大腸菌による遺伝子組換え

大腸菌による遺伝子組換え
Ⅰ
概要
大腸菌に GFP 遺伝子を持つプラスミド DNA を導入することにより、遺伝子組換え大
腸菌を作出する。ヒートショックを行う際の温度を変え、温度による組換え体出現個
体数の違いを比較する。
Ⅱ
研究目的
米国研修に行ったときに下村先生の研究に触れ、光るタンパク質に興味を持ち、そ
れを使って実験したいと思った。ヒートショックを行う際の温度を変え、温度と遺伝
子組換え個体の出現数の関係を考察する。
Ⅲ
実験の方法
（１）LB 培地の作成
①
LB 寒天培地に蒸留水 500ml を加えて
よく混ぜ、培地を完全に溶解する。
②
121℃、20 分以上のオートクレーブ処
理をし、60℃まで冷ます。
③
クリーンベンチ内でシャーレを開け、
6 枚の LB 寒天培地を作成する。
培地をシャーレの半分の高さまで入れ
て、ふたを閉め、固まるまで半日置く。
④
図１．オートクレーブ前の培地
残っている培地にアンピシリン溶液 250μℓを加え、泡立てないように混ぜた後、
③と同様にシャーレ 14 枚の寒天培地を作る。
⑤
培地が固まったら、パラフィルムでふたを固定する。
⑥
冷蔵庫で保存する。
（２）LB 液体培地の作成
①
LB 液体培地に蒸留水を 100ml 加えてよく混ぜ、
培地を完全に溶解する。
②
121℃、20 分以上オートクレーブ処理をし、
室温まで冷ます。
③
250μℓずつマイクロチューブに 12 本分注す
る。
④
冷蔵庫で保存する。
図２．実験の様子
-1-
（３）大腸菌プレートの作成
①
クリーンベンチ内で大腸菌グリセロールストックを開け、25μℓを LB 寒天培地に
のせ、ループでのばす。
②
30℃のインキュベータで、大腸菌プレートを 2 日培養する。
（４）組換え（DNA 量・温度条件を変えて行った）
実験前に以下のものを用意しておく。
・発泡スチロールに粉砕した氷を詰めておく。
・ヒートショックのため、お湯の温度を温度計を使って調節しておく。
・クリーンベンチ内で LB/Amp 培地と LB 培地を 1 時間乾燥させる。
・マイクロチューブに分注した、形質転換溶液とプラスミド DNA、LB 液体培地を氷にさ
して冷やしておく。
＜実験＞
①
大腸菌プレートのコロニーをループですくい取り、形質転換溶液に混ぜる。このと
き塊が残らないように注意する。混ぜた溶液は氷上に置く。
②
①のマイクロチューブにプラスミドＤＮＡを加える。
（DNA の混合量は、二回目では
それぞれ 5μℓ、10μℓ、15μℓ、三回目は全て 10μℓで行った。）
③
マイクロチューブを氷上に戻し、10 分置く。
④
冷やしたマイクロチューブをお湯に 50 秒間浸し、ヒートショックを行う。（ヒート
ショックの時間は、それぞれ二回目は 37℃、42℃、47℃、三回目は 20℃、42℃、
55℃、60℃、70℃に調節した。）
⑤
マイクロチューブをすばやく氷上に戻し、2 分置く。
⑥
氷から取り出し、ＬＢ液体培地 250μℓを加え、10 分間室温に置く。
⑦
⑥の溶液 100μℓをＬＢ/Ａｍｐ培地かＬＢ培地にのせ、新しいループで薄くのばす。
⑧
培地の表面が乾いたら、シャーレのふたを閉めて、パラフィルムでふたを固定し、
30℃のインキュベーターに上下逆にして入れる。
図３.ヒートショックの様子
図４.ちびたん（遠心分離機）
-2-
（５）観察
それぞれコロニーの個数を数える。
図５．組換え後のコロニー
Ⅳ
実験結果と考察
＊温度はヒートショックを行った際の温度である。
＊①②③は各シャーレを区別するためにつけた番号である。
＊対照とした、アンピシリンなしのＬＢ培地では、どのシャーレも光るコロニーは観
察されなかった。
一回目…全てのシャーレでコロニーが確認されなかった。
失敗の原因として考えられること
・培養温度が低かった。
・培養した時間が短かった。
・培養するときに逆さにせず、コンタミネーションした。
・ヒートショックの時間が正確でなかった。
・準備不足だった。
改善点
＊二回目は十分な培養時間をとるために、2 週にわたってコロニー数を調査した。
＊操作ミスを減らすために、十分事前準備し、実験操作に注意を払った。
-3-
＜二回目結果＞
表１．温度と DNA 量の関係（二回目）
ＤＮＡ量（μℓ）
温度（℃ ）
5
10
15
37
―
48
―
42
116
①15
①54
②45
②135
③46
③99
46
―
47
―
60
140
コロニー数
50
コロニー数
120
コ
ロ 40
ニ
ー
ー
コ 100
ロ
ニ
80
数 30
（
数
(
個 20
60
）
個
)
40
10
20
0
0
３７℃
４２℃
５μℓ
４７℃
温度
１０μℓ １５μℓ
図７．DNA量と組換え
大腸菌
コロニー数
図６．温度と組換え大腸菌
コロニー数
＊ＤＮＡ量の差とコロニー数の関係は、この実験からはよくわからなかった。
＊温度によるコロニー数の差がはっきりしなかったので、三回目は温度の幅を広げ、１
つの温度条件につき 3 実験区行い、平均をとった。
＊二回目ではＤＮＡ量を 10μℓで固定し、ヒートショックの温度のみを変えて実験を行
った。三回目も同様に DNA 量 10μℓで実験を行った。
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＜三回目結果＞
表２．温度とコロニー数の関係（三回目）
コロニーの数（個）
平均（個）
温度（℃ ）
20℃
①40
②39
③124
68
42℃
①86
②257
55℃
①95
②170
③236
167
60℃
①25
②26
③115
55
70℃
①5
②38
③29
24
172
・表には示さないが、60℃と 70℃でヒートショックした大腸菌も 42℃で処理した大腸菌と
同程度増殖することが確認された。
200
180
160
コロニー数（個）
140
120
100
80
60
コロニー数
40
20
0
２０℃
４２℃
５５℃
６０℃
７０℃
温度
図８．温度と組換え大腸菌コロニー数
＊42℃で最も多く組換え固体が出現したが、55℃でも出現数にあまり差がみられないこ
とから、42℃から 55℃の間で実験を行っても、同様のコロニー数が得られると考えら
れる。
＊60℃では組換えコロニー数が大きく減少しているので、55℃と 60℃の間のある温度を
境に、組換えが起こりにくくなると想定される。
＊同様に 20℃と 42℃の間にも、組換えが起こりにくくなる温度があると考えられる。
-5-
Ⅴ
感想
何気なく決めたテーマで研究を始めたので、実験に失敗してコロニーが観察できな
かったこともあったけど、回を重ねるごとに原因を考察し、次の実験につなげること
ができて良かった。
一回目の実験は、もう少し長く培養すればコロニーが観察できたかもしれないと思
った。
今後の課題としては、ヒートショックを行う際の、20℃と 42℃の間の温度と、55℃
と 60℃の間の温度で調査区を細かく設定し、組換えが起こりにくくなる温度を確認す
ることがあげられる。
学校の授業では出来ないような実験をしたので、自分で考えてやらなければならず、
いろいろ大変だった。
これからは、実験に関わる機会が増えると思う
が、細かいところまで気を配って、失敗してもめ
げずにやろうと思った。
図９.コロニー
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