 塩基配列と「製品」であるタンパク質のいずれを
解析対象とするかという手段の違いはあるが、いずれも分子進化を反映した高分子構造の
変異に着目している点において、基本的な概念は同じである。本法は、MLST 法などの遺
伝子解析法と同様に、異なる研究室間で解析データを共有かつ比較でき、バクテリアの培
養条件や測定条件の影響を受けない。これは、従来の MALDI-MS による指紋判定法とは大
きく異なる利点である。しかも本法は、DNA の増幅と、ゲル電気泳動あるいは DNA 塩基
配列解析を必要とする遺伝子解析法に比べて、圧倒的に迅速かつ簡便である。
本研究では、この手法の妥当性を評価するために、16 株の Pseudomonas (P.) putida を
モデルとした解析を試みた。P. putida は、土壌、堆積物、および水圏中に広く分布する典
型的な環境微生物の一種である。最近、P. putida は、環境中でアルキルフェノール系界面
活性剤を生分解する能力を持ち、アルキルフェノールなどの外因性内分泌かく乱物質の生
成に深く関与していることが報告されている[18-22]。したがって、環境モニタリングを行
うために、様々な環境微生物の迅速なスクリーニング手法の開発が求められている。 P.
putida をはじめとする Pseudomonas 属バクテリアは菌株の多様性が豊富である。バクテ
リアを株レベルで分類するために、DNA ジャイレースサブユニット B 遺伝子(gyrB)を用い
た分子系統分類法が提案されており、P. putida は、それが初めて適用されたバクテリアで
もある[6, 7]。そこで本研究では、MALDI-MS で検出されるリボソームタンパク質のアミ
ノ酸配列の変異に基づく P. putida の分類結果を、gyrB を用いた分子系統分類の結果と比
-158-
較して、本研究で提案する MALDI-MS を用いた新しい系統分類法の有効性を検証した。
4-1-2
(1)
実験
試料菌株
MALDI-MS による分類結果を、gyrB の塩基配列解析に基づく分子系統解析の結果[7]と
比較するために、その報告で用いられた菌株を中心に、gyrB の DNA 塩基配列情報が入手
可能な P. putida 16 株を使用した。なお、gyrB の部分塩基配列(872 bp)は、海洋バイオ研
究所の gyrB データベース[23]から入手した。Table 4-1-1 に、各菌株の株名、入手先、培養
条件、および gyrB の塩基配列のアクセッション番号をまとめて示す。これらのうち、NBRC
100650 株は、ゲノム解読された KT 2440 株[24]と実質的に同一であるため、以降、本論文
では KT 2440 株と表記する。P. putida には、L-トリプトファンと L-キヌレニンの存在下で
の増殖能の違いに基づいて、2 つの生物型（biover A および biover B）に分類されている菌
株がいくつかある[25]。本研究で用いる 16 菌株のうち、NBRC 14164T 株（= IFO 14164T
株）、JCM 6158 株（= PpG7 株)、および JCM 13061 株（= ATCC 11172 株）は biover A
に分類され、ATCC 17484 株と ATCC 17522 株は biover B に分類されている[7]（括弧内
は、過去の報告[7]で使用された菌株名である）
。各試料菌株は、それぞれ入手先の指示に従
い、Table 4-1-1 に示した好気性条件下で培養した。培養した各菌株は、第 2 章で述べた方
法に従って、菌体破砕液および精製リボソームタンパク質画分を調製し、MALDI-MS 測定
を行った。
(2)
デンドログラムの作成
MALDI-MS によるバクテリアの分類では、BioNumerics ソフトウェア(ver. 3.5, Applied
Maths)を用い、非加重結合法(UPGMA)法によるクラスター解析によってデンドログラム
（樹形図）作成した。詳細な解析手順は、次節で述べる。一方、gyrB の DNA 塩基配列に
基づく分子系統樹は、MeGA 3.1 プログラム[26]を用いて、Kimura two-parameter モデル
により UPGMA 法で作成した。
-159-
Table 4-1-1. Strain names, culture conditions, and accession numbers of gyrB
sequence database of each P. putida strain.
Strain names
Types
Cultivation
Mediuma Accettion numbers of
gyrB sequence in
Temperature (ºC)
MBI
NBRC 100650 (= KT2440)
30
1
gy00395
NBRC 14671
30
1
gy10159
NBRC 14164T
biovar A
30
1
gy10158
NBRC 3738
30
1
gy10156
NBRC 100986
25
2
gy10168
NBRC 100988
25
2
rs10551
NBRC 101019
25
2
gy11182
JCM 6156
30
3
gy10157
JCM 6158
biovar
A
26
4
gy11246
JCM 13061
biovar
A
26
5
gy10160
MBIC 5315
25
2
gy12083
MBIC 3930
30
6
gy12349
ATCC 23973
26
7
gy10161
ATCC 17484
biovar B
26
5
gy10162
ATCC 17522
biovar B
26
5
gy10154
NCIMB 9816
25
8
gy10153
a
Medium
1
Polypepton 10 g, Yeast extract 2 g, MgSO4·7H2O 1 g, Distilled water 1 L, pH 7.0.
2
Bacto Marine Broth 2216 (Difco) 37.4 g, Distilled water 1 L.
3
(NH4)2HPO4 3 g, KH2PO4 1.2 g, NaCl 5 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, Yeast extract 0.5 g,
Sodium benzoate 4 g, Distilled water 1 L. Separately sterilize a solution of sodium
benzoate by filtration, and aseptically add it to the medium.
4
Peptone 10 g, Beef extract 10g, NaCl 5 g, Distilled water 1 L.
5
Beef extract 3 g, Peptone 5 g. Distilled water 1 L.
6
Bact Casamino acid 0.5 g, Glycerol 0.5 g, Yeast extract 0.1 g, Distilled water 1 L.
7
(NH4)2HPO4 3 g, KH2PO4 1.2 g, NaCl 5 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, Yeast extract 0.5 g,
Sodium benzoate (filter-sterilized) 3 g, Distilled water 1 L. Separately sterilize a
solution of sodium benzoate by filtration, and aseptically add it to the medium.
8
Beef extract 1 g, Yeast extract 2 g, Peptone 5 g, NaCl 15 g, Distilled water 1 L.
4-1-3
(1)
結果および考察
P. putida KT2440 のリボソームサブユニットタンパク質のキャラクタリゼーション
いくつかのリボソームサブユニットタンパク質で、翻訳後修飾やタンパク質データベー
スに登録されている翻訳アミノ酸配列情報の誤りにより、観測質量が翻訳アミノ酸配列に
基づく計算質量と一致しない場合があることは、第 3 章で実証してきた。そのため本研究
-160-
では、まず始めに、基準となる KT2440 株のリボソームサブユニットタンパク質の実際の
質量を検証し、信頼性の高いバイオマーカータンパク質を選択した。
Fig. 4-1-1 に KT2440 株の精製リボソームタンパク質画分(a)と菌体破砕液(b)の m/z
4000-28000 における MALDI マススペクトルを比較して示す。Table 4-1-2 に、KT2440
X2
L18
S12
S8
L19
S13
L14 S11
S10
L22
L21
L23
S15
S17
S20
S19
L28
S18
S21
L35
L34
L36
S14
S16
L24
L31
L33
100
Intensity %
(a )
L30
株で帰属されたリボソームサブユニットタンパク質の解析結果をまとめて示す。
0
L29
L20
Intensity %
(b )
100
0
(a )
5000
6000
7000
8000
9000
m /z
10000
11000
12000
13000 14000
L11
L15
4000
100
L13
S3
L1
L5
S7
S5
S6
L16
L25
L6
S9
L17
Intensity %
X2
0
Intensity %
(b )
100
0
14000
16000
18000
20000
22000
24000
26000
28000
m /z
Fig. 4-1-1. MALDI mass spectra of purified ribosomal protein (a) and cell lysate (b) of
P. putida KT2440.
-161-
Table 4-1-2. Assigned ribosomal subunit proteins for cell lysates of P. putida KT2440.
protein
name
Accession
a
number
Calculated massb
as molecule
Observed
as [M + H]+
mass
Error
in Da
in ppm
Large subunit proteins
L1
Q88QP4
L5
Q88QM3
L6
Q88QM0
L11
Q88QP5
24119.8
20197.6
19011.8
14861.2
24120.8
20198.6
19012.8
14862.2
24124.3
20200.5
19014.1
14862.8
3.5
1.9
1.3
0.6
145
94
69
42
L13
L14
L15
L16
Q88N97
Q88QM5
Q88QL6
Q88QM8
15862.3
13409.9
15189.4
15417.3
15863.3
13410.9
15190.4
15418.3
15864.0
13410.7
15190.9
15420.3
0.7
-0.2
0.5
2.0
44
-16
30
131
L17
L18
L19
L20
L21
L22
L23
L24
L25
L28
L29
L30
L31
L33
L34
L35
L36
Q88QL0
Q88QL9
Q88MV3
Q88K24
Q88Q10
Q88QN0
Q88QN3
Q88QM4
Q88PX7
Q88C99
Q88QM7
Q88QL7
Q88CU3
Q88CA0
P0A161
Q88K25
P61113
14362.7
12496.4
12880.9
13148.7
11500.4
11910.9
10899.6
11329.2
21007.9
8791.3
7172.3
6320.5
7844.1
5990.0
5138.2
7213.7
4434.4
14363.7
12497.4
12881.9
13149.7
11501.4
11911.9
10900.6
11330.2
21008.9
8792.3
7173.3
6321.5
7845.1
5991.0
5139.2
7214.7
4435.4
14364.0
12497.1
12881.6
13149.4
11502.1
11911.9
10900.5
11330.0
21011.0
8791.4
7172.7
6321.7
7844.5
5991.4
5139.3
7215.0
4435.8
0.4
-0.3
-0.3
-0.3
0.7
-0.1
-0.1
-0.2
2.1
-0.9
-0.6
0.2
-0.6
0.3
0.1
0.3
0.5
27
-22
-23
-23
58
-7
-9
-22
100
-106
-81
34
-70
54
19
39
103
25593.7
17577.3
16372.9
17447.3
13844.1
14460.5
11752.6
13542.5
13641.7
25594.7
17578.3
16373.9
17448.3
13845.1
14461.5
11753.6
13543.5
13642.7
25594.6
17579.7
16374.9
17449.5
13844.9
14461.6
11753.4
13544.3
13642.0
Small subunit proteins
S3
Q88QM9
S5
Q88QL8
S6
Q88DE8
S7
Q88QN9
S8
Q88QM1
S9
Q88N96
S10
Q88QN6
S11
P59374
S12
Q88QP0
-0.1
1.4
1.0
1.2
-0.2
0.1
-0.2
0.8
-0.7
-4
79
59
71
-16
6
-16
57
-53
Modificationsc
-Met
-Met
-Met
-Met, Methylation (9
times)
Methylation (2 times)
and oxidation
-Met
-Met
-Met
-Met
-Met
-Met
-Metd
-Met
-Met
-Met
-Met, acetylation
-Met
-Met
-Met
-Met, methylation
-Met,
β-methylthiolation
S13
Q88QL3
13125.3
13126.3
13126.1
-0.2
-15 -Met
S14
Q88QM2
11272.3
11273.3
11272.8
-0.5
-41 -Met
S15
Q88DV9
9899.3
9900.3
9899.7
-0.7
-66 -Met
S16
Q88MV6
9188.5
9189.5
9189.6
0.1
10 -Met
S17
Q88QM6
9926.6
9927.6
9926.7
-0.9
-93 -Met
S18
Q88DE9
8838.3
8839.3
8838.6
-0.6
-73 -Met, acetylation
S19
Q88QN1
10217.1
10218.1
10218.1
0.0
0 -Met
S20
Q88Q95
9937.6
9938.6
9938.4
-0.2
-23 -Met
S21
P0A165
8238.6
8239.6
8239.2
-0.4
-49 -Met
a
Accession numbers in Swiss-Prot/TrEMBL protein sequence database. b Considering with post-translational
modifications. c -Met means N-terminal methionine loss. d Mis-annotation of the start codon?
-162-
翻訳アミノ酸配列から計算質量を求めるために、前章と同様に、N 末端則（第 2 章）に
基づき、N 末端メチオニン残基の切断を考慮した。この経験則では、2 番目のアミノ酸残基
がグリシン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、スレオニン、およびシステインのい
ずれかの場合、N 末端メチオニン残基が切断される[27, 28]。しかし、S16 の場合は、2 番
目のアミノ酸残基がバリンであるが、N 末端メチオニン残基が切断されない場合の計算質
量 に 一 致 し た ピ ー ク が 観 測 さ れ た 。 同 様 の 例 外 は 、 す で に E. coli の S16 [29] と
Saccharomyces cerevisiae の S27 および L42 [30]でも報告されている。また、N 末端側の
アミノ酸配列が MMLAN-である L29 では、N 末端メチオニン残基の切断が起こった場合
に、観測質量と計算質量が一致した。しかし、実際には、N 末端メチオニン残基が切断さ
れたのではなく、翻訳アミノ酸配列が誤っているのではないかと考えられる。
前章で解析対象とした各種乳酸菌はグラム陽性菌であり、これらのリボソームタンパク
質の翻訳後修飾は、全くといってよいほど明らかではなかったため、N 末端メチオニン残
基の切断以外の翻訳後修飾は考慮しなかった。しかし、本節で解析対象とする P. putida は
グラム陰性菌であり、グラム陰性菌の翻訳後修飾は種や属の違いを超えてかなり共通する
ことがすでに知られている[29, 31-33]。そこで、これらの報告を参考にしながら、各翻訳後
修飾を加味した計算質量を求めて観測質量と比較したところ、他のグラム陰性菌の翻訳後
修飾と同様に、L11 のメチル化（9 ヶ所）、L16 のメチル化（2 ヶ所）と水酸化（1 ヶ所）、
S5 のアセチル化、S11 のメチル化、S12 のβ-メチルチオール化、および S18 のアセチル化
が起こっていることを確認した。
2 種類のリボソームサブユニットタンパク質（L20 と L29）は、菌体破砕液でのみ観測さ
れた。これらは、70S リボソーム中で直接 23S rRNA と結合しているため、リボソームタ
ンパク質精製工程において、rRNA とともに損失したと考えられる[34]。同様の現象[15, 16]
が起こることは、既に 3 章で述べた。
以上のようにして、最終的に Table 4-1-2 に示す 43 種類のリボソームサブユニットタン
パク質を P. putida の分類に用いる信頼性の高いバイオマーカータンパク質として選択した。
-163-
(2)
リボソームサブユニットタンパク質のアミノ酸配列の多様性
Fig. 4-1-2 に、KT2440 株（基準）、NBRC 14164T 株(biover A)、および ATCC 17522 株
(biover B)の m/z 9000-14000 のマススペクトルを示す。アスタリスクを付けたピークは、
KT2440 株のリボソームタンパク質から選択したバイオマーカータンパク質と、150 ppm
以内の誤差で同じ m/z 値にピークが観測されたものである。NBRC 14165T 株(biover A)の
マススペクトルは、KT2440 株のものとよく似ている。一方、ATCC 17522 株(biover B)の
場合は、示した範囲において 3 種類のバイオマーカータンパク質（S10、L22、および L14）
だけが一致した。この結果から、KT2440 株は、ATCC 17522 株よりも NBRC 14165T 株と
遺伝学的な類縁性が高いことを示唆している。
実際に、KT2440 株の gyrB の塩基配列でも、
ATCC 17522 株（相同性 85%）より NBRC 14164T 株（相同性 91%）の方が高い相同性を
示し、MALDI-MS による結果を支持した。このようにして、すべての菌株について、KT2440
株を基準として選択した 43 種類のバイオマーカー(Table 4-1-2)の質量と一致するピークの
S12
-S08
-L19
S13
L20
-L14
S11
-L18
-S10
-L22
-L24
-L21
S14
-S15
-S19
-L23
Intensity %
S17
S20
(a) 100
-S16
有無を調べた。
0
(b) 100
Intensity %
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
* **
0
Intensity %
(c) 100
*
*
*
0
9000
10000
11000
m/z
12000
13000
14000
Fig. 4-1-2. MALDI mass spectra of cell lysate of P. putida strains. (a) KT2440
(reference strain), (b) NBRC 14164T (biover A), and (c) ATCC 17522 (biover B).
Asterisks indicate the biomarkers with the same masses with those of KT2440.
-164-
Fig. 4-1-3 に、それぞれの菌株について、一致したバイオマーカータンパク質の割合(%)
と KT2440 株の gyrB 塩基配列との相同性の関係を示す。興味深いことに、gyrB の DNA
塩基配列解析により遺伝子学的な類縁性が大きく異なると判断された各菌株は、バイオマ
ーカータンパク質の一致率の違いでも明確に識別することができた。例えば、相同性が 85%
以上の菌株群（ATCC 23973 株、JCM 6156 株、MBIC 5315 株、NBRC 100986 株、NBRC
10988 株、および NBRC 101019 株）では、バイオマーカータンパク質の一致率は 80%以
上であった。一方、biover B を含む 4 菌株（ATCC 17484 株、ATCC 17522 株、NBRC 3738
株、および NCIMB 9816 株）では、gyrB 塩基配列の相同性は 85%以下と低い値であった
が、これに対してバイオマーカータンパク質の一致率もかなり低い値(12-14%)であった。
このように、両者の結果の間には、非常に高い相関（相関係数約 0.91）があることが示さ
れた。リボソームタンパク質と DNA ジャイレースサブユニット B タンパク質は、いずれ
もバクテリアの生命維持に必須のハウスキーピングタンパク質であり、これらタンパク質
のアミノ酸配列（およびそれをコードする DNA 塩基配列）は、いずれも分子進化を反映し
て変異すると考えられるため、このような高い相関が得られた結果は妥当である。
KT2440
100
R2 = 0.91
Rate of matched biomarkers (%)
ATCC 23973
JCM 6156
NBIC 5315
NBRC 100986
NBRC 101019
80
NBRC 14671
JCM 13061
NBRC 100988
JCM 6158
NBRC 14164T
60
40
20
NBIC 3930
ATCC 17484
NBRC 3738
ATCC 17522
NCIMB-9816
0
80
90
Homology of gyrB sequences (%)
100
Fig. 4-1-3. Relationship between homology of gyrB sequences and rate of matched
biomarkers for P. putida strains.
-165-
さらに、各リボソームサブユニットタンパク質ごとに、アミノ酸配列の保存性の違いを
調べた。Fig. 4-1-4 に、各バイオマーカータンパク質について、測定に用いた 16 株の試験
菌株のうち、観測質量が一致した菌株の割合を示す。リボソームサブユニットタンパク質
の種類の違いによって、アミノ酸配列が保存（観測質量が一致）されている菌株の割合は、
13～100%と大きく異なっている。43 種類のバイオマーカータンパク質のうち、L22、L29、
L36、および S10 は、全ての試験菌株（16 株）で一致した。これら保存性が高いリボソー
ムサブユニットタンパク質は、70S リボソーム粒子中でそれぞれ重要な役割を担っている。
すなわち、L22 と L29 は、L23 (75%)および L24 (69%)と共に、50S リボソームサブユニッ
ト中で、生合成されたポリペプチド鎖の出口となるトンネルを構成している[35]。L36 は、
23S rRNA の高次構造を形成する重要な役割を担っている[36]。S10 は、tRNA がリボソー
ムへ結合する際の結合部位である[37]。さらに、一致率が高かった他のバイオマーカータン
パク質では、L14 (94%)、L15 (75%)、および L19 (75%)は 30S リボソームサブユニットと
の境界面に分布して、ブリッジを構成している[35, 38]。これに対し、10 種類のリボソーム
サブユニットタンパク質（L1、L25、L31、S3、S5、S6、S9、S13、S14、および S16）
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
L1
L25
L31
L21
L20
L30
L16
L13
L11
L17
L15
L24
L28
L6
L5
L18
L19
L23
L33
L35
L34
L14
L22
L29
L36
Matched strains (%)
(a)
Protein name
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
S3
S5
S16
S14
S9
S13
S6
S18
S15
S7
S19
S17
S12
S21
S11
S20
S8
S10
Matched strains (%)
(b)
Protein name
Fig. 4-1-4. Distribution of the percentage of the matched strains for each biomarker.
(a) Large subunit proteins, and (b) small subunit proteins.
-166-
は、半分以下の試験菌株でしかピークの一致が認められず、同種内であってもアミノ酸配
列の保存性が低いことが示された。これらは、70S リボソームの構成要素ではあるが、機能
にはあまり関与していないために、変異を許容しやすいのではないかと考えられる。
さらに、リボソームサブユニットタンパク質の保存性の違いを調べるために、各リボソ
ームサブユニットタンパク質のアミノ酸配列の相同性解析を行った。一例として、P. putida
KT2440 の L29 と L31 のアミノ酸配列の類似性を比較した相同性解析の結果を示す。この
2 種類のサブユニットタンパク質は、
同程度の数のアミノ酸残基から構成されているが（L29
は 63 残基、L31 は 71 残基）、これらバイオマーカータンパク質と一致した菌株の割合は大
幅に異なる（L29 は 100%、L31 は 43%）。Table 4-1-3 に、P. putida KT2440 の L29 と同
じアミノ酸配列を有する菌株の名称と、これら菌株の L31 のアミノ酸配列の相同性(%)を示
す。P. putida KT2440 の L29 のアミノ酸配列は、他の P. putida（F1 株および GB-1 株）
だけではなく、P. entomophila、P. fluorescens、および P. syringae など同じであり、種を
またがって高度に保存されていることが分かった。しかしながら、L31 の場合は、同じア
ミノ酸配列を有しているのは同種異株の P. putida F1 のみであり、他の菌株では相同性が
低く、特に P. syringae では相同性は 69%しかなかった。このように、L31 のアミノ酸配列
は、同種内であっても大きく変異する。同様に、他のリボソームサブユニットタンパク質
でも、種～株レベルでのアミノ酸配列の保存性の度合いは異なっていた。これらの結果は、
リボソームサブユニットタンパク質の種類によって、分子進化の速度が大きく異なってい
ることを示している。
Table 4-1-3. Bacteria strains having the same amino acid sequence for L29 of P.
putida KT2440 and identities (%) of amino acid sequences of L31.
Identities (%)
Strain names
L29 (Length=63)
L31 (Length=71)
P. putida F1
100
100
P. putida GB-1
100
98
P. entomophila L48
100
92
P. putida W619
100
88
P. fluorescens PfO-1
100
84
P. fluorescens Pf-5
100
70
P. syringae pv. tomato str. DC3000
100
69
P. syringae pv. phaseolicola 1448A
100
69
P. syringae pv. syringae B728a
100
69
-167-
そこで、この分子進化速度の違いに基づく分類を行うために、KT2440 株のリボソームサ
ブユニットタンパク質の中から選択した 43 種類のバイオマーカータンパク質の質量と各菌
株のマススペクトル上のピーク質量が一致したものを 1、一致しなかったものを 0 として、
バイナリ(1/0)形式のプロファイルを作成し、Table 4-1-4 にまとめた。次に、このプロファ
イルをクラスター解析した。クラスター解析のアルゴリズムにはさまざまな種類があるが、
汎用される UPGMA 法、ウォード(Ward)法、単連結(single-linkage)法、および完全結合
(complete-linkage)法のいずれでも、同様の分類結果が得られることを確認した。そこで本
研究では、分子進化の速度は時間のみが支配するという「分子時計仮説」が成立する場合
に採用できる UPGMA 法を用いて作成したデンドログラムを用いることにした。
Fig. 4-1-5 に、gyrB の DNA 塩基配列解析に基づくデンドログラム（これは、分子系統樹
である）(a)と、MALDI-MS によるリボソームタンパク質のプロファイルに基づくデンドロ
グラム(b)を示す。gyrB の DNA 塩基配列解析に基づく系統樹(Fig. 4-1-5a)では、試験菌 16
株が、KT2440 株および biover A を含むクラスターI と、biover B を含むクラスターII の 2
つの主要なクラスターに分けられ、これらをさらに 6 つのグループに分類できた。興味深
いことに、リボソームタンパク質のプロファイルに基づく方法でも、ほぼ同じ分類結果が
得られた(Fig. 4-1-5b)。この結果は、MALDI-MS によるリボソームサブユニットタンパク
質のプロファイルに基づく手法でも、P. putida の分子系統分類が達成されており、Fig.
4-1-5b のデンドログラムも、分子系統樹であることを支持している。
さらに、主要な 2 つのクラスターが、gyrB 塩基配列の系統解析法では 90%程度の高い類
似度でしか分けられていないのに対し、本法では、25%以下という非常に低い類似度ではっ
きりと分けられている。さらに、6 つのグループは gyrB の DNA 塩基配列解析では 97%程
度のかなり高い類似度でかろうじて分類されているのに対し、本法では 85%程度で明確に
分類することができた。以上の結果は、本法の分類感度が、gyrB 塩基配列の系統解析法よ
りも高いことを示している。さらに、gyrB 塩基配列の系統解析法では識別が困難であった
グループ I-1 内の菌株は、本法では明確に識別されている。Table 4-1-4 のプロファイルを
見ると、L25、S3、および S5 のアミノ酸配列の変異が、KT2440 株および ATCC 23973
-168-
Table 4-1-4. Binary biomarker matching table of P. putida strains.
Group I-1
L1
KT
2440
1
ATCC
23973
1
JCM
6156
1
MBIC
5315
1
NBRC
101019
0
NBRC
100986
0
NBRC
100988
1
Group
I-2
MBIC
3930
0
Group
I-3
NBRC
14671
0
L5
1
1
1
1
1
1
1
0
1
L6
1
1
1
1
1
1
1
0
1
L11
1
1
1
1
1
1
1
0
1
L13
1
1
1
1
1
1
1
0
1
L14
1
1
1
1
1
1
1
0
1
L15
1
1
1
1
1
1
1
0
1
L16
1
1
1
1
1
1
1
0
0
L17
1
1
1
1
1
1
1
0
1
L18
1
1
1
1
1
1
1
1
1
L19
1
1
1
1
1
1
1
1
1
L20
1
1
1
1
1
1
1
1
1
L21
1
1
1
1
1
1
1
0
1
L22
1
1
1
1
1
1
1
1
1
L23
1
1
1
1
1
1
1
1
1
L24
1
1
1
1
1
1
1
0
1
L25
1
1
0
0
0
0
0
0
0
L28
1
1
1
1
1
1
1
0
1
L29
1
1
1
1
1
1
1
1
1
L30
1
1
1
1
1
1
1
1
1
L31
1
1
1
1
1
1
1
0
0
L33
1
1
1
1
1
1
1
1
1
L34
1
1
1
1
1
1
1
1
1
L35
1
1
1
1
1
1
1
1
1
L36
1
1
1
1
1
1
1
1
1
S3
1
1
0
0
0
1
0
0
0
S5
1
0
0
1
1
1
0
0
1
S6
1
1
1
0
0
0
0
0
1
S7
1
1
1
1
1
1
1
0
1
S8
1
1
1
1
1
1
1
1
1
S9
1
1
1
1
1
1
1
0
0
S10
1
1
1
1
1
1
1
1
1
S11
1
1
1
1
1
1
1
0
1
S12
1
1
1
1
1
0
1
0
1
S13
1
1
1
0
0
0
0
0
1
S14
1
1
1
1
1
1
1
0
0
S15
1
1
1
1
1
1
1
1
0
S16
1
1
1
1
1
1
1
0
0
S17
1
1
1
1
1
1
1
1
1
S18
1
1
1
0
0
1
0
0
1
S19
1
1
1
1
1
0
0
1
0
S20
1
1
1
1
1
1
1
1
1
S21
1
1
1
1
1
1
1
0
1
in numbers
43
42
40
38
37
37
36
17
33
in %
100
98
93
88
86
86
84
40
77
Matched
biomarkers
-169-
Table 4-1-4. Continued.
Group I-4
Group II-1
Group II-2
Matched strains
JCM
6158
JCM
13061
NBRC
14164T
NBRC
3738
ATCC
17484
ATCC
17522
NCIMB
9816
in
numbers
L1
0
0
0
0
0
0
0
5
31
L5
1
1
1
0
0
0
0
11
69
L6
1
1
1
0
0
0
0
11
69
L11
1
1
1
0
0
0
0
11
69
L13
1
1
1
0
0
0
0
11
69
L14
1
1
1
1
1
1
1
15
94
L15
1
1
1
0
0
0
0
11
69
L16
1
1
1
0
0
0
0
10
63
L17
1
1
1
0
0
0
0
11
69
L18
1
1
1
0
0
0
0
12
75
L19
1
1
1
0
0
0
0
12
75
L20
0
0
0
0
0
0
0
9
56
L21
0
0
0
0
0
0
0
8
50
L22
1
1
1
1
1
1
1
16
100
L23
1
1
1
0
0
0
0
12
75
L24
1
1
1
0
0
0
0
11
69
L25
0
0
0
0
0
0
0
2
13
L28
1
1
1
0
0
0
0
11
69
L29
1
1
1
1
1
1
1
16
100
L30
0
0
0
1
0
0
0
10
63
L31
0
0
0
0
0
0
0
7
44
L33
1
1
1
0
0
0
0
12
75
L34
1
1
1
0
0
0
0
12
75
L35
1
1
1
0
0
0
0
12
75
L36
1
1
1
1
1
1
1
16
100
S3
0
0
0
0
0
0
0
3
19
S5
0
0
0
0
0
0
0
5
31
S6
1
1
1
0
0
0
0
7
44
S7
0
0
0
0
0
0
0
8
50
S8
1
1
1
0
0
0
0
12
75
S9
0
0
0
0
0
0
0
7
44
S10
1
1
1
1
1
1
1
16
100
S11
1
1
1
0
0
0
0
11
69
S12
1
1
1
0
0
0
0
10
63
S13
1
1
1
0
0
0
0
7
44
S14
0
0
0
0
0
0
0
7
44
S15
0
0
0
0
0
0
0
8
50
S16
0
0
0
0
0
0
0
7
44
S17
0
0
0
0
0
0
0
9
56
S18
1
1
1
0
0
0
0
8
50
S19
1
1
1
0
0
0
0
9
56
S20
1
1
1
0
0
0
0
12
75
S21
1
1
1
0
0
0
0
11
69
Matched
biomarkers
in
numbers
in %
29
29
29
6
5
5
5
67
67
67
14
12
12
12
-170-
in %
KT2440
ATCC 23973
JCM 6156
(a)
MBIC 5315
NBRC 101019
NBRC 100986
NBRC 100988
I-1
MBIC 3930
NBRC 14671
I-2
JCM 6158 (biover A)
JCM 13061 (biover A)
NBRC 14164T (biover A)
Cluster I
I-3
I-4
NBRC 3738
ATCC 17484 (biover B)
II-1
ATCC 17522 (biover B)
II-2
Cluster II
NCIMB 9816
E. coli K-12
85
(b)
90
95
Similarity (%)
100
KT2440
ATCC 23973
JCM 6156
MBIC 5315
I-1
NBRC 101019
NBRC 100988
NBRC 100986
NBRC 14671
Cluster I
I-3
JCM 6158 (biover A)
JCM 13061 (biover A)
NBRC 14164T (biover A)
MBIC 3930
I-2
NBRC 3738
II-1
ATCC 17484 (biover B)
ATCC 17522 (biover B)
NCIMB 9816
II-2
I-4
Cluster II
30 40 50 60 70 80 90 100
Similarity (%)
Fig. 4-1-5. Phylogenetic trees of P. putida strains based on gyrB sequences (872 bp) (a)
and ribosomal protein matching profiling by MALDI-MS (b).
株を JCM 6156 株と識別する指標となっていることがわかる。また、NBRC 101019 株、
NBRC 1900986 株、および NBRC 100988 株の識別には、6 種類のバイオマーカータンパ
ク質（L1, S3, S5, S12, S18, および S19）が決め手となっている。一方、グループ I-4 と
II-2 を構成する菌株については、本法では識別できなかった。本来、gyrB の塩基配列解析
-171-
では、PCR 増幅やシーケンシングの誤りなどの影響を完全には排除することができないた
め、菌株間のわずかな違いに対する分類結果の信頼性は高くない。したがって、本法でグ
ループ I-4 および II-2 内の菌株を識別できなかったことは、それほど大きな問題ではない
と考えられる。
本研究で提案した MALDI-MS によるリボソームサブユニットタンパク質のプロファイ
ルに基づく系統分類法には、従来の手法と比較して著しく大きな利点がある。まず、リボ
ソームタンパク質はあらゆるバクテリアの細胞に多量に存在するため、P. putida 以外のバ
クテリアの系統分類にも原理的には適用可能である。しかも、MALDI-MS では、リボソー
ムタンパク質を精製せずに、菌体破砕液あるいは菌体懸濁液からでも主要ピークとして観
測することができる[15, 16]。MALDI-MS は、試料調製が極めて簡便で、多検体の連続分
析が可能であるため、自動分析システムが確立すれば、数十検体でも 30 分以内で解析結果
を得ることが可能であると考えられる。しかも、一般的な遺伝子解析法に基づくバクテリ
アの分類手法が 1 種類あるいは数種類程度の遺伝子を解析対象としているのに対して、本
法では異なる進化速度を有する数十ものハウスキーピングタンパク質群を解析対象として
いるため、従来の遺伝子解析法よりも正確なバクテリアの進化系統が解析されている可能
性もある。すなわち、本法は、迅速簡便である上に、従来以上に正確な分子系統解析が言
える。
本法の基本的な概念は、P. putida の株レベルでの分子系統分類によって実証されたが、
さらに信頼性の高い手法となるためには、最低限必要なバイオマーカーの数と、そのリボ
ソームサブユニットタンパク質の種類を検証すると共に、クラスター解析のアルゴリズム
などのデータ解析法をさらに研究する必要がある。この研究がさらに展開すれば、この手
法は、バクテリアの株レベルでの系統分類法として、DNA 塩基配列解析法と共に、実用的
かつ有望な手法になり得るものと期待される。
-172-
文献
[1]
Olson, M. V.: J. Chromatogr. 1989, 470, 377.
[2]
Bingen, E.; Barc, M. C.; Brahimi, N.; Vilmer, E.; Beaufils, F.: J. Clin. Microbiol. 1995,
33, 1657.
[3]
Keim, P.; Kalif, A.; Schupp, J.; Hill, K.; Travis, S. E.; Richmond, K.; Adair, D. M.;
HughJones, M.; Kuske, C. R.; Jackson, P.: J. Bacteriol. 1997, 179, 818.
[4]
Savelkoul, P. H. M.; Aarts, H. J. M.; de Haas, J.; Dijkshoorn, L.; Duim, B.; Otsen, M.;
Rademaker, J. L. W.; Schouls, L.; Lenstra, J. A.: J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 3083.
[5]
Vaneechoutte, M.: Mol. Biotechnol. 1996, 6, 115.
[6]
Yamamoto, S.; Harayama, S.: Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61, 1104.
[7]
Yamamoto, S.; Harayama, S.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1998, 48, 813.
[8]
Lonetto, M.; Gribskov, M.; Gross, C. A.: J. Bacteriol. 1992, 174, 3843.
[9]
Liu, H. S.; Li, Y.; Huang, X. X.; Kawamura, Y.; Ezaki, T.: Microbiol. Immunol. 2003,
47, 859.
[10]
Urwin, R.; Maiden, M. C. J.: Trends Microbiol. 2003, 11, 479.
[11]
Smith, J. M.; Dowson, C. G.; Spratt, B. G.: Nature 1991, 349, 29.
[12]
Smith, J. M.; Smith, N. H.; Orourke, M.; Spratt, B. G.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1993, 90, 4384.
[13]
Maiden, M. C. J.; Bygraves, J. A.; Feil, E.; Morelli, G.; Russell, J. E.; Urwin, R.;
Zhang, Q.; Zhou, J. J.; Zurth, K.; Caugant, D. A.; Feavers, I. M.; Achtman, M.; Spratt,
B. G.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 3140.
[14]
木村凡: モダンメディア 2006, 52, 209.
[15]
Sun, L.; Teramoto, K.; Sato, H.; Torimura, M.; Tao, H.; Shintani, T.: Rapid Commun.
Mass Spectrom. 2006, 20, 3789.
[16]
Teramoto, K.; Sato, H.; Sun, L.; Torimura, M.; Tao, H.: J. Proteome Res. 2007, 6,
3899.
[17]
寺本華奈江; 佐藤浩昭; 孫麗偉; 鳥村政基; 田尾博明: J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 2007,
55, 209.
[18]
Sato, H.; Shibata, A.; Wang, Y.; Yoshikawa, H.; Tamura, H.: Polym. Degrad. Stab.
-173-
2001, 74, 69.
[19]
Nishio, E.; Ichiki, Y.; Tamura, H.; Morita, S.; Watanabe, K.; Yoshikawa, H.: Biosci.,
Biotechnol., Biochem. 2002, 66, 1792.
[20]
佐藤浩昭: 日本農薬学会誌 2002, 27, 81.
[21]
Sato, H.; Shibata, A.; Wang, Y.; Yoshikawa, H.; Tamura, H.: Biomacromolecules 2003,
4, 46.
[22]
佐藤浩昭; 柴田敦司; 吉川博道; 田村廣人: J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 2003, 51, 415.
[23]
http://www.mbio.jp/icb/.
[24]
Nelson, K. E.; Weinel, C.; Paulsen, I. T.; Dodson, R. J.; Hilbert, H.; dos Santos, V.;
Fouts, D. E.; Gill, S. R.; Pop, M.; Holmes, M.; Brinkac, L.; Beanan, M.; DeBoy, R. T.;
Daugherty, S.; Kolonay, J.; Madupu, R.; Nelson, W.; White, O.; Peterson, J.; Khouri,
H.; Hance, I.; Lee, P. C.; Holtzapple, E.; Scanlan, D.; Tran, K.; Moazzez, A.;
Utterback, T.; Rizzo, M.; Lee, K.; Kosack, D.; Moestl, D.; Wedler, H.; Lauber, J.;
Stjepandic, D.; Hoheisel, J.; Straetz, M.; Heim, S.; Kiewitz, C.; Eisen, J.; Timmis, K.
N.; Dusterhoft, A.; Tummler, B.; Fraser, C. M.: Environ. Microbiol. 2002, 4, 799.
[25]
Stanier, R. Y.; Palleroni, N. J.; Doudoroff, M.: J. Gen. Microbiol. 1966, 43, 159.
[26]
Kumar, S.; Tamura, K.; Nei, M.: Briefings in Bioinformatics 2004, 5, 150.
[27]
Sherman, F.; Stewart, J. W.; Tsunasawa, S.: Bioessays 1985, 3, 27.
[28]
Moerschell, R. P.; Hosokawa, Y.; Tsunasawa, S.; Sherman, F.: J. Biol. Chem. 1990,
265, 19638.
[29]
Arnold, R. J.; Reilly, J. P.: Anal. Biochem. 1999, 269, 105.
[30]
Arnold, R. J.; Polevoda, B.; Reilly, J. P.; Sherman, F.: J. Biol. Chem. 1999, 274, 37035.
[31]
Suh, M. J.; Hamburg, D. M.; Gregory, S. T.; Dahlberg, A. E.; Limbach, P. A.:
Proteomics 2005, 5, 4818.
[32]
Strader, M. B.; VerBerkmoes, N. C.; Tabb, D. L.; Connelly, H. M.; Barton, J. W.;
Bruce, B. D.; Pelletier, D. A.; Davison, B. H.; Hettich, R. L.; Larimer, F. W.; Hurst, G.
B.: J. Proteome Res. 2004, 3, 965.
[33]
Running, W. E.; Ravipaty, S.; Karty, J. A.; Reilly, J. P.: J. Proteome Res. 2007, 6, 337.
[34]
Rohl, R.; Nierhaus, K. H.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, 79, 729.
-174-
[35]
Gao, H. X.; Sengupta, J.; Valle, M.; Korostelev, A.; Eswar, N.; Stagg, S. M.; Van Roey,
P.; Agrawal, R. K.; Harvey, S. C.; Sali, A.; Chapman, M. S.; Frank, J.: Cell 2003, 113,
789.
[36]
Maeder, C.; Draper, D. E.: J. Mol. Biol. 2005, 354, 436.
[37]
Nomura, M.; Held, W. A.: Ribosomes; Nomura, M.; Cold Spring Harbor Laboratory
Press: NY, 1974, pp 193 (Recpnstitution of ribosomes: Studies of ribosome structure,
function and assembly).
[38]
Maisnier-Patin, S.; Paulander, W.; Pennhag, A.; Andersson, D. I.: J. Mol. Biol. 2007,
366, 207.
-175-
4-2
4-2-1
低温増殖性乳酸菌の迅速同定および分子系統分類への応用
緒言
発酵ソーセージなどの発酵食肉製品は、一般的に、スターターカルチャーが増殖しやす
い 20～37 ℃前後で食肉を発酵させることによって製造されている[1]。しかし、この温度
領域は、スターターカルチャーだけではなく、他の有害バクテリアが繁殖しやすい温度で
もある。そこで、安全な発酵食肉食品を製造するために、5 ℃程度の低温でも増殖できる
乳酸菌をスターターカルチャーとして利用する発酵食品の研究開発が行われている[1, 2]。
様々な乳酸菌の中で、特に Lactobacillus (Lb.) sakei が低温増殖性乳酸菌として利用できる
のではないかと期待されており、食肉の低温発酵を促進するための種菌（スターターカル
チャー）として日本国内で唯一市販されている乳酸菌も、Lb. sakei ではないかと考えられ
ている[1]。発酵食品を開発する研究では、低温で増殖可能なバクテリアを単離培養し、そ
れらの中から優れた菌株を選抜するとともに、各菌株の生化学的および遺伝学的な特性を
明らかにすることが重要である。そのためには、単離されたバクテリアの同定と、株レベ
ルでの識別を迅速簡便に行うスクリーニング法の開発が求められている。
乳酸菌を簡易同定するために、一般的にグラム染色、形態観察、グルコースから生成し
た乳酸の旋光性試験などが行われている[3, 4]。また、現在では 16S rRNA 遺伝子の DNA
塩基配列解析が、属や種の位置づけには非常に有効な手法として一般的に行われるように
なっている[5]。乳酸菌を種レベルよりもさらに下位階層の株レベルで簡易に識別するため
に、糖類発酵性試験やリトマスミルク試験などの生化学的試験が主に行われている[6]。し
かし、一般的に生化学試験は、培養条件や菌株の状態の影響を強く受けやすく、しかも試
験結果の判定が測定者に依存しがちであるため、再現性に乏しい。以上のように、現状で
は日常的な作業として迅速かつ正確にバクテリアを株レベルで識別・分類できる手法は、
確立されているとは言い難い。
本研究では、低温増殖性乳酸菌の迅速簡便なスクリーニング法の開発を行うための基礎
-176-
検討として、Lb. sakei と考えられ、日本国内で唯一市販されている食肉用低温発酵乳酸菌
スターターカルチャー[1]、および低温の食肉中でも増殖能を有する類縁の 15 種類の単離菌
株について、リボソームタンパク質をバイオマーカーとした MALDI-MS によるバクテリア
種の同定を行い、さらに前節 4-1 で開発した株レベルでの分子系統分類法[7]の適用を試み
た。
4-2-2
(1)
実験
試料菌株
試料には、サンエイ糖化より提供された、低温下の食肉中で良好な増殖性と抗菌性を示
す市販の乳酸菌スターターD-1001 株[1]と、生化学的な特性が D-1001 株と類似している
5 ℃で増殖可能な 15 種類の単離菌株（PCT-1～15 株、いずれも清酒醸造工程より単離）を
使用した。これらの菌株は、第 2 章で述べた方法により、乳酸菌の培養に適した MRS 液体
培地を用いて 30℃で 18 時間培養した。これら 16 菌株の簡易同定試験は、乳酸菌実験マニ
ュアル[3]に従った。乳酸旋光性試験は、大塚らの方法[4]に準じて行った。さらに、16S rRNA
遺伝子の部分塩基配列約 500bp をテクノスルガ・ラボに依頼して解読した。
培養した各菌株は、第 2 章で述べた方法と同一の操作により、菌体破砕液を調製し、
MALDI-MS 測定を行った。MALDI マススペクトルに基づく分子系統解析は、前節 4-1 と
同様に、BioNumerics ソフトウェア(ver. 3.5, Applied Maths)を用い、非加重結合法
(UPGMA)法によるクラスター解析によってデンドログラムを作成した。
4-2-3
(1)
結果および考察
簡易同定試験
本研究で使用した 16 菌株が、スターターとして用いることができる乳酸菌であるかどう
かどうかを調べるために、生化学的な簡易同定試験を行った。Table 4-2-1 に、生化学的な
簡易同定試験の結果をまとめて示す。本研究で解析した 16 菌株は、全て通性嫌気性のグラ
ム陽性桿菌で、長さ約 2 μm で単独もしくは短連鎖を形成し、運動性を有さず、芽胞を形成
-177-
Table 4-2-1. Characters of psychrotrophic bacteria samples
D-1001 PCT-1 PCT-2 PCT-3 PCT-4
Cell form
Rod
Rod
Rod
Rod
Rod
Cell size (mm)
1.8-2.5 1.8-2.5 1.8-2.5 1.8-2.5 1.8-2.5
Gram staining
+
+
+
+
+
Mobtility
Catalase reaction
Optical form
DL
DL
DL
DL
DL
Glucose
+
+
+
+
+
Continued
Cell form
Cell size (mm)
Gram staining
Mobtility
Catalase reaction
Optical form
Glucose
PCT-8
Rod
1.8-2.5
+
DL
+
PCT-5
Rod
1.8-2.5
+
DL
+
PCT-6
Rod
1.8-2.5
+
L
+
PCT-7
Rod
1.8-2.5
+
DL
+
PCT-9 PCT-10 PCT-11 PCT-12 PCT-13 PCT-14 PCT-15
Rod
Rod
Rod
Rod
Rod
Rod
Rod
1.8-2.5 1.8-2.5 1.8-2.5 1.8-2.5 1.8-2.5 1.8-2.5 1.8-2.5
+
+
+
+
+
+
+
DL
L
L
L
L
DL
DL
+
+
+
+
+
+
+
せず、グルコースから多量の乳酸を生成し、カタラーゼ陰性であることから、少なくとも
Lactobacillus 属の乳酸菌であると判断された。
(2)
市販スターターカルチャーD-1001 株のキャラクタリゼーション
本研究で用いた市販の食肉発酵用スターターカルチャーD-1001 株は、簡易同定試験の結
果から Lb. sakei である可能性が高いと報告されている[1]。さらに、本研究で 16S rRNA
遺伝子の部分塩基配列(560 bp)を解読し、相同性解析を行った結果、解読できた塩基配列は
ゲノム解読株 Lb. sakei 23K と完全に一致したことから、D-1001 株は Lb. sakei であると
考えられた。
次に、リボソームタンパク質をバイオマーカーとする MALDI-MS を用いた同定法が、簡
易同定試験[1]および 16S rRNA 遺伝子の相同性解析による同定結果を支持するかどうか検
証を試みた。同定の基準となるゲノム解読株 Lb. sakei 23K [8]の各リボソームサブユニッ
トタンパク質の翻訳アミノ酸配列を、Swiss-Prot タンパク質データベースより入手し、N
末端メチオニン残基の切断を考慮し、さらに MALDI マススペクトル上で観測されること
が想定されるプロトン化分子([M + H]+)としての計算質量を求めた。そして、各計算質量を、
D-1001 株の菌体破砕液を実際に MALDI-MS により測定して観測されたピークの質量と比
-178-
較して、各観測ピークを帰属した。Fig. 4-2-1 に D-1001 株の菌体破砕液の MALDI マスス
ペクトルと各ピークの帰属結果を示す。また、Table 4-2-2 に、D-1001 株で帰属されたリボ
ソームサブユニットタンパク質について、ゲノム解読株(Lb. sakei 23K)のアクセッション
番号、計算質量、平均観測質量、誤差、N 末端側の 2 番目のアミノ酸残基、および N 末端
メチオニン切断の有無をまとめて示す。その結果、D-1001 株では 33 種類のリボソームサ
ブユニットタンパク質の質量が、ゲノム解読株 Lb. sakei 23K のものと一致した。
すでに第 3 章で、ゲノム解読された乳酸菌の精製リボソームタンパク質画分を
MALDI-MS を用いて解析し、発現タンパク質の観測質量に基づいて、およそ 40 種類のリ
ボソームサブユニットタンパク質が帰属されること[9-12]を述べた。アミノ酸配列の変異が
菌株の違いである程度起こりうることを考慮すると、33 種類ものリボソームサブユニット
タンパク質の観測質量がゲノム解読株 Lb. sakei 23K のものと一致した結果は、D-1001 株
が Lb. sakei あるいはそれと遺伝学的に極めて近縁の乳酸菌であることを示している。しか
も、相同性解析を行った結果、いずれのリボソームサブユニットタンパク質についても、
アミノ酸配列が完全に一致する他の菌株のデータは登録されていなかった。この結果は、
生化学的な簡易同定試験[1]および 16S rRNA 遺伝子の塩基配列の相同性解析により Lb.
sakei であると考えられた結果を支持している。
(3)
単離菌株の分類
D-1001 株と生化学的な特性が類似していることを基準として単離された 15 菌株につい
ても、同様に MALDI-MS により測定した結果、少なくとも 20 本以上のピークの m/z 値が
ゲノム解読株 Lb. sakei 23K のものと一致した。そのため、これらすべての試験菌株が Lb.
sakei あるいはそれに極めて近縁の乳酸菌であると判断された。しかしながら、観測質量と
計算質量が一致したリボソームサブユニットタンパク質の種類および数は、菌株によって
若干異なっており、株レベルで多様性があることが示唆された。
そこで、これらの菌株について、前節 4-1 で開発した手法[7]を応用して、リボソームサ
-179-
L32
5500
6000
6500
8000
L24
10000
L15
S8
S12
S9
L20
S6
L14
S11
L18
S13
L22
L21
S10
L23
S16
X2
11000
12000
13000
14000
15000
16000
22000
24000
m/z
26000
28000
30000
32000
0 mV
16000
18000
L5
S7
L6
1 mV
9000
7500
L13
0 mV
8000
7000
S15
S19
10 mV
5000
L31
4500
S18S20
0 mV
4000
L35
L30L28
S21
L29
L34
L36
30 mV
20000
Fig. 4-2-1 MALDI mass spectrum and peak assignments of cell lysate of D-1001
strain. The mass spectrum is duplicated into three sets. The labels indicate the
name of ribosomal subunit proteins.
-180-
Table 4-2-2 Assigned ribosomal subunit proteins for the cell lysate of D-1001 strain.
Protein
name a
Accession
number b
Calculated mass
as molecule as [M + H]+
Observed
mass
Error
in Da
in ppm
2nd
residue
Met.
loss
Large subunit proteins
L5
Q38US4
20067.3
20068.3
20069.2
0.9
45
A
Yes
Q38US6
19347.2
19348.2
19349.5
1.4
70
P
Yes
L6
Q38UV4
16442.9
16443.9
16443.2
-0.7
-42
V
Yes
L13
L14
Q38US2
13020.1
13021.1
13020.3
-0.8
-62
A
Yes
L15
Q38UT0
15608.0
15609.0
15609.9
0.9
55
T
Yes
Q38US7
12975.9
12976.9
12977.7
0.8
63
K
L18
L20
Q38VT4
13569.0
13570.0
13570.0
-0.1
-5
T
Yes
L21
Q38XV5
11249.0
11250.0
11250.0
0.0
3
L
Q38UR7
12498.5
12499.5
12499.0
-0.5
-39
K
L22
Q38UR4
10843.6
10844.6
10844.3
-0.3
-24
A
Yes
L23
Q38US3
11033.8
11034.8
11034.7
-0.1
-6
E
L24
L28
Q38XS9
6755.0
6756.0
6755.8
-0.2
-28
S
Yes
Q38US0
7656.9
7657.9
7658.3
0.5
61
A
Yes
L29
L30
Q38US9
6768.0
6769.0
6769.5
0.5
69
A
Yes
Q38V50
9827.9
9828.9
9829.2
0.3
28
K
L31
L32
Q38WU0
6724.7
6725.7
6725.7
0.0
1
T
Yes
L34
Q38UE3
5390.5
5391.5
5391.4
-0.1
-13
G
Yes
L35
Q38VT3
7623.9
7624.9
7624.6
-0.4
-48
S
Yes
L36
Q38UT4
4387.4
4388.4
4388.2
-0.3
-57
A
Yes
Small subunit proteins
Q38ZR8
11150.5
11151.5
11151.4
0.0
-2
F
S6
S7
Q38UQ8
17845.5
17846.5
17848.0
1.5
83
A
Yes
S8
Q38US5
14741.1
14742.1
14742.4
0.3
20
G
Yes
Q38UV5
14140.4
14141.4
14140.8
-0.5
-39
K
S9
Q38UR1
11564.5
11565.5
11565.5
0.0
-3
A
Yes
S10
Q38UT6
13663.6
13664.6
13665.4
0.8
57
P
Yes
S11
S12
Q38UQ7
15004.4
15005.4
15005.9
0.5
31
S
Yes
Q38UT5
13301.4
13302.4
13302.3
-0.2
-12
R
S13
S15
Q38WR4
10273.6
10274.6
10274.6
-0.1
-7
S
Yes
Q38XR0
10584.3
10585.3
10585.4
0.1
6
Y
S16
S18
Q38ZR6
9152.7
9153.7
9153.3
-0.3
-37
I
Q38UR6
10411.9
10412.9
10411.4
-1.5
-142
P
Yes
S19
Q38WR3
8997.5
8998.5
8998.6
0.1
9
R
S20
S21
Q38XA7
6788.9
6789.9
6790.0
0.1
19
K
a
The subunit proteins denoted by bold type is used as biomarker for identification and classification of psychrorophic
lactic acid bacteria. b Accession numbers for Lb. sakei 23K.
ブユニットタンパク質の変異を指標とした分類を試みた。前節では 43 種類ものバイオマー
カータンパク質を選択したが、実用分析としての応用を考えると、3-3 節で述べたように、
菌体破砕液であっても高強度でピークが観測できる 20000 Da 以下の成分をバイオマーカ
ーとすることが好ましい。本研究では、D-1001 株の菌体破砕液を直接 MALDI-MS により
-181-
測定し、m/z 5000-20000 の範囲で観測されるリボソームサブユニットタンパク質の中から、
比較的高強度で他のピークと重複していない 16 種類をバイオマーカーとして選択した。
Table 4-2-3 にバイオマーカーとして選択した 16 種類のリボソームタンパク質の名称と、
それらのアミノ酸配列の相同性が Lb. sakei 23K の次に高いバクテリア種の名称およびア
ミノ酸配列の相同性を示す。これらのバイオマーカータンパク質について、アミノ酸配列
の相同性解析を行い、いずれも 100%の相同性を示す菌株は Lb. sakei 23K のみであること
を確認した。Table 4-2-3 に示した 16 種類のバイオマーカータンパク質の翻訳アミノ酸配
列と相同性が 2 番目に高いものは、Lactobacillus 属、Pediococcus 属、および Enterococcus
属の 3 属 6 種にわたっており、相同性にも幅があった(64-96%)。このような相同性解析の
結果は、アミノ酸配列の保存性がリボソームサブユニットタンパク質の種類の違いによっ
Table 4-2-3. Selected biomarkers for classification of Lb. sakei strains and the bacteria
name having 2nd homology of their amino acid sequences.
Ribosomal
Bacteria name having 2nd homology
Homology (%)
protein name
L6
Lactobacillus casei ATCC 334
79
L13
Pediococcus pentosaceus ATCC 25745
79
L18
Lactobacillus casei ATCC 334
80
L22
Lactobacillus casei ATCC 334
82
L23
Lactobacillus reuteri F275
78
L24
Pediococcus pentosaceus ATCC 25745
75
L29
Lactobacillus casei ATCC 334
87
L31
Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118
87
S6
Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118
71
S9
Lactobacillus casei ATCC 334
83
S10
Lactobacillus brevis ATCC 367
96
S11
Enterococcus faecium DO
85
S13
Lactobacillus brevis ATCC 367
83
S16
Lactobacillus casei ATCC 334
84
S19
Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118
87
S20
Lactobacillus reuteri 100-23 and F275
64
-182-
て異なっていることを示している。これらのバイオマーカータンパク質を用いて Lb. sakei
と考えられる 16 菌株の株レベルでの分類を試みた。
Table 4-2-4 に、本研究に用いた 16 菌株について、16 種類のバイオマーカータンパク質
と 150 ppm 以内で一致する m/z 値に観測されるピークの有無をまとめて示す。ここで、バ
イオマーカータンパク質とピークが一致したものを 1、ピークシフトが観測されたものを 0
で表記した。ピーク一致の有無を比較すると、12 種類のバイオマーカータンパク質（L6、
L13、L18、L22、L23、L24、L29、L31、S10、S11、S16、および S19）は 16 菌株全て
で一致している。
Table 4-2-4. Binary biomarker matching table of Lb. sakei strains.
Biomarkers D-1001 PCT-1
PCT-2
PCT-3
PCT-4
PCT-5
PCT-6
L6
1
1
1
1
1
1
1
L13
1
1
1
1
1
1
1
L18
1
1
1
1
1
1
1
L22
1
1
1
1
1
1
1
L23
1
1
1
1
1
1
1
L24
1
1
1
1
1
1
1
L29
1
1
1
1
1
1
1
L31
1
1
1
1
1
1
1
S6
1
1
1
1
1
1
1
S9
1
1
1
1
1
1
1
S10
1
1
1
1
1
1
1
S11
1
1
1
1
1
1
1
S13
1
1
1
1
1
1
1
S16
1
1
1
1
1
1
1
S19
1
1
1
1
1
1
1
S20
1
1
1
1
1
1
1
Continued
Biomarkers
PCT-8
PCT-9 PCT-10 PCT-11 PCT-12 PCT-13 PCT-14
L6
1
1
1
1
1
1
1
L13
1
1
1
1
1
1
1
L18
1
1
1
1
1
1
1
L22
1
1
1
1
1
1
1
L23
1
1
1
1
1
1
1
L24
1
1
1
1
1
1
1
L29
1
1
1
1
1
1
1
L31
1
1
1
1
1
1
1
S6
1
0 b)
0 b)
0 b)
0 b)
1
1
S9
1
1
1
0 c)
0 c)
0 c)
1
S10
1
1
1
1
1
1
1
S11
1
1
1
1
1
1
1
S13
0 a)
0 a)
1
1
1
1
0 a)
S16
1
1
1
1
1
1
1
S19
1
1
1
1
1
1
1
S20
1
1
1
1
1
1
0 d)
Mass difference between biomarker peak was about 14 a), 69 b), 14 c), and 16 d).
-183-
PCT-7
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0 a)
1
1
1
PCT-15
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0 a)
1
1
0 d)
Table 4-2-3 に示すように、他のバクテリアでは、これらのバイオマーカータンパク質と同
一のアミノ酸配列を有するものは報告されておらず、この結果は、本研究に用いた 16 菌株
が全て Lb. sakei あるいは極めて近縁の乳酸菌であることを裏付けている。一方、S6、S9、
S13、および S20 は、一部の菌株でアミノ酸配列の変異に基づくと考えられるピークシフト
が観測された。さらに、これらのうち S6 と S20 は、アミノ酸配列の保存性が特に低いサブ
ユニットタンパク質であった（最も相同性が高いもので 71%および 64%）。ピークシフトが
観測された例として、D-1001 株、PCT-7 株、および PCT-15 株の S20 および S13 付近の
マススペクトルを Fig. 4-2-2 に、D-1001 株、PCT-11 株、および PCT-13 株の S6 および
S9 付近のマススペクトルを Fig. 4-2-3 に、それぞれ拡大して示す。興味深いことに、シフ
トしたピークの m/z 値は菌株が異なっていても共通していた。例えば、S13（Fig. 4-2-2 の
右図）では、PCT-7 株および PCT-15 株はいずれも m/z 13302 付近から m/z 13316 付近へ、
約 16 Da のピークシフトが観測されている。同様に、S9（Fig. 4-2-3 の右図）では、PCT-11
株および PCT-13 株はいずれも m/z 14141 付近から m/z 14155 付近へ、約 14 Da のピーク
シフトが観測されている。全ての試験菌株について調べたところ、S6 は 69 Da、S9 および
S13 は 14 Da、および S20 は 16 Da のピークシフトが、共通して起こることが分かった
（Table 4-2-4 参照）。この結果は、リボソームサブユニットタンパク質におけるアミノ酸残
基の変異は任意に起こるのではなく、リボソームの機能を損なわない限定された変異のみ
が起こり得ることを示唆している。
次に、各菌株間で一致したバイオマーカーを比較すると、Lb. sakei D1001 および PCT-1
～6 は、全てのバイオマーカーが一致している。それ以外の 8 菌株(PCT-7～15)では、上記
4 種類のバイオマーカー（S6、S9、S13、および S20）が 6 通りの組み合わせで異なってい
る。そこで、このようなプロファイルをクラスター解析により処理すれば、デンドログラ
ムを作成することができる。
本研究では、クラスター解析でよく用いられる UPGMA 法、完全連結(complete-linkage)
法およびウォード(Ward)法により、Table 4-2-4 に示したバイナリ形式のデータを処理して
デンドログラムを作成した。その結果、いずれの方法でも同様のグループが形成された。
-184-
S18
S20
8998.6
9153.2
(a)
13302.5
L14
9185.8
(d)
13019.8
12976.7
9153.3
(b)
S13
L18 12976.7
(e)
9186.9
8998.7
13316.9
13020.4
(c)
9014.9
9154.0
12977.0
(f)
9186.8
13316.3
13020.3
8950
9000
9050
9100
m/z
9150
9200 9250
12900
13000
13100 13200
m/z
13300 13400
Fig. 4-2-2 Partial MALDI mass spectra of the cell lysate around S20 (left) and S13
(right) of Lb. sakei D-1001 (a) and (d), PCT-7 (b) and (e), and PCT-15 (c) and (f).
L24
(a)
S10
S6
11034.9
S9
S11
11151.1
14140.6
(d)
11566.4
13665.3
(b)
11035.4
11221.1
11151.1
(c)
11565.9
(e)
11565.9
14154.8
14154.9
(f)
13665.6
11035.8
11000
13665.1
11200
11400
11600
m/z
13600
13800
14000
m/z
14200
14400
Fig. 4-2-3 Partial MALDI mass spectra of the cell lysate around S6 (left) and S9
(right) of Lb. sakei D-1001 (a) and (d), PCT-11 (b) and (e), and PCT-13 (c) and (f).
本研究でバイオマーカーとして用いたリボソームタンパク質は、典型的なハウスキーピン
グタンパク質であり、その変異は生物の進化系統を反映していると考えられている。その
ため、ここでは進化系統を反映した有根系統樹を作成する場合に一般的に用いられる
UPGMA 法を用いて得られたデンドログラムを Fig. 4-2-4 に示す。本研究に用いた Lb. sakei
-185-
と考えられる 16 菌株は、96%の類似性を境界とすると、4 つのグループに分類することが
できた。Fig. 4-2-4 のデンドログラムで Lb. sakei D-1001 と最も遠い関係に分類されたグル
ープ 4 の PCT-15 株について、16S rRNA 遺伝子の部分塩基配列 560 bp の解析を行ったと
ころ、その塩基配列は D-1001 株のものと完全に一致した。この結果は、PCT-15 株も Lb.
sakei であることを支持しており、しかも 16S rRNA 遺伝子の部分塩基配列解析では Lb.
sakei の株レベルでの分類は極めて困難であることを示している。すなわち、リボソームタ
ンパク質を指標とする MALDI-MS によるバクテリア分析法は、遺伝学的な根拠に基づく種
の同定のみならず株レベルでの分類結果を迅速に与えるため、食品開発の現場などで優れ
た有用バクテリアのスクリーニングに有効な実用分析法になり得るものと考えられる。
100
98
96
94
Similarity (%)
D-1001
PCT-1
PCT-2
PCT-3
PCT-4
PCT-5
PCT-6
PCT-7
PCT-8
PCT-9
PCT-10
PCT-11
PCT-12
PCT-13
PCT-14
PCT-15
Group 1
Group 2
Group 3
Group 4
Fig. 4-2-4. Dendrogram of Lb. sakei strains based on the ribosomal protein profiling
by MALDI-MS.
-186-
文献
[1]
加藤丈雄; 土井梅幸; 米山由紀子; 杉本勝之; 中村良: 日本食品工業学会誌 1994, 41,
108.
[2]
芳賀聖一: ミートジャーナル 1999, 36, 107.
[3]
内村泰; 岡田早苗: 乳酸菌実験マニュアル; 朝倉書店: 東京, 1992.
[4]
大塚正盛; 岡田早苗; 内村泰; 駒形和男: 生物工学会誌 1994, 72, 81.
[5]
河村好章: 感染症学雑誌 2001, 75, 1003.
[6]
柳田藤寿: 乳酸菌の科学と技術; 乳酸菌研究集談会編; 学会出版センター: 東京, 1996,
pp. 16-24 (I-4. 分離・培養・保存・同定法).
[7]
Teramoto, K.; Sato, H.; Sun, L.; Torimura, M.; Tao, H.; Yoshikawa, H.; Hotta, Y.;
Hosoda, A.; Tamura, H.: Anal. Chem. 2007, 79, 8712.
[8]
Chaillou, S.; Champomier-Verges, M. C.; Cornet, M.; Crutz-Le Coq, A. M.; Dudez, A.
M.; Martin, V.; Beaufils, S.; Darbon-Rongere, E.; Bossy, R.; Loux, V.; Zagorec, M.: Nat.
Biotechnol. 2005, 23, 1527.
[9]
Sun, L. W.; Teramoto, K.; Sato, H.; Torimura, M.; Tao, H.; Shintani, T.: Rapid
Commun. Mass Spectrom. 2006, 20, 3789.
[10]
寺本華奈江; 佐藤浩昭; 孫麗偉; 鳥村政基; 田尾博明: 分析化学 2006, 55, 987.
[11]
Teramoto, K.; Sato, H.; Sun, L.; Torimura, M.; Tao, H.: J. Proteome Res. 2007, 6,
3899.
[12]
寺本華奈江; 佐藤浩昭; 孫麗偉; 鳥村政基; 田尾博明: J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 2007,
55, 209.
-187-
-188-
第
5
章
まとめ
-189-
5-1
まとめ
本研究では、リボソームタンパク質をバイオマーカーとした MALDI-MS によるバクテリ
アの迅速同定が可能であることを実証し、さらにアミノ酸配列の変異に注目することによ
って、DNA 塩基配列解析を行わずに株レベルでの分子系統分類まで達成できる、迅速簡便
性と高い信頼性を兼ね備えた新しいバクテリアの分析手法を開発した。ここでは、本論文
のまとめとして、本研究で得られた成果を以下に総括して、本手法のこれまでの到達点と
今後の展望を述べる。
第 1 章は序論であり、バクテリア分析の必要性と、現在用いられている分類・同定技術
を概説し、次にバクテリア種の迅速な分析法として期待されてきた質量分析法の特徴を述
べ、そのなかでもリボソームタンパク質をバイオマーカーとして用いる MALDI-MS による
バクテリアの迅速同定の可能性と諸課題を指摘し、最後に本研究の目的を述べた。
第 2 章では、本研究に用いた MALDI-MS の測定原理と、リボソームタンパク質の分析条
件の最適化について述べた。特に、リボソームタンパク質の MALDI-MS の測定技術で鍵と
なる、マトリックス剤の選定と試料結晶の調製方法について最適化を行った。
第 3 章では、ゲノム解読された乳酸菌をモデルバクテリアとして用いた MALDI-MS によ
る発現リボソームタンパク質のキャラクタリゼーションについて論じており、本章は 5 つ
の研究内容から構成されている。
3.1 節では、ゲノム解読された乳酸菌 Lactobacillus plantarum NCIMB 8826 をモデルと
して、プロテオーム解析の手法により、各リボソームサブユニットタンパク質の発現を検
証し、タンパク質データベース上の翻訳アミノ酸配列情報が概ね正確であることを確認し
た。3.2 節では、同種で複数のゲノム解読株を用い、マススペクトルおよび翻訳アミノ酸配
列情報を比較しながら、タンパク質データベースの登録情報をさらに詳細に検証して誤り
を修正すると共に、アミノ酸配列に変異が起こるリボソームサブユニットタンパク質を明
らかにする手法を提案した。これらの研究過程で、リボソームタンパク質を精製せずに、
菌体破砕液からリボソームサブユニットタンパク質のピークを明確に観測できることを明
-190-
らかにし、極めて簡便な測定法を提案すると共に、現在主流のボトムアッププロテオーム
解析に一石を投じた。さらに、3.3 節では、ゲノム解読された 8 種類の乳酸菌の菌体破砕液
を MALDI-MS で測定し、ピークが帰属されたリボソームサブユニットタンパク質の種類を
比較して、信頼性が高い分析結果が得られるバイオマーカーを選択する指針を提案した。
本章の後半は応用に関するものであり、3.4 節では、実際に研究室で保存している乳酸菌
試料のコンタミネーションを判定し、本法が保存菌株の管理に応用できることを述べた。
また、3.5 節では、清酒の汚染源として知られる乳酸菌の一種である「火落ち菌」の迅速同
定を試みた。火落ち菌は、リボソームタンパク質の翻訳アミノ酸配列情報が公開されてい
ないため、基準となる菌株の精製リボソームタンパク質の質量を実測してまとめたデータ
ベースを作成し、これを利用して実際に清酒醸造所で発生した火落ち菌を同定した。
第 4 章では、バクテリアの株レベルでの分子系統分類法を開発した研究内容を述べた。
これは、リボソームサブユニットタンパク質のアミノ酸配列には、菌株の違いによりある
程度の割合で変異が生じており、それをマススペクトル上のピークシフトとして明確に検
出できることを実証した第 3 章の研究成果を発展させたもので、2 つの研究を行った。
4.1 節では、株レベルでの多様性が豊富である典型的な土壌微生物 Pseudomonas putida
16 菌株をモデルとして、遺伝子の分子進化速度の違いにより分類する「分子系統分類」を
行った。ここでは、リボソームサブユニットタンパク質の遺伝子の変異により生じるアミ
ノ酸配列の変異をマススペクトルのピークシフトの有無で判定して表にまとめ、クラスタ
ー解析により樹形図を作成して、各菌株の分類を行った。この分類結果が、従来の遺伝子
解析法に基づく分子系統分類の結果と極めてよく一致することを確認し、DNA 塩基配列解
析を行わずに、MALDI-MS で株レベルでの分子系統分類が達成できることを実証した。4.2
節では、この手法を、低温増殖性乳酸菌の迅速同定および株レベルでの分類に適用し、本
法が有用微生物のスクリーニングに対して有効な手法になり得ることを述べた。
以上のように、本法は特定の遺伝子の DNA 塩基配列解析に基づく従来の分子系統分類を
超え得る解像度を有しながら、迅速性と簡便性を兼ね備えた優れた手法であり、様々な分
野への応用展開が期待できる。そこで最後に、本手法が一般的なバクテリアの分類・同定
-191-
手法として普及するために必要な今後の検討項目についてまとめ、本手法の今後の発展を
展望する。
(1) 確実にバイオマーカーピークを観測するための手法開発
バクテリアを分類・同定する際に、理想的にはリボソームサブユニットタンパク質を全
てバイオマーカーとして用いることが望ましい。しかし、現状では MALDI マススペクト
ル上に全てのリボソームサブユニットタンパク質が観測されるわけではない。マトリック
ス剤との混合結晶の調製法により観測されるピークの本数は異なり、さらに精製工程で損
失するものや精製を行わない菌体破砕液ではイオン化が阻害されたり、高質量になる程ピ
ーク強度が低下する傾向があった。そのため、再現性良く確実に多くのリボソームサブユ
ニットタンパク質を観測できる試料調製法の確立が求められる。リボソームタンパク質は、
rRNA 分子や各リボソームサブユニットタンパク質、さらにはリボソームの機能発現に関連
する様々なタンパク質と相互作用しながら比較的強い結合を形成しているため、一般的な
タンパク質分析ではあまり考慮されない異種分子間相互作用を十分に理解しながら、イオ
ン化効率の良いマトリックス剤の開発や試料スポット調製法の最適化をさらに進める必要
がある。
(2) 発現リボソームタンパク質のキャラクタリゼーションの推進
本研究の遂行によって、タンパク質データベース上の翻訳アミノ酸配列情報が想像以上
に誤っていることが明らかになった。これはバクテリアの分類・同定に限らず、タンパク
質データベースを利用するバイオインフォマティックス分野全般に関わる問題でもある。
本論文の第 3 章において、翻訳アミノ酸配列情報の修正を行ったが、これはタンパク質デ
ータベースに登録されている情報のうち、ごく一部について解析したに過ぎない。本論文
で示した指針に基づき、タンパク質データベース上の翻訳アミノ酸配列情報の検証を進め
ると共に、翻訳後修飾の詳細な解析を行い体系化することにより、発現タンパク質の情報
を反映したタンパク質データベースの構築が進むものと考えられる。
-192-
(3) 基準株のリボソームタンパク質のデータベース化
分子系統分類で基準となるのは、その種を代表する基準株(type strain)である。しかし、
本法では、ゲノム解読株の翻訳アミノ酸配列情報を利用してバクテリア菌株を分類・同定
するため、あくまでも本法で得られる解析結果の基準はゲノム解読株となる。分子系統学
的な観点から、本法の解析結果の信頼性をより向上させるためには、基準株のリボソーム
タンパク質をデータベース化する必要があろう。現状では、ゲノム解読プロジェクトの対
象として基準株が選択されることはそれほど多くないため、基準株を保有する微生物寄託
機関を中心に、バクテリアを取り扱う研究機関などと連携することにより、リボソームタ
ンパク質の遺伝子解析、アミノ酸配列情報、および発現タンパク質の観測質量情報が関連
付けられた基準株のデータベースを構築していくことが望まれる。
(4) 分子系統分類への発展
現在の分子系統分類では、16S rRNA 遺伝子の塩基配列が 98%以上一致する場合は同種
と見なしてよいと考えられている。これに対して、本法を用いた場合、どの程度の割合で
リボソームサブユニットタンパク質の質量が基準株のものと一致すれば同種と判断できる
のか、その判断基準を明らかにすることができれば、本法は、16S rRNA 遺伝子の塩基配列
を利用した手法に匹敵するバクテリアの同定法にまで発展できるであろう。そのためには、
16S rRNA 遺伝子の塩基配列に基づいて分類された既知バクテリアに対して、本法を網羅的
に適用することにより、従来の系統分類法による分類結果と本手法の分類結果の関係が明
確になると考えられる。また、リボソームサブユニットタンパク質は、それぞれ異なる進
化速度をもっている。そこで、それぞれのリボソームサブユニットタンパク質のアミノ酸
配列が属あるいは種レベルでどの程度保存されているのか明らかにすることによって、分
類・同定の目的に応じたバイオマーカータンパク質を解析対象にすることができると考え
られる。
-193-
(5) バクテリアの迅速分類・同定手法システムの開発
本手法が一般的なバクテリア分析の現場で広く利用されるようになるためには、バクテ
リア試料の前処理、MALDI-MS 測定、およびデータ解析までの一連の操作をシステム化す
る必要があると考えられる。バクテリア試料の前処理については、MALDI-MS によるリボ
ソームタンパク質の測定を前提とした小スケールかつ迅速簡便な前処理法と、多検体試料
や有害なバクテリアを扱うことを想定した、クリーンベンチなど閉鎖系におけるオンライ
ンの前処理法の開発が望まれる。また、現在市販されている MALDI-MS は、本法では使用
しないリフレクターモードや MS/MS など、様々な分析対象物に適用できる機能が搭載され
ており、バクテリア分析の観点からは過剰な装置構成でかつ高価格であるため、質量分析
を専門としないバクテリア分析の現場には導入しにくい。本法を普及させるためには、こ
のような過剰な機能を排除し、バクテリア分析に特化した小型で操作が簡易かつ低価格な
装置の開発が必要であろう。さらに、マススペクトルを測定者が逐一解析しなくても、バ
イオマーカータンパク質のピーク検出を自動的に行い、さらに分子系統分類的なデータ処
理を行う、バクテリア分析に特化した解析ソフトウェアを開発する必要があろう。これら
一連の工程を全自動で行うシステムの開発により、本手法が日常的に多種多様のバクテリ
アを分類・同定する現場に導入され、バクテリアの迅速かつ信頼性の解析手段として広く
普及するものと考えられる。
本研究では、バクテリアの主成分を MALDI-MS で測定して間接的にゲノム情報を用いて
解析することにより、それらの分類・同定を行った。しかし、生物の細胞に普遍的に存在
するリボソームタンパク質をバイオマーカーとして用いる本手法の適用範囲は、バクテリ
アに限定されるものではなく、アーキアや真菌類など、微生物全般に広く適用できるはず
である。上述したような諸課題を逐次解決することにより、本手法は実用的で汎用性があ
る微生物の迅速分類・同定法としてさらに大きく発展し、微生物の分子系統分類、院内感
染菌や食中毒菌の分類、環境評価、有用菌株のスクリーニングなど、微生物を取り扱う様々
な現場でのニーズを満たす手法として、大きく貢献することが期待される。
-194-
本論文に関わる発表論文
本論文中の所在
1． “Characterization of ribosomal proteins as biomarkers for
MALDI mass spectral identification of Lactobacillus plantarum”
L. Sun, K. Teramoto, H. Sato, M. Torimura, H. Tao, T. Shintani.
Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2006, 20,
第3章1節
3789-3798.
2.
“A Simple Intact Protein Analysis for Characterization of
Ribosomal Proteins of Two Genome-Sequenced Lactic Acid
Bacteria and Verification of their Amino Acid Sequences”
K. Teramoto, H. Sato, L. Sun, M. Torimura, H. Tao.
Journal of Proteome Research, 2007, 6, 3899-3907.
3.
第3章2節
“マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法による乳酸
菌ゲノム解読株のリボソームタンパク質の比較解析”
寺本華奈江,孫麗偉,佐藤浩昭,鳥村政基,田尾博明,新谷智吉.
Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan, 2008, 56, 第 3 章 3 節
1-11.
4.
“マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法を用いた微生物の
迅速識別法の微生物管理への応用”
寺本華奈江, 佐藤浩昭, 孫 麗偉, 鳥村政基, 田尾博明．
分析化学, 2006, 55, 987-992.
5.
第3章4節
“マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法による火落
ち菌の迅速同定”
孫 麗偉, 寺本華奈江, 佐藤浩昭, 孫 麗偉, 鳥村政基, 田尾博明．
分析化学, 2007, 56, 1071-1079.
6.
第3章5節
“Phylogenetic Classification of Pseudomonas putida strains by
MALDI-MS Using Ribosomal Subunit Proteins as Biomarkers”
K. Teramoto, H. Sato, L. Sun, M. Torimura, H. Tao, H. Yoshikawa, Y.
Hotta, A. Hosoda, H. Tamura.
Analytical Chemistry, 2007, 79, 8712-8719.
-195-
第4章1節
7.
“マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法による低温増
殖性乳酸菌の迅速同定及び分類”
寺本華奈江,佐藤浩昭,孫 麗偉,鳥村政基,田尾博明, 和栗伸伍, 林利
哉, 芳賀聖一.
分析化学, 2007, 56, 1063-1070.
第4章2節
参考論文
8.
“リボソームタンパク質をバイオマーカーとした MALDI-MS による
バクテリアの迅速分類同定”
寺本華奈江,佐藤浩昭,孫麗偉,鳥村政基,田尾博明．
Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan, 2007, 55,
209-216. 【解説】
9.
“食肉の色調に及ぼす乳酸菌接種の効果”
寺本華奈江，朱政治，林利哉，芳賀聖一.
New Food Industry, 2002, 44, 25-32.
10.
“ミオグロビン誘導体形成に対する乳酸発酵の影響”
寺本華奈江，芳賀聖一．
名城大農学報, 2001, 37, 129-134.
11.
“赤色色素 タンパク質ミオグロビンのニトロソ化に及ぼす乳酸菌接種
の影響”
芳賀聖一，寺本華奈江，佐藤浩昭，吉川宏，森田英利，坂田亮一．
名城大学農学ハイテクリサーチセンター第 1 回研究成果報告書, 2001,
251-259.
特許
12.
細胞の迅速識別方法及び識別装置
特許公開 2007-316063
13.
物質担持多孔質シリカ
WO2005/026048
-196-
共同研究者一覧
（五十音順）
佐藤
浩昭
（独）産業技術総合研究所環境管理技術研究部門
新谷
智吉
愛媛県工業技術センター
孫
麗偉
（独）産業技術総合研究所環境管理技術研究部門
田尾
博明
（独）産業技術総合研究所環境管理技術研究部門
田村
廣人
名城大学農学部
鳥村
政基
（独）産業技術総合研究所環境管理技術研究部門
芳賀
聖一
名城大学農学部
林
利哉
名城大学農学部
細田
晃文
名城大学農学部
堀田
雄大
名城大学農学部
吉川
博道
福岡工業大学工学部
和栗
伸伍
名城大学農学部
-197-
-198-
謝辞
本研究をまとめるにあたり、懇切な御指導と御鞭撻を賜りました名古屋工業大学大学院物
質工学専攻の大谷肇教授に心から感謝いたします。また、本論文の作成にあたり、有益な御
助言と御支援を賜りました名古屋工業大学大学院物質工学専攻の神取秀樹教授、湯地昭夫教
授、ならびに北川慎也准教授に深く感謝いたします。
本研究は、独立行政法人産業技術総合研究所および財団法人日本産業技術振興協会の専
門技術者育成事業の一環として行われました。本研究の機会を与えて下さり、常に親身の
御指導と御鞭撻を賜りました、産業技術総合研究所環境管理技術研究部門の原田晃部門長、
指導責任者の田尾博明副部門長、直接指導者の佐藤浩昭主任研究員、日本産業技術振興協
会の佐村秀夫専務理事をはじめ、関係者各位に深く感謝します。
また、本研究の遂行に共同研究者として数多くの御助言と御支援を賜りました、産業技
術総合研究所環境管理技術研究部門の鳥村政基主任研究員、孫麗偉博士、愛媛県工業技術
センターの新谷智吉主任研究員、名城大学農学部応用生物化学科の芳賀聖一教授、林利哉
准教授、和栗伸伍氏、生物環境科学科の田村廣人教授、細田晃文助教、堀田雄大氏、なら
びに福岡工業大学工学部生命環境科学科の吉川博道教授、市来弥生氏に厚く御礼申し上げ
ます。
本研究の遂行と本論文をまとめるにあたり、産業技術総合研究所ゲノムファクトリー研
究部門の鎌形洋一部門長、北川航研究員、生物機能工学研究部門の花田智主任研究員をは
じめ、多くの方々から貴重な御助言を賜りました。また、本研究を行う間、産業技術総合
研究所環境管理技術研究部門計測技術研究グループの皆様には、多くの御支援を賜りまし
た。さらに、本論文を完成するにあたり、現所属の日本電子株式会社の皆様にも御支援を
頂きました。最後に、御助言ならびに御支援を賜りました全ての皆様に、心から感謝の意
を表します。
2008 年 3 月
- 199 -

宅配専用買取申込書

H23年度期末試験解説

アフリカ水田における木製柵渠の導入にあたっての耐久性評価の試み(2)

リスク判定遺伝子検査申込同意書付属説明書

アルミニウム合金のろう付について教えてください？

サイエンスライブ in 天理

マンモスがやってくる？ - エアープランツ・バイオ

動物との語句

永続的発展の条件