活性化計画 Second 2光子現象が生命科学の新しい境地を拓く Harmonic Generation 細胞や組織の中で起こっている現象を生きた状態でいかに正確に捉えるかは、生命科学研究を進める上で、1つの大きな課題と言えるだろう。この課題を克服する1つの手段として、SHG（Second Harmonic Generation：第二次高調波発生）と呼ばれる2光子現象を利用した顕微鏡観察法の開発と研究への応用をオリンパス株式会社（以下、オリンパス）と進め、神経細胞でみられる膜電位変化の本質に迫る慶應義塾大学医学部薬理学教室の塗谷睦生氏にお話を伺った。ずれにも活用できるというわけではなく、細胞外マトリックスなど一定の配向性を持っていることと、その分子が非対称な構造であることが必要になる。塗谷氏はこのノンラベルでも観察が可能であるという点に注目する。「がん組織の周辺では健常な組織と比較した時に細胞外マトリックスの構造が変化していることが知られています。従来、がん組織などで細られていました。ただこれでは、例えば腫瘍モ ※1 。「スパインからのシグナルがとれた時は、暗デルマウスの組織を非侵襲で観察することはではかなり生命科学の研究に関わる人たちの間に闇の中で興奮したことを覚えています」とにこやきません。そこで、非染色で観察のできるSHG 浸透してきていると思います。一般的に知られかに語りながら当時を振り返る。を利用し、私たちの研究環境のアプリケーショうか。実はこの方法で観察した時にはもう1つ新しいシステムとの出会いの応用を視野に入れていますね」。 2007年に帰国して間もなく、日本でのSHGを注目に値します」と語る塗谷氏は、2004 年にコ利用した研究はオリンパスとの共同研究の形でロンビア大学のRafael Yuste教授のもとに留学始まることとなった。「Yuste 研の頃に比べて、して以来、SHGを活用した神経細胞の観察に計測のスピードが格段に早くなっていたことに加文を発表した。SHGの注目すべき特徴として塗取組んできた。この現象は2つの光子が中心対えて、ディテクタが非常に使いやすくなっている谷氏が指摘する定量性に着目した論文だ※2。膜称性を欠いて存在する物質と相互作用した後、のに驚きました。SHGはサンプルを透過して直電位変化が SHGによって定量的に測定できるこ入射光と同じ方向に進み2倍のエネルギーを持進するという性質を持っているので、ステージのとを示す実験結果がならぶ。これまで活動電位つ1つの光子へと変換されるというものだ。例え下に検出系が無いとうまく観察ができません。この測定はパッチクランプ法が主流だった。しかば、近赤外光を照射すると、可視光が発生するのため、Yuste 研では自分たちで検出系を取りし、パッチクランプの大きさ（1µm程度）のた付けて観察を行っていました。これに対して、オめに、それよりも小さい情報の入り口であるスパ Yuste 研では神経細胞細部の膜電位変化をリンパスのシステムは初めからステージの下に検インやその出口である軸索における電位の変化 SHGで捉えるという、SHGの利用法としてはそ出系がついており、非常に助かりましたね。こを観察することができなかった。そのため、スれまでにない方法に挑戦した。生命科学の塗谷れはオリンパスが初めてだと思います」。さらに、パインと軸索での電位変化はこれまで完全にブオリンパスのFV1000にデフォルトで備わっていラックボックスのままであった。SHGはここを解るポイントスキャン機能についてもその利便性のき明かすツールになり得ると塗谷氏は指摘する。高さを上げる。活動電位の測定はミリ秒単位の「アドレナリンやセロトニンといったものが神経測定になるため、視野全体をスキャンしてしまう細胞に入った時に、まず間違いなく神経細胞のと、その間に現象を見逃してしまうが、ポイント情報処理が変わります。それを捉えて、どういっスキャンはその心配がないという。こうして新たた変化が起こるのかということを知りたいというな挑戦への土台が整い始めた。のが本当のゴールです」。SHGを利用した塗谷 SHGは、2 つの光子（赤線）が中心対象性を欠いて分布する物質（黒線）と相互作用した後、入射光の丁度半分の波長を持った1つの光子（青線）へと変換される現象である。その特殊な発生条件のため、生体内では微小管やコラーゲン繊維のような構造体、あるいは形質膜に分布する色素などが SHG により選択的に可視化される。これを利用する事で、これらの部位における選択的な細胞情報の取得が可能となる。 * 08 広がる用途 SHGの特徴の1つにノンラベルの物質でも顕 700 SHG 40 20 0 Membrane Potential -20 600 -40 -60 1 2 3 4 5 6 7 8 Frame Number 10 60 650 550 D 80 9 10 8 80 6 60 4 40 2 20 0 -80 100 SHG Signal Change Voltage Change 0 20 -2 40 60 Time [msec] 80 0 100 -20 ンを広げることを考えています。特に脳腫瘍へ SHGという別の現象が起こっています。これが図 1　SHG の模式図 C Membrane Potential Change [mV] 胞外マトリックスの観察を行う場合、免疫染色を構成されたチームは見事膜電位の変化を捉えた（図１）。この光を観察するわけだ。 22 は実現できない測定だ。ただし、生体分子のいして共焦点顕微鏡で観察するといった方法がとているのは2 光子励起顕微鏡法ではないでしょ塗谷睦生氏（ぬりやむつお）【略歴】 2004 年　博士課程修了（P h . D . N e u ro s cie n c e , D r. R ic h a rd Huganir） D e p a r t m e nt of N e u ro s cie n c e , T h e Johns Hopkins University School of Medicine 2004 年〜 2007年　博士研究員 Department of Biological Sciences, Columbia University (Dr. Rafael Yuste) 2007年～現在慶應義塾大学医学部薬理学教室専任講師 B プローブが必要な通常の2光子励起顕微鏡法で氏をはじめとした、物理、化学のエキスパートで「2 光子顕微鏡を利用した細胞や組織の観察 A Membrane Potential [mV] Second Harmonic Generation 微鏡観察できることが挙げられる。これは蛍光 SHG Signal Change [%] 究 Average SHG Intensity [A.U.] 研神経細胞の情報変化に迫る 2010 年、塗谷氏らは1つのSHGに関する論図 2　神経細胞における Second Harmonic Generation イメージングとその応用による膜電位計測 A: マウス大脳皮質由来の分散培養神経細胞からの SHG 画像。神経細胞にFM 4- 64 色素を投与後、 950nm のフェムト秒レーザーを照射し、475nm の SHGシグナルを検出した。　B: Aの画像の黄線部位のズーム画像（5x）。樹状突起から出たスパインがSHG により観測されるのが分かる。　C: 神経細胞の細胞体から得られたSHGシグナルの膜電位依存性。フレームおきに細胞膜電位を変化させ（黒線）、同時に得られたSHGシグナルの平均値をプロットした（赤線）。膜電位変化に応じてSHG のシグナルが変化している事が分かる。　D: SHGイメージングによる膜電位変化の高速測定。パッチクランプした神経細胞の細胞体の一点にレーザーを固定し、ポイントスキャンを行った。細胞体への電流の注入により活動電位を発生させ（黒線）、それに応じたSHGシグナルの変化をプロットした。これにより、ミリ秒単位での定量的な膜電位のイメージングが可能である事が分かる。 ※ 1 Nuriya, M., Jiang, J., Nemet, B., Eisenthal, K. B., Yuste, R. (2006). Imaging membrane potential in dendritic spines. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 786-90. ※ 2 Nuriya, M.,Yasui, M. (2010). Membra ne potent ia l dy n a m ic s of a xons i n cu lt u red h ippo c a mpa l neurons probed by secondha rmonic-generat ion imaging. J Biomed Opt. 15, 020503. FV1000MPE.SHG ●FV1000MPEに関するお問い合わせオリンパス株式会社氏の研究成果が生命科学研究にどのような新し［所在地］本社　東京都新宿区西新宿 2-3-1 新宿モノリスいインパクトを与えるのか、これからの展開が楽［連絡先］TEL 03-6901-4040（ライフサイエンス事業部）しみだ。［U R L］http://www.olympus.co.jp/jp/lisg/bio-micro/ * 08 23