マグロ属魚類の魚種判別マニュアル（PDF:239KB）

技術情報
マグロ属魚類の魚種判別マニュアル
平成 17 年 4 月 27 日
(平成 18 年 12 月 14 日一部修正）
独立行政法人
農林水産消費技術センター
独立行政法人
水産総合研究センター
目次
i)
はじめに・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１
ii)
検査における一般事項・・・・・・・・・・・・・・・１
iii) 試薬の管理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２
iv) 安全性に関する情報・・・・・・・・・・・・・・・・２
１
試料の購入、台帳等の整理
１．１
はじめに・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３
１．２
試料の購入・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３
１．３
試料に関する情報の管理・・・・・・・・・・・・・・３
１．４
試料の分析・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・４
１．５
試料の保存及び廃棄・・・・・・・・・・・・・・・・４
１．６
結果の報告・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・４
検査台帳記入要領・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５
検査野帳記入要領・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６
２
PCR-RFLP 法を用いたマグロ属魚類の魚種判別
２．１
判別の概要・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・７
２．２
出典・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・７
２．３
適用範囲・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・７
２．４
装置・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・７
２．５
試薬・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・８
２．６
操作・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・８
２．７
魚種の判別・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１１
２．８
判別の確かさに関する情報・・・・・・・・・・・・１１
２．９
記録・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１２
２． 10
謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１２
２． 11
参考文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１２
表１
プライマー対・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１４
表２
必要な PCR チューブの本数・・・・・・・・・・・・１４
表３
PCR 溶液の組成・・・・・・・・・・・・・・・・・・１４
表４
PCR の温度サイクル・・・・・・・・・・・・・・・・１４
表５
必要な制限酵素処理用チューブの本数・・・・・・・・１５
表６
制限酵素処理の反応液組成・・・・・・・・・・・・・１５
表７
制限酵素処理後の RFLP パターン・・・・・・・・・・１６
表８
塩基配列解析試料内訳及び魚種内変異率・・・・・・・１７
図１
制限酵素処理後の標準 DNA 溶液の電気泳動写真・・・１８
図２
マグロ５種７タイプにおける L8562 − H9432
プライマー対用いた PCR 産物の DNA シークエンス・・１９
i)
はじめに
本マニュアルは、独立行政法人農林水産消費技術センターと独立行政法人水産総合研究センターが
共同で、マグロ属魚類の生鮮食品に関する表示が正しく行われているかどうかを推定するための検査
方法についてまとめたものである。
マグロ属魚類の生鮮食品は、「農林物資の規格化及び品質表示の適正化に関する法律（ JAS 法）」
（昭和 25 年 5 月 11 日法律第 175 号）における生鮮食品品質表示基準（平成１２年３月３１日農林水
産省告示第５１４号）及び水産物品質表示基準（平成１２年３月３１日農林水産省告示第５１６号）
に基づき、平成１２年７月１日から品質表示の義務化が行われている。表示に当たっては販売業者等
が「名称」、「原産地」、「冷凍したものを解凍したものである場合にはその旨」及び「養殖された
ものである場合にはその旨」を社会的に検証（確認）した上で記載することとされている。
このたび、マグロ類の「名称」及び「原産地」の表示を科学的に判別する技術として、独立行政法
人水産総合研究センター遠洋水産研究所で開発された技術を基に、同センター中央水産研究所と独立
行政法人農林水産消費技術センターが共同で検査できる形にマニュアル化した。
マグロ属魚類は、クロマグロ( Thunnus thynnus)，ミナミマグロ(T. maccoyii)，メバチ(T. obsus)，キ
ハダ(T. albacares)，ビンナガ(T. alalunga)，コシナガ(T. tongglos)，タイセイヨウマグロ(T. atlantics)
の７種が知られている。近年の分子生物学的研究から、大西洋に生息するクロマグロと太平洋に生息
するクロマグロは、別種もしくは亜種であることが指摘されている。また、メバチについても、αタ
イプとβタイプが存在することが報告されており、大西洋では二種類のタイプがみられるがインド洋
および太平洋ではβタイプがほとんどである。
生鮮食品の流通量ではコシナガとタイセイヨウマグロはごくわずかであり、残りの５種が大部分を
占める。部位や品質の違いにより価格差が非常に大きく、日本では、一般的にクロマグロとミナミマ
グロが最も高価な種であり、次いでメバチ、キハダ、ビンナガの順と言われている。しかしながら、
切り身冷凍ブロック肉等の形態で販売される場合、その魚種を目視で判別することは容易ではなく、
「名称」および「原産地」に関する表示が適正であるかどうかをを確認することは非常に困難である。
そのため、マグロ属の５種（太平洋産および大西洋産クロマグロ、ミナミマグロ、αタイプ及びβタ
イプのメバチ、キハダおよびビンナガ）の判別は、 PCR-RFLP ( Polymerase Chain Reaction - Restriction
Fragment Polymorphism)法及び塩基配列決定法により行う。
本マニュアルに記載したミトコンドリア DNA の魚種特異的な配列を分析し魚種を特定することに
より、「名称」及び「原産地」に関する表示の適正性を推定することが可能となる。
ii)
検査における一般事項
PCR では、微量の鋳型 DNA であっても増幅されるので目的外の DNA（特に PCR 産物）の混入を
防ぐとともに、試料の酵素的分解を防ぐため、人間の皮膚表面等から分泌されている DNase の混入
を防止しなければならない。「 JAS 分析試験ハンドブック
遺伝子組換え食品・検査分析マニュアル
コンタミネーション防止編」を参照し、適切な措置を講じる。特に必要な配慮を次に示す。
（１）溶液類は、熱に不安定なものを除いて、オートクレーブ滅菌を行う。純水は、電気伝導率
0.0056 mS/m (25 ℃ )以下になるように脱イオン化されたものを用い、滅菌水は、純水を 121 ℃、 15 分
以上オートクレーブで処理したものを用いる。
（２）チップやチューブ類は必ず使い捨てとし、洗ったものを再使用しない。
（３）マイクロピペットのチップ類、その他ピペット類及び 1.5 mL と 0.2 mL 等のチューブは、滅菌
缶に入れオートクレーブ滅菌をし、その後、乾燥器に入れ完全に乾かしてから用いる。あるいは、可
能なものについては乾熱滅菌を行う。
（４） DNA を操作するときは、必要に応じてクリーンベンチを使用するとともに、実験台上をエタ
ノールで消毒し、必ずゴム手袋をはめ、作業中も頻繁にエタノールで消毒すること。ゴム手袋はパウ
-1-
ダーなしのものを用いるか、パウダーを洗い落としてから使用する。
（５）滅菌水や TE 緩衝液に DNase が混入すると被害が広がるので、この２つの溶液は実験者ごとに
別々に作製し、頻繁に（少なくとも月に一回程度）作り直す。
iii)
試薬の管理
遺伝子関連の実験では、強力な変異原性物質等を用いる場合もあるので、試薬や廃液の管理をしっ
かり行う必要がある。「試薬管理マニュアル」及び「 JAS 分析試験ハンドブック
・検査分析マニュアル
iv）
遺伝子組換え食品
試薬調製編」を参照し適切な管理を行うこと。
安全性に関する情報
※エチジウムブロミドについて
ゲル電気泳動に使用する。 2 本鎖 DNA の鎖の間に入り込む蛍光試薬であり、強力な変異原性があ
る。取り扱いには必ずゴム手袋をはめ、粉末の計量にはマスクを着用すること。廃液は、エチジウム
ブロミド処理用の器具が市販されているので、それを利用する。高濃度の場合は、処理に出すこと。
※トランスイルミネータについて
紫外線を発生し、特に目に対して有害である。照射時間を最小にし、防護眼鏡又は同等品を着用す
ること。
-2-
１
試料の購入、台帳等の整理
１．１
はじめに
ここにはマグロ属の魚種判別のために用いる試料の取り扱いとして、試料の購入から廃棄までの手
順を示してある。市販品検査に関連する事項については、それぞれ業務実施要領等も参照すること。
１．２
試料の購入
試料は、原則として１商品につき１点購入し、１点につき１回分析する（注１．１）（注１．２）
こととし、以下の項目に留意して購入する。
①検査スケジュールに従い、適当な試料を購入する。
②検査する品目のサンプリング法に従い必要な数量を確保し、できるだけ消費期限等の日付が同
一のものを購入する。
③試料は、購入後、冷凍、冷蔵で又は室温で速やかに運搬し、 -20 ℃で保管する。
１．３
試料に関する情報の整理（検査台帳等の記入）
試料を購入後、検査台帳、検査野帳及び試料に必要事項を記入する。記入に際しては、ボールペン
又はインクを用いる。
（１）試料について、必要事項を検査台帳に記入する。
①検査番号
②担当者
③名称
④原産地
⑤内容量
⑥賞味期限等
⑦保存方法
⑧販売業者等
⑨解凍に関する表示
⑩購入年月日
⑪購入価格
⑫店舗名
⑬備考（「養殖」・「畜養」等の表示）
（２）検査野帳に必要事項を記入する。
①検査番号
②検査者名
③検査開始日
④検査終了日
⑤名称
⑥サンプリング量
⑦抽出 DNA 量
⑧制限酵素処理後のゲル電気泳動写真貼付
⑨魚種の判別結果
⑩備考
（３）試料に検査番号等を明示する。
試料に、検査番号、検査対象を明示したラベルを付ける。試料が小さい場合や分割されている場合
は、ビニール袋等の容器に入れ、それにラベルを付ける。各試料には検査番号を明示する。
-3-
①検査番号
②検査対象
１．４
試料の分析
試料は、購入後速やかに分析に着手する。
その際、検査野帳等に必要事項をもれなく記入する。
１．５
試料の保存及び廃棄
試料は、サンプリング操作にはいるまで、 -20 ℃以下で凍結保存する。（注１．３）
サンプリング後の試料は、ビニール袋等に入れ、最低でも再分析可能な量を、原則として四半期報
告が終了するまで、 -20 ℃以下で凍結保存する。また、抽出 DNA 溶液についても同様に保存する。
なお、表示内容と検査結果の間で矛盾があるものについては全ての事務処理が終了するまで保存す
る。
上記保存期限を過ぎた場合には、速やかに廃棄すること。
試料の包材は、検査番号を明示して翌々年の４月１日まで保存する。
１．６
結果の報告
分析が終了した場合、検査台帳等に結果等必要事項を記入する。同時に、業務実施要領等の定めに
従い報告を行う。
（注１．１）１商品につき１点購入とは、市販品検査における数であり、各事業所での品質管理等に
転用するべきではない。母集団を考慮し、適切な数量を選択することが望ましい。
（注１．２）切断等により複数の個体が混合された可能性のある試料は、基本的に購入しない。この
ような試料を検査する場合、分析時にサンプリングした個体についてのみの判別となることに留意す
る。
（注１．３）１日程度であれば冷蔵保存でもよい。
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検査台帳記入要領
検査台帳の記入に当たっては、以下に記す項目及び内容に沿って行う。
①検査番号
購入順に定められた番号を記入する。
②担当者
検査の担当者名を記入する。
③名称
商品に表示されている魚種名を記入する。
④原産地
商品に表示されている原産地を記入する。
⑤内容量
商品に表示されている内容量を記入する。
⑥賞味期限等
商品に表示されている賞味期限等を西暦で記入する。
⑦保存方法
商品に表示されている保存方法を記入する。
⑧販売業者等
商品に表示されている販売業者等を記入する。
⑨解凍に関する表示
解凍に関する表示の有無を記入する。
⑩購入年月日
西暦で記入する。
⑪購入価格
消費税を含んだ価格を記入する。
提供品の場合は０円と記入する。
⑫店舗名
購入を行った店舗名を記入する。
⑬備考
「養殖」・「蓄養」等の、その他の情報を記入する。
-5-
検査野帳記入要領
検査野帳の記入に当たっては以下に記す項目及び内容に沿って行う。
①検査番号
検査台帳に登録された番号を記入する。
②検査者名
検査に当たった者の名を記入する。
③検査開始日
検査を開始した日を記入する。
④検査終了日
検査の終了した日を記入する。
⑤名称
商品に表示されている内容を記入する。
⑥サンプリング量
DNA の抽出に使用した量をｍｇ単位で記入する。
⑦ PCR 後のゲル電気泳動写真貼付
PCR 産物の電気泳動写真を貼り付ける。
⑧ PCR-RFLP における PCR 産物の制限酵素処理後のゲル電気泳動写真貼付
⑦の泳動写真（制限酵素処理前）と対応よく整理しておく。
⑨魚種の判別結果
RFLP パターンから判別した魚種を記入する。
魚種が判別できなかった場合、「魚種判別不能」と記載する。
⑩備考
分析上、気がついた点等を記入する。
-6-
２
PCR-RFLP 法を用いたマグロ属魚類の魚種判別
２．１
判別の概要
まず、マグロ試料からシリカスピンカラムを使用した方法により DNA 溶液を抽出する。すなわち、
試料を Proteinase K を含んだ抽出緩衝液中で溶解し、 RNase A 処理を行う。その後、 DNA を高塩濃度
緩衝液中でシリカゲルに吸着させ、洗浄後、低濃度緩衝液を用いて溶出する。その後、抽出した
DNA 溶液を鋳型として PCR-RFLP 法によりマグロ属の魚種判別を行う。 PCR はマグロのミトコンド
リア DNA( ATPase 6 遺伝子領域の一部から cytochrome c oxidase subunit III ( COIII)遺伝子領域の一部に
跨る領域： ATCO)に特異的なプライマーを用いて行い、得られた PCR 産物を制限酵素で処理し、断
片長パターンの違いによりマグロの魚種を判別する。
具体的には、抽出した DNA を用い、 L8562 及び H9432 プライマー対を用いた PCR 産物を制限酵素
Alu I、 Mse I 及び Tsp509 I でそれぞれで処理し、断片長パターンの違いにより判別する。これにより
判別できない場合は、 ATCO 領域の DNA 配列を直接解析し、各魚種に特有な配列を確認することで
判別する。
なお、ミトコンドリア DNA (チトクロム b、 D ループ、 12S rRNA、 16S rRNA などを含む)は核内
DNA よりも進化速度が速い。さらにミトコンドリア DNA 内においては、非コード領域の中の D ル
ープはチトクロム b、 12S rRNA、 16S rRNA などより進化速度が速い特徴がある。そのため、種の同
定や系統樹解析にミトコンドリア DNA が用いられることが多い。
２．２
出典
DNA の抽出は、 QIAGEN 社 DNeasy Tissue kit の製品プロトコルによる。
RFLP は、２．１１
２．３
参考文献１）及び４）を参考に行った。
適用範囲
マグロ属魚類のうち、クロマグロ、ミナミマグロ、キハダ、メバチ、ビンナガの５種の生鮮食品に
適用する。なお、コシナガとタイセイヨウマグロは生鮮食品での流通量がごくわずかであることから
適用外とする。
２．４
装置
２．４．１
DNA 抽出
遠心機： 1.5mL 及び 2.0mL のマイクロチューブを 12,000 × g で遠心可能なもの。
マイクロピペット： 0.5 ∼ 1,000 μ L を分注可能な組み合わせ
例) 0.5-10 μ L、 10-100 μ L、 100-1,000 μ L 容等を用いる。
55 ℃および 70 ℃で保温可能なインキュベーター
試験管ミキサー
２．４．２
PCR
PCR 増幅装置： PCR Thermal Cycler MP ( TaKaRa 社)又は、同等品。
マイクロピペット： 0.5 ∼ 1,000 μ L を分注可能な組み合わせ
例) 0.5-10 μ L、 10-100 μ L、 100-1,000 μ L 容等を用いる。
遠心機： 0.2 mL 及び 1.5mL のマイクロチューブを遠心可能なもの。
ゲル電気泳動装置一式：「JAS 分析試験ハンドブック
遺伝子組換え食品・検査分析マニュアル」
（以降、 JAS ハンドブックと記載する）基本操作編の「４
ゲル電気泳動」を参照する（注２．１）。
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PCR 増幅及び
２．４．３
制限酵素処理
マイクロピペット： 0.5 ∼ 1,000 μ L を分注可能な組み合わせ
例) 0.5-10 μ L、 10-100 μ L、 100-1,000 μ L 容等を用いる。
遠心機： 0.5 mL のマイクロチューブを遠心可能なもの。
インキュベーター： 37 ℃及び 65 ℃で保温可能なもの。
ゲル電気泳動装置一式：「２．４．２
２．５．
PCR」に同じ。
試薬
２．５．１
DNA 抽出
DNeasy Tissue kit（ QIAGEN 社）
RNase A (100 mg/mL)
エタノール（特級）
２．５．２
PCR
TM
DNA ポリメラーゼ： AmpliTaq
Gold (Applied Biosystems 社 )又は、同等品。
デオキシヌクレオシド三リン酸溶液： dNTP (2 mmol/L each) AmpliTaq
塩化マグネシウム溶液： MgCl2 (25 mmol/L) AmpliTaq
TM
PCR 用緩衝液： 10 ｘ PCR buffer II AmpliTaq
TM
TM
Gold 添付品。
Gold 添付品。
Gold 添付品。
プライマー：表１「プライマー対」に従い、合成したものを購入する。
標準 DNA 溶液（マグロ５種７タイプ）：
魚種の履歴の確かな太平洋産クロマグロ、大西洋産クロマグロ、ミナミマグロ、メバチαタイプ、
メバチβタイプ、キハダ及びビンナガから「２．６．１
DNeasy Tissue kit ( QIAGEN 社）を用い
た DNA の抽出」に従い抽出した DNA 溶液を用いる。ただし、使用する前にプライマー対 H8562
及び H9432 間の塩基配列をシークエンスし、図「マグロ５種７タイプにおける ATCO 領域中の
プライマー L8562 及び H9432 間の塩基配列」と比較して魚種を確認すること（注２．２）。
ゲル電気泳動用試薬：「JAS ハンドブック」基本操作編の「 4
PCR 増幅及びゲル電気泳動」を参
照する。
２．５．３
制限酵素処理
制限酵素： Alu I、 Mse I、 Tsp509 I（ New England BioLabs (NEB)社）又は、同等品。
制限酵素用緩衝液： NEB Buffer 1、 NEB Buffer 2 、 BSA solution 制限酵素添付品又は、同等品。
ゲル電気泳動用試薬：「２．５．２
２．６
PCR」に同じ。
操作
２．６．１
DNeasy Tissue kit （ QIAGEN 社）を用いた DNA の抽出
（１）抽出は、買い上げた１点の試料につき１点とする。すなわち買い上げ点数だけ抽出が行われる。
滅菌済みのピンセット及びメス等を用いて、コンタミネーションを防止するために、表面を避
け、内部の筋肉組織を採取し、抽出に供する。 1.5 mL 容チューブに約 25 mg 採取する。
（２）採取した試料に、 100-1,000 μ L 容のマイクロピペットを用いて 180 μ L の Buffer ATL 及び、
10-100 μ L 容のマイクロピペットを用いて 20 μ L の Proteinase K (Kit 添付品 )を添加後、試験
管ミキサーを用いて最高速で15秒撹拌する。
（３）試料の入ったチューブをインキュベーターを用いて 55 ℃に保温し、試料が完全に溶解するま
で 2 時間以上放置する。その際、３０分毎に攪拌する。
-8-
（４） 0.5-10 μ L 容のマイクロピペットを用いて 100 mg / mL の RNase A を 4.0 μ L 添加し、試験管
ミキサーを用いて最高速で 15 秒撹拌後、室温で 2 分間静置する。
（５）試験管ミキサーを用いて 15 秒間最高速で撹拌後、 100-1,000 μ L 容のマイクロピペットを用い
て 200 μ L の Buffer AL を添加する。
（６）試験管ミキサーを用いて最高速で 15 秒撹拌後、インキュベーターを用いて 70 ℃で10分間加熱
する。
（７） 100-1,000 μ L 容のマイクロピペットを用いて 200 μ L のエタノールを添加し、試験管ミキサ
ーを用いて最高速で 15 秒撹拌する。
（８） 100-1,000 μ L 容のマイクロピペットを用いて、溶液全量を DNeasy mini column に負荷する。
（９）カラムを 6,000 × g で室温で、 1 分間遠心し、カラムを新しい 2 mL チューブに移す。溶出液は
チューブとともに捨てる。
（１０） 100-1,000 μ L 容のマイクロピペットを用いて、 Buffer AW1 を 500 μ L 加え、 6,000 × g で、
室温で 1 分間遠心し、カラムを新しい 2 mL チューブに移す。溶出液はチューブとともに捨て
る。
（１１） 100-1,000 μ L 容のマイクロピペットを用いて、 Buffer AW2 を 500 μ L 加え、 12,000 × g で
室温で 3 分間遠心し、カラムを新しい 2 mL チューブに移す。溶出液はチューブとともに捨て
る。
（１２） 100-1,000 μ L 容のマイクロピペットを用いて、 Buffer AE を 200 μ L 加え、室温で1分間静
置後、 6,000 × g で、室温で 1 分間遠心し、 DNA を溶出する。
（１３）（１２）の操作をもう 1 度繰り返し、１回目の溶出液と合わせて DNA 溶液とし、そのまま
PCR の鋳型 DNA として使用する。使用するまで -20 ℃以下で保存すること。
２．６．２
PCR 操作
準備
使用するチューブ、チップは使い捨てとし、使用する間近に 121 ℃、 15 分以上オートクレーブ滅
菌をしておくこと。
操作に当たっては、専用のパウダーフリーのゴム手袋を着用すること。
操作は氷上で行う。
（１）必要な PCR チューブの本数
抽出 DNA 溶液１点につき１本ずつ PCR を行う。 PCR のポジティブコントロールは、標準 DNA 溶
液（５種７タイプ）をそれぞれ鋳型として用いて PCR を行う。ただし、太平洋産クロマグロの標準
DNA 溶液については２本（注２．３）、それ以外は１本ずつ行うこと。その他、 DNA を含まないネ
ガティブコントロールと、プライマーを含まないネガティブコントロールを１本ずつ用意する。なお、
プライマーを含まないネガティブコントロールについては、標準 DNA 溶液（太平洋産クロマグロ）
を鋳型として用いること。参考として、必要な PCR チューブの本数を表２「必要な PCR チューブの
本数」に示す。
（２） PCR マスターミックスの調製
PCR を行う試料数にあわせて、滅菌した 0.2 mL チューブを用意する。この本数にあわせ、、表３
「 PCR 溶液の組成」を参照して全体の使用液量を決め（注２．４）、鋳型 DNA を除く各液を混合調
製したものを PCR マスターミックスとする（注２．５）。調製した PCR マスターミックスを用意し
た 0.2 mL チューブに 45 μ L ずつ分注する。
プライマー対なしのネガティブコントロールについては、別にプライマー対の代わりに滅菌水を加
-9-
えた PCR マスターミックスを用意し、 0.2 mL チューブに 45 μ L 分注する。なお、分注器の最小容量
に注意すること。
（３）試料の添加
分注した PCR マスターミックスに試料から抽出した DNA 溶液を 5
μ L ずつ加える。 DNA を含ま
ないネガティブコントロールに滅菌水を 5 μ L、プライマーを含まないネガティブコントロールに標
準 DNA 溶液（太平洋産クロマグロ）を 5
μ L、ポジティブコントロールに標準 DNA 溶液（５種７
タイプ）を 5 μ L ずつ加える。
試料の添加は、コンタミネーション防止の観点から、試料から抽出した DNA 溶液、ネガティブコ
ントロール、ポジティブコントロールの順に行う。
（４） PCR 増幅
試料を PCR 増幅装置にかける。 PCR の温度条件は「表 4 PCR の温度サイクル」に定める。 PCR 終
了後は、ただちに PCR 反応液のゲル電気泳動を行い、 PCR が正常に行われたことを確認した後、制
限酵素処理を行う。やむをえない場合は反応液を冷蔵あるいは冷凍保存しておく。
（５）ゲル電気泳動
JAS ハンドブック基本操作編の「４
PCR 増幅及びゲル電気泳動」を参照する。アガロースゲル
の濃度は、 3 %(w/v)とする。
ネガティブコントロールからバンドがみられないことを確認し、ポジティブコントロール及び全て
の試料の PCR 産物から予想される長さのバンド（ 915 bp）がみられることを確認する（注２．６）。
確認後は、「２．６．３
２．６．３
制限酵素処理」を行う。
制限酵素処理
（１）必要な制限酵素処理用チューブの本数
制限酵素処理は、マグロ試料から抽出した DNA を鋳型にした PCR 反応液１本につき１本ずつ行う。
さらに、ポジティブコントロールとして標準 DNA 溶液（５種７タイプ）を鋳型とした PCR 反応液に
おいても、同様に制限酵素処理を行う。その他、制限酵素を入れていないネガティブコントロールを
１本用意する。参考として、必要な制限酵素処理用チューブの本数を表５「必要な制限酵素処理用チ
ューブの本数」に示す。
（２）制限酵素処理用マスターミックスの調製
「２．６．２
PCR 操作」での PCR 産物を Alu I,
Mse I 及び Tsp509 I でそれぞれ処理する。制限
酵素処理を行う試料数にあわせて、滅菌した 0.2 mL のチューブを用意する。この本数にあわせ、表
6「制限酵素処理の反応液組成」を参照して全体の液量を決め（注２．４）、 PCR 反応液を除く各液
を混合調製したものを制限酵素処理用マスターミックスとする。調製した制限酵素処理用マスターミ
ックスを用意した 0.2 mL のチューブに 10 μ L ずつ分注する。
制限酵素を加えていないネガティブコントロールとして、制限酵素の代わりに滅菌水を加えたネガ
ティブコントロール用のマスターミックスを用意し、 0.2 mL チューブに 10 μ L 分注する。なお、分
注器の最小容量に注意すること。
（３） PCR 反応液の添加
分注した制限酵素処理用マスターミックスに PCR 反応液 10 μ L ずつ加える（注２．７）。すべて
の溶液を加えたら、チューブを指ではじき攪拌した後、遠心機でスピンダウンする。制限酵素を加え
ていないネガティブコントロールには、標準 DNA 溶液（太平洋産クロマグロ）を鋳型にした PCR 反
応液を 10 μ L 加える。
（４）制限酵素処理
Alu I 及び Mse I 制限酵素反応液を 37 ℃で 1.5 時間以上静置する。また、 Tsp509 I 制限酵素反応液を
65 ℃で 1.5 時間以上静置する。制限酵素処理後は、ただちに反応液のゲル電気泳動を行う。やむをえ
- 10 -
ない場合は反応液を冷蔵あるいは冷凍保存しておく。
（５）ゲル電気泳動
JAS ハンドブック基本操作編の「４
PCR 増幅及びゲル電気泳動」を参照する。アガロースゲル
の濃度は、 3 % (w/v)とする。
まずはじめに、 Alu I, Mse I 及び Tsp509 I のそれぞれの制限酵素処理溶液について、ネガティブコン
トロール及びポジティブコントロール（太平洋産クロマグロ、大西洋産クロマグロ及びミナミマグ
ロ）と共に試料の制限酵素処理溶液を電気泳動する。ゲルを可視化し、ネガティブコントロールが制
限酵素により切断されていないこと、さらに、ポジティブコントロールが表７「制限酵素処理後の
RFLP パターン」の３魚種（太平洋産クロマグロ、大西洋産クロマグロ及びミナミマグロ）とそれぞ
れ合致することを確認する（注２．６）。確認後は「２．７
魚種の判別」を行う。これらのマグロ
類３タイプと合致しない試料については、さらに、ネガティブコントロール及び残りのマグロ４タイ
プ（メバチ α 、メバチ β 、キハダ及びビンナガ）のポジティブコントロールと共に電気泳動し、
RFLP パターンの確認を行う。
２．７
魚種の判別
RFLP のバンドパターンが、表 7「制限酵素処理後の RFLP パターン」中のいずれかの魚種と合致
した場合、魚種の判別ができたとする（注２．８）。なお、参考として図１に「制限酵素処理後の標
準 DNA 溶液の電気泳動写真」を示す。該当するパターンが存在しない場合は、プライマー L8562 及
び H9432 を用いて DNA シークエンスを行う（注２．９）。マグロ５種７タイプにおける ATCO 領域
中の L8562 及び H9432 間の塩基配列を図「マグロ５種７タイプにおける ATCO 領域中のプライマー
L8562 及び H9432 間の塩基配列」に示す。各魚種に特異的に保存されている DNA 配列と比較して、
魚種を判別する。（注２．１０）（注２．１１）
２．８
判別の確かさに関する情報
漁獲海域履歴の確かな冷凍保存試料及び独立行政法人水産総合研究センター遠洋水産研究所（遠洋
研）から提供頂いたエタノール保存試料をそれぞれ 67 及び 84 件、計 151 件（表８）を用いて、ミト
コンドリア DNA ATCO 領域の塩基配列を決定した。決定した ATCO 領域中のプライマー対
L8562-H9432 間の配列を図２示す。この塩基配列情報より各魚種内での突然変異もしくは塩基配列の
多型を確認したところ、本法の PCR-RFLP パターンを変える変異が２カ所存在した。
１つ目は、メバチαタイプにおける 559 番目の C が T（ 5 件中 2 件）へ変異することにより、新た
に制限酵素 Tsp509 I の認識部位が生じ、 PCR-RFLP パターンの 417 bp のバンドが 360 及び 57 bp とし
て検出された。ただし、この際生じる PCR-RFLP パターンは、他のマグロ類５種６タイプには存在し
ないことから、メバチαタイプの変異型であると推定可能であり、また、このような結果が得られた
サンプルについては、念のため ATCO 領域の塩基配列を決定し、メバチαタイプに特異的に保存さ
れている DNA 配列と比較することにより魚種の判別が十分可能である。
２つ目は、キハダにおける 280 番目の G が A（ 32 件中 2 件）へ変異することにより制限酵素 Alu I
の認識部位が消失し、 PCR-RFLP パターンの 280 及び 152 bp のバンドが切断されず 432 bp のバンドと
して検出され、メバチβタイプと同一パターンとなった。ただし、 Mse I 及び Tsp509 I 制限酵素処理
による PCR-RFLP パターンのみでキハダと判定可能であることから、 Alu I 制限酵素処理による
PCR-RFLP パターンのみがキハダではなくメバチβになったサンプルについては、念のため ATCO 領
域の塩基配列を決定し、キハダに特異的に保存されている DNA 配列と比較することにより魚種の判
別が十分可能である。
今回決定した塩基配列情報をもとに、本 PCR-RFLP 法の認識部位における魚種内変異率を表 8 にま
とめた。
- 11 -
２．９
記録
PCR に供する DNA 溶液を得るために特別に行った操作があれば詳細に記録すること。
PCR 産物の電気泳動結果及び制限酵素処理後の溶液の泳動結果を、画像データとして保存してお
く。判別したマグロの魚種名を記録する。
２．１０
謝辞
本マニュアルは先端技術を活用した農林水産高度化事業「近縁魚介類等の種判別および漁獲地域判
別技術の開発」における研究成果を基にして作成した。また、本マニュアルを作成するに当たり、試
料のご提供及びご助言を頂いた独立行政法人水産総合研究センター遠洋水産研究所の張成年博士に深
謝致します。
２．１１
参考文献
１） Chow S. and Inoue S.: Intra-and interspecific restriction fragment length polymorphism in mitochondrial
genes of Thunnus tuna species: Bull. Natl. Res. Inst. Far Seas Fish., 30, 619-627 ( 1993)
２） Chow S. and Kishino H.: Phylogenetic relationships between tuna species of genus Thunnus( Scombridae:
Teleostei) : Inconsistent implications from morphology, nuclear and mitochondrial genomes: J. Mol. Evol., 41,
741-748 ( 1995)
３） Chow S., Okamoto H., Miyabe N., Hiramatsu K. and Barut N.: Genetic divergence between Atlantic and
Indo-Pacific stocks of bigeye tuna( Thunnus obesus) and admixture around South Africa: Mol. Eco., 9,
221-227 ( 2000)
４） Takeyama H., Chow S., Tsuzuki H. and Matsunaga T.: Mitochondrial DNA sequence variation within and
between tuna Thunnus species and its application to species identification: J. Fish Biology, 58, 1646-1657
(2001)
５） Chow S., Nohara K., Tanabe T., Itoh T., Tsuji S., Nishikawa Y., Uyeyanagi S. and Uchikawa K.: Genetic
and morphological identification of larval and small juvenile tunus ( Pisces: Scombridae) caught by a
mid-water trawl in the western Pacific: Bull. Fish. Res. Agen., 8, 1-14 ( 2003)
（注２．１）コンタミネーションを防止するため、電気泳動に使用するマイクロピペットは、その他
の操作をするピペットと分けて管理する。
（注２．２）シークエンスにより魚種を確認した太平洋産クロマグロ、大西洋産クロマグロ、ミナミ
マグロ、メバチαタイプ、メバチβタイプ、キハダ及びビンナガのプライマー対 L8562
及び H9432 間の PCR 増幅産物をプラスミドにそれぞれ導入したものを標準 DNA 溶液と
して用いてもよい。
（注２．３）次に行う制限酵素処理のポジティブ及びネガティブコントロール用として、２本分の液
量が必要となる。
（注２．４）チップの壁に反応液が付着するなどして損失する溶液量を考慮し、多めに作製する。
（注２．５）コンタミネーション防止の観点から PCR マスターミックスの調製はプライマーを最後
に混合すること。
（注２．６）ネガティブ及びポジティブコントロールに異常が見られる場合、コンタミネーションや
- 12 -
試薬の劣化が考えられる。 JAS ハンドブックコンタミネーション防止編等を参照し、
速やかに適当な処置を行った後、必要に応じて PCR をやり直し、制限酵素処理を行う
こと。
（注２．７）制限酵素処理の際には PCR 反応液からの持ち越しの塩を除くことなく制限酵素処理を
行っているが、 Mse I 及び Tsp509 I に関しては本マニュアルに記載してある制限酵素処
理条件で完全に消化される。 Alu I に関しては、若干未消化な断片が残る場合があるが、
標準 DNA 溶液の制限酵素処理溶液と同一ゲル上で泳動し、 PCR-RFLP パターンを比較
することにより十分判別が可能である。
（注２．８）低分子側（ 100 bp 未満）のバンドが不鮮明な場合は、 100 bp 以上の鮮明なバンドのみで
魚種の判別を行うこと。
（注２．９） PCR 増幅産物が得られないなどの諸事情により、シークエンスが行えない場合は、
「魚種判別不能」とする。
（注２．１０）シークエンス結果がどの魚種とも明らかに相同性が低い場合は、必要に応じて再度
DNA の抽出、 PCR 操作を行い、シークエンスを行う。それでも魚種の特定ができない
場合は、「魚種判別不能」とする。
（注２．１１）同じ魚種内であっても集団により配列が異なる場合がある。各魚種特異的に保存され
ている配列を確認し、判別する。
- 13 -
表１
プライマー対
対象遺伝子
記号
ミトコンドリア DNA
L8562 915 bp CTTCGACCAATTTATGAGCCC
増幅長
配
列（5'→ 3'）
ミトコンドリア DNA
ATCO 領域
H9432
ATPase 6 と cytochorome c oxidase
GCCATATCGTAGCCCTTTTTG
増幅部分
subunit III
表２
必要な PCR チューブの本数
PCR の鋳型 DNA
本数
試料
抽出 DNA 溶液
X
ポジティブコントロール
標準 DNA 溶液（太平洋産クロマグロ）
２
ネガティブコントロール
〃
（大西洋産クロマグロ）
１
〃
（ミナミマグロ）
１
〃
（メバチα）
１
〃
（メバチβ）
１
〃
（キハダ）
１
〃
（ビンナガ）
１
滅菌水
１
標準 DNA 溶液（太平洋産クロマグロ）
１
(DNA を含まない)
ネガティブコントロール
(プライマーを含まない)
計
表３
X + 10
PCR 溶液の組成
液量/ tube
滅菌水
終濃度
30.25 μ L
TM
AmpliTaq
Gold (5 U/µL)
0.75 μ L
3.75 U/ tube
10x PCR buffer II
5
μL
1x
dNTP (2 mmol/L each)
5
μL
200 μ mol/L each
MgCl2 (25 mmol/L)
3
μL
1.5 mmol/L
5' プライマー (50 µmol/L)
0.5 μ L
0.5 μ mol/L
3' プライマー (50 µmol/L)
0.5 μ L
0.5 μ mol/L
鋳型 DNA
5
μL
50
μL
全量
表４
PCR の温度サイクル
温度
時間
サイクル数
最初の変性
95 ℃
8 min
変性
94 ℃
1min
アニーリング
53 ℃
1min
伸長反応
71 ℃
1.5min
最後の伸長反応
71 ℃
7 min
1
-
-
保存
4℃
1
35
- 14 -
に跨る領域
表５
必要な制限酵素処理用チューブの本数
本数
添加する PCR 反応液
試料
Alu I 処理 Mse I 処理 Tsp509 I 処理
試料から抽出した DNA を鋳型としたもの
ポジティブコントロール標準 DNA 溶液を鋳型としたもの
X
X
X
１
１
１
１
１
１
（太平洋産クロマグロ）
〃
（大西洋産クロマグロ）
〃
（ミナミマグロ）
１
１
１
〃
（メバチα）
１
１
１
〃
（メバチβ）
１
１
１
〃
（キハダ）
１
１
１
〃
（ビンナガ）
１
１
１
１
１
１
X + 10
X + 10
X + 10
ネガティブコントロール標準 DNA 溶液を鋳型としたもの
(制限酵素を含まない)
（太平洋産クロマグロ）
計
表６
制限酵素処理の反応液組成
表６．１
Alu I 処理の反応液組成
液量/ tube
滅菌水
Alu I (10 U/µL)
0.5 μ L
10x NEB Buffer 2
2
μL
PCR 反応液
10
μL
全量
20
μL
表６．２
終濃度
7.50 μ L
5 U/ tube
1x
Mse I 処理の反応液組成
液量/ tube
滅菌水
7.55 μ L
Mse I (10 U/µL)
0.25 μ L
10x NEB Buffer 2
2
終濃度
2.5 U/ tube
μL
1x
100x BSA (10 mg/mL)
0.2 μ L
1x
PCR 反応液
10
μL
全量
20
μL
表６．３
Tsp509 I 処理の反応液組成
液量/ tube
滅菌水
7.75 μ L
Tsp509 I (10 U/µL)
0.25 μ L
10x NEB Buffer 1
2
μL
PCR 反応液
10
μL
全量
20
μL
終濃度
2.5 U/ tube
1x
- 15 -
表７
制限酵素処理後の RFLP パターン
表７．１
DNA 断片長
Alu I 処理後の RFLP パターン
太平洋産
大西洋産
(bp)
クロマグロ
クロマグロ
432
+
-
295
+
280
-
ミナミマグロ
メバチ
メバチ
キハダ
ビンナガ
αタイプ
βタイプ
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
188
-
+
-
-
-
-
-
152
-
+
+
+
-
+
-
147
-
-
+
+
+
+
-
122
-
-
-
-
-
-
+
81
+
-
-
-
-
-
-
66
+
-
-
-
-
-
+
41
+
-
+
+
+
+
-
ミナミマグロ
メバチ
メバチ
キハダ
ビンナガ
αタイプ
βタイプ
表７．２
DNA 断片長
Mse I 処理後の RFLP パターン
太平洋産
大西洋産
(bp)
クロマグロ
クロマグロ
294
-
-
-
-
+
-
-
264
-
+
+
+
-
+
-
255
+
-
-
-
-
-
+
254
+
-
-
-
-
-
+
224
-
+
+
+
+
+
-
194
+
+
+
+
+
+
+
130
-
-
-
+
-
+
-
115
+
+
+
-
-
-
+
75
-
-
-
-
+
-
-
55
-
-
-
-
+
-
-
41
+
+
+
+
+
+
+
32
+
+
+
+
+
+
+
30
-
+
+
+
-
+
-
15
+
+
+
-
-
-
+
12
-
-
-
-
-
-
-
9
+
-
-
-
-
-
+
- 16 -
表７．３
Tsp509 I 処理後の RFLP パターン
DNA 断片長
表８
太平洋産
大西洋産
(bp)
クロマグロ
クロマグロ
ミナミマグロ
メバチ
メバチ
αタイプ
βタイプ
キハダ
ビンナガ
417
+
+
+
+
+
+
+
403
-
-
-
+
+
-
-
217
+
+
+
-
-
+
+
186
+
+
+
-
-
+
+
72
15
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
8
+
+
+
+
+
+
+
塩基配列解析試料内訳及び魚種内変異率
魚種（タイプ）
太平洋産クロマグロ
大西洋産クロマグロ
ミナミマグロ
試料数（件）
漁獲海域もしくは入手先
魚種内変異率（％）
２６三重県沖
５
宮城県沖
８
遠洋研
１３
２３大西洋
６
トルコ産
３
クロアチア産
３
スペイン産
３
遠洋研
８
３１大西洋
３
インド洋
３
太平洋
３
オーストラリア産
３
遠洋研
１９
メバチαタイプ
５遠洋研
５
メバチβタイプ
２５大西洋
３
インド洋
キハダ
ビンナガ
計
３
太平洋
３
遠洋研
１６
３２大西洋
３
インド洋
３
太平洋
３
遠洋研
２３
９大西洋
３
インド洋
３
太平洋
３
１５１
１５１
- 17 -
０（０／２６）
０（０／２３）
０（０／３１）
４０（２／５）
０（０／２５）
６（２／３２）
０（０／９）
３（４／１５１）
図１
制限酵素処理後の標準 DNA 溶液の電気泳動写真
M は 100 bp ラダーサイズマーカー、1 ∼ 7 はそれぞれ、太平洋産クロマグロ、大西洋産クロマグロ、ミナミ
マグロ、メバチα、メバチβ、キハダ及びビンナガの標準 DNA 溶液を各制限酵素で処理した溶液、8 は PC
R-RFLP のネガティブコントロールである。各図の左には 100 bp ラダーサイズマーカーの長さを、右には制
限酵素 DNA 断片の長さを示した。
M
1
2
3
4
5
6
7
8
M
(bp)
1500
1000
900
800
700
600
500
400
(bp)
915
432
295, 280
300
188
152, 147
122
200
100
図１．１
Alu I 処理後の標準 DNA 溶液の電気泳動写真
M
1
2
3
4
5
6
7
8
M
(bp)
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
(bp)
915
294
264, 255, 254
224
194
130
115
200
100
図１．２
Mse I 処理後の標準 DNA 溶液の電気泳動写真
M
1
2
3
4
5
6
7
8
M
(bp)
1500
1000
900
800
700
600
500
400
(bp)
915
417, 403
300
217
200
186
100
図１．３
72
Tsp509 I 処理後の標準 DNA 溶液の電気泳動写真
- 18 -
図２
マグロ５種７タイプにおける L8562-H9432 プライマー対を用いた PCR 産物の DNA シークエンス
太平洋産クロマグロ以外は異なる塩基のみを示してある。括弧内の数字はシークエンスサンプル数。
四角で囲んである領域は制限酵素認識部位である。R=A/G; Y=C/T; K=G/T; M=A/C; S=G/C; W=A/T
10 Tsp509 I
ﾌﾟﾗｲﾏｰ (L8562)
C T
太平洋産クロマグロ(26) C T
大西洋産クロマグロ(23) . .
. .
ミナミマグロ(31)
. .
メバチαタイプ(5)
. .
メバチβタイプ(25)
. .
キハダ(32)
. .
ビンナガ(9)
T
T
.
.
.
.
.
.
C
T
.
.
.
.
.
.
G
G
.
.
.
.
.
.
A
A
.
.
.
.
.
.
C
C
.
T
.
.
.
.
C
C
.
.
.
.
.
.
A
A
.
.
.
.
.
.
ビンナガ(9)
A
.
.
.
.
.
T
T
.
.
.
.
.
.
T
T
.
.
.
.
.
.
T
T
.
.
.
.
.
.
A
A
.
.
.
.
.
.
T
T
.
.
.
.
.
.
G
G
.
.
.
.
.
.
50
Mse I
太平洋産クロマグロ(26) T T
大西洋産クロマグロ(23) . .
. .
ミナミマグロ(31)
. .
メバチαタイプ(5)
. .
メバチβタイプ(25)
. .
キハダ(32)
A
A
.
.
.
.
.
.
20
A
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
A
G
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
M
A
A
.
.
.
.
.
.
G
G
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
T
.
.
C
C
C
T
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
W
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
70
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
太平洋産クロマグロ(26) C
大西洋産クロマグロ(23) .
.
ミナミマグロ(31)
.
メバチαタイプ(5)
.
メバチβタイプ(25)
.
キハダ(32)
.
ビンナガ(9)
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
A
A
A
A
R
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
Y
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
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.
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.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
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T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
R
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
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.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
DNA シークエンス（1 ∼ 240 base）
- 19 -
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
T
C
.
C
.
.
C
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
C
C
C
C
C
T
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
Mse I
G
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
T
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
Y
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
C
C
.
.
T
.
.
.
.
.
.
120
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
120
120
120
120
120
120
120
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
160
160
160
160
160
160
160
200
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
Tsp509 I 230
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
160
190
220
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
150
180
Mse I
T
C
C
C
C
C
.
Y
C
C
C
C
C
C
G
.
.
.
.
.
40
40
40
40
40
40
40
80
110
140
210
Mse I
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
100
170 Mse I
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
80
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
M
T
.
.
.
.
.
.
80
80
80
80
80
80
130
図２．１
C
C
.
.
.
.
.
.
40
C
.
.
.
.
.
太平洋産クロマグロ(26) C A A
大西洋産クロマグロ(23) . . .
. . .
ミナミマグロ(31)
. R .
メバチαタイプ(5)
. . .
メバチβタイプ(25)
. R .
キハダ(32)
. . .
ビンナガ(9)
太平洋産クロマグロ(26)
大西洋産クロマグロ(23)
ミナミマグロ(31)
メバチαタイプ(5)
メバチβタイプ(25)
キハダ(32)
ビンナガ(9)
C
C
.
.
.
.
.
.
60
Mse I
90
太平洋産クロマグロ(26)
大西洋産クロマグロ(23)
ミナミマグロ(31)
メバチαタイプ(5)
メバチβタイプ(25)
キハダ(32)
ビンナガ(9)
C
C
.
.
.
.
.
.
30
T
C
C
C
C
C
.
C
.
.
.
.
.
.
200
200
200
200
200
200
200
240
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
A
A
.
A
A
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
T
T
T
T
T
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
240
240
240
240
240
240
240
250
太平洋産クロマグロ(26) A
大西洋産クロマグロ(23) .
.
ミナミマグロ(31)
.
メバチαタイプ(5)
R
メバチβタイプ(25)
.
キハダ(32)
.
ビンナガ(9)
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
R
.
G
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
メバチβタイプ(25)
キハダ(32)
ビンナガ(9)
T
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
T
T
T
T
T
M
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
290
Alu I
太平洋産クロマグロ(26) C
大西洋産クロマグロ(23) .
.
ミナミマグロ(31)
.
メバチαタイプ(5)
T
.
.
.
.
.
.
260
A
.
.
.
T
.
.
.
C
.
.
.
T
.
.
.
C
.
.
.
T
.
.
.
C
.
.
.
A
.
.
.
A
.
.
.
T
C
C
C
A
.
.
.
T
.
.
.
G
.
.
.
G
.
.
.
G
.
.
.
A
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
R
C
C
C
M
M
C
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
A
A
A
A
A
.
G
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
T
.
C
T
T
T
T
T
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
Y
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
310
T
.
.
.
.
.
.
T
C
C
C
C
Y
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
R
.
.
G
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
C
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
T
.
.
.
T
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
C
C
.
Y
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
C
.
.
.
A
.
.
.
T
.
.
.
T
.
.
.
C
.
.
.
C
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
R
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
Y
Y
.
.
.
Y
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
G
A
A
A
A
A
K
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
DNA シークエンス（241 ∼ 480 base）
- 20 -
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
A
G
G
G
.
R
.
280
280
280
280
280
280
280
T
.
.
.
C
.
.
.
T
.
.
.
G
.
.
.
A
.
.
.
T
.
.
.
T
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
G
A
A
A
A
A
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
C
C
C
C
C
C
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
R
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
G
.
R
.
A
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
G
.
R
.
R
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
G
.
.
A
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
360
360
360
360
360
360
360
400
T
.
.
.
.
C
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
G
A
A
A
A
A
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
Y
Y
A
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
.
.
.
T
C
.
.
.
.
.
400
400
400
400
400
400
400
C
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
440
440
440
440
440
440
440
480
Alu I
C
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
.
.
.
440
Alu I
Mse I 470
G
.
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A
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360
Tsp509 I 430
460
G
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T
C
C
C
390
420
Tsp509 I
A
.
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A
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.
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C
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A
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320
350
380
450
T
.
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.
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.
.
T
.
.
.
340
410
A
.
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.
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T
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.
.
C
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320
320
320
A
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.
.
.
.
C
.
.
.
C
.
.
.
.
.
.
. . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . A . . G Y . . .
. . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . .
. . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . .
太平洋産クロマグロ(26) C Y
大西洋産クロマグロ(23) . C
. C
ミナミマグロ(31)
. C
メバチαタイプ(5)
. C
メバチβタイプ(25)
. C
キハダ(32)
. C
ビンナガ(9)
図２．２
A
.
.
.
.
.
.
320
320
320
320
370
キハダ(32)
ビンナガ(9)
C
.
.
.
.
.
.
280
G
.
.
.
太平洋産クロマグロ(26) C
大西洋産クロマグロ(23) .
.
ミナミマグロ(31)
.
メバチαタイプ(5)
.
メバチβタイプ(25)
.
キハダ(32)
.
ビンナガ(9)
太平洋産クロマグロ(26)
大西洋産クロマグロ(23)
ミナミマグロ(31)
メバチαタイプ(5)
メバチβタイプ(25)
A
.
.
.
.
.
.
300
330
太平洋産クロマグロ(26)
大西洋産クロマグロ(23)
ミナミマグロ(31)
メバチαタイプ(5)
メバチβタイプ(25)
キハダ(32)
ビンナガ(9)
T
C
C
C
C
C
.
270
T
C
.
.
.
.
C
A
.
.
.
.
.
.
A
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.
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.
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C
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.
C
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.
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.
.
T
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.
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480
480
480
480
480
480
480
490
太平洋産クロマグロ(26) A
大西洋産クロマグロ(23) .
.
ミナミマグロ(31)
.
メバチαタイプ(5)
.
メバチβタイプ(25)
R
キハダ(32)
.
ビンナガ(9)
A
.
.
.
.
.
.
C
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G
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G
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C
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T
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G
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G
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G
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Mse I
C
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T
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.
C
T
T
T
T
T
.
T
.
.
.
.
.
.
530
太平洋産クロマグロ(26) G
大西洋産クロマグロ(23) .
.
ミナミマグロ(31)
.
メバチαタイプ(5)
メバチβタイプ(25)
キハダ(32)
ビンナガ(9)
C
.
.
.
A
.
.
.
A
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C
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T
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C
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A
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C
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G
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C
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550
A
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G
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C
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C
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C
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A
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C
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G
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C
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A
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.
C
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.
C
.
.
.
A
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.
.
A
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.
T
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.
.
C
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A
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T
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A
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G
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C
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.
C
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T
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C
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A
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A
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A
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C
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T
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T
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DNA シークエンス（481 ∼ 720 base）
- 21 -
A
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G
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T
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A
G
G
G
G
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C
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.
.
C
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A
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520
520
520
520
520
520
520
560
Alu I
T
A
A
A
A
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T
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C
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Y
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T
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C
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600
600
600
600
600
600
600
T
.
.
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.
C
.
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.
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640
640
640
640
640
640
640
680
T
.
.
.
.
.
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G
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G
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C
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C
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C
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T
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710
T
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.
.
.
.
G
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640
670
A
.
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.
.
C
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.
Y
600
630
700
A
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.
C
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.
.
C
.
.
.
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.
590
660
690
A
.
.
.
.
.
.
G
.
.
.
620 Alu I
650
太平洋産クロマグロ(26) C
大西洋産クロマグロ(23) .
.
ミナミマグロ(31)
.
メバチαタイプ(5)
.
メバチβタイプ(25)
.
キハダ(32)
.
ビンナガ(9)
T
.
.
.
580
610
太平洋産クロマグロ(26) C
大西洋産クロマグロ(23) .
.
ミナミマグロ(31)
.
メバチαタイプ(5)
.
メバチβタイプ(25)
.
キハダ(32)
.
ビンナガ(9)
A
.
.
.
A
.
.
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560
560
560
C
.
.
.
.
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.
A
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.
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T
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.
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. . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . A . . . .
. . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . A . . . .
. . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A
.
.
.
.
.
.
T
.
.
.
T
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.
.
.
.
.
560
560
560
560
A
.
.
.
.
.
.
C
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
520
C
.
.
.
太平洋産クロマグロ(26) T
大西洋産クロマグロ(23) .
.
ミナミマグロ(31)
.
メバチαタイプ(5)
.
メバチβタイプ(25)
.
キハダ(32)
.
ビンナガ(9)
図２．３
A
.
.
.
.
.
.
510
Tsp509 I
540
570
太平洋産クロマグロ(26)
大西洋産クロマグロ(23)
ミナミマグロ(31)
メバチαタイプ(5)
メバチβタイプ(25)
キハダ(32)
ビンナガ(9)
500
C
.
.
.
.
.
.
A
.
.
.
.
.
.
680
680
680
680
680
680
680
720
C
.
.
.
.
.
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C
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.
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T
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C
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C
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A
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.
.
.
.
720
720
720
720
720
720
720
730
Mse I
太平洋産クロマグロ(26) T T A
大西洋産クロマグロ(23) . . .
. . .
ミナミマグロ(31)
. . .
メバチαタイプ(5)
. . .
メバチβタイプ(25)
. . .
キハダ(32)
. . .
ビンナガ(9)
A
.
.
.
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C
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A
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740
C
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T
T
T
T
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C
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.
T
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.
.
.
.
.
770
太平洋産クロマグロ(26) T C
大西洋産クロマグロ(23) . .
. .
ミナミマグロ(31)
. .
メバチαタイプ(5)
. .
メバチβタイプ(25)
. .
キハダ(32)
ビンナガ(9)
G
.
.
.
.
.
C
.
.
.
.
.
T
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A
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T
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C
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T
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G
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ビンナガ(9)
A
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T
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T
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図２．４
C
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.
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T
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G
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790
T
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G
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C
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T
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T
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Y
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A
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C
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760
760
760
760
760
760
760
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C
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A
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T
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800
800
800
800
800
800
890
ﾌﾟﾗｲﾏｰ (H9432相補鎖)
太平洋産クロマグロ(26)
大西洋産クロマグロ(23)
ミナミマグロ(31)
メバチαタイプ(5)
メバチβタイプ(25)
キハダ(32)
ビンナガ(9)
C
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760
C
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850
太平洋産クロマグロ(26)
大西洋産クロマグロ(23)
ミナミマグロ(31)
メバチαタイプ(5)
メバチβタイプ(25)
キハダ(32)
ビンナガ(9)
C
.
.
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.
780
810
太平洋産クロマグロ(26)
大西洋産クロマグロ(23)
ミナミマグロ(31)
メバチαタイプ(5)
メバチβタイプ(25)
キハダ(32)
G
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750
A
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T
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G
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G
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G
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840
840
840
840
840
840
840
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C
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A
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A
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C
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C
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880
880
880
880
880
880
880
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C A A A A A G G G C T A C G A T A T G G C
A C A C C C C T C C T G T C C A A A A A G G T C T C C G A T A T G G T
915
. Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . .
915
. T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . .
915
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . .
915
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915
. T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . .
915
. . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
915
DNA シークエンス（721 ∼ 915 base）
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