U.D.C. 543.545.07:577.133.5 マイクロチップ電気泳動解析用 i-チップ Development of “i-chip” for Microchip Electrophoresis System 渡辺博夫＊ Hiroo Watanabe 井筒 浩＊ Hiroshi Izutsu 渡辺健二＊＊ Kenji Watanabe これまで異質の領域であった半導体・マイクロマシンとバイオ関連分野が今マイク ロチップで融合しようとしている。半導体産業にとっては新しいアプリケーションの 開拓であり，バイオや医療分野にとっては，煩雑な分析・解析をマイクロチップ化す ることでコスト低減・迅速化を図りテーラーメード医療実現に向けた動きが今後加速 されると考えられる。このような背景のもと当社基盤技術であるプラスチック精密成 形加工技術と診断薬開発技術を応用してマイクロチップ電気泳（えい）動解析用 チップ i- を開発した。①検体試料の微量化，②測定操作の簡単・迅速化，③解析結果 のデジタル処理化を可能とし，DNAやRNAなど遺伝子断片の鎖長解析などにより遺伝 子診断への適用が可能である。 The semiconductor, micro-machine which were in the territory of the different quality so far, and biotechnology begin to unite by the microchip now. It is the reclamation of the new application for the semiconductor industry, and it can be planned for biotechnology and the medical field to realize cost reduction and speed up on complicated analysis by the microchip. It can think that the movement turned to tailormade medical realization by this will be accelerated from now on. Under such a background, we have developed an “ i-Chip” for the microchip electrophoretic analytical system by combination of two our company base technologies, high-precision plastic processing and developing diagnostic products. “i-Chip” can be applied to the gene diagnosis by the chain length analysis of DNA and RNA with the following features: ① minimized sample volume, ②quick measurement with simple procedures, ③digital management of the results of analysis. 〔１〕 緒 （アクララ社）から基盤技術を導入して実用化研究を進めた 言 結果，2000年10月に世界で初めてプラスチック製マイクロチ 近年，micro-Total Analysis System（µ-TAS）やLab-on-a- ップを用いた電気泳動解析システム（i-チップ/コスモアイ） chipと呼ばれる研究領域が関心を集めている。これは，半導 を上市した。これはマイクロチップ上に 3 本の独立した微小 体作成技術を発展させたMicro Electro Mechanical System 流路を形成したもので 1 回の電気泳動で 1 検体試料の解析処 （MEMS）技術を用いてガラスなどの基板上にミクロンオーダ 理を実施できるものである。さらに，この 3 レーンマイクロ ーの微小な流路を形成し，その流路内で流体を取り扱うため チップ電気泳動解析システムを改良し，特に検体試料処理能 にシステム化したデバイス，すなわちマイクロチップを用い 力を向上させた12レーンマイクロチップを開発し，2001年11 るものである。マイクロチップはその内部の微小空間の物理 月に12レーンマイクロチップ電気泳動解析システムとして新 的・化学的特性が従来の試験管などの化学反応容器中とは異 たに市場投入した。本報告では，12レーンマイクロチップお なり，極微量で桁（けた）違いに高速かつ効率良く化学反応 よび電気泳動用試薬の開発，そして製品特性について報告す や分析を行うことが可能である 1）。最初に報告されたマイク る。 ロチップはガラス基板上にエッチング法で微細溝を加工し， もう一枚のガラス板を張り合わせたもの 2）で実用的なもので 〔２〕 マイクロチップ電気泳動解析システム開発 2. 1 マイクロチップの製造 はなかった。 その後，1996年頃から米国のベンチャービジネスからガラ i-チップの製造工程を図１に示す。半導体製造工程で使わ ス基板及びプラスチック基板製のマイクロチップの実用化が れるフォトファブリケーション技術を用いてシリコン基板上 提案され開発競争が激化した。ガラス製マイクロチップを用 に微細溝形状を形成しシリコンマスタを作成した。金属ニッ いた解析システムは1999年秋の米国での学会で米国アジレン ケル電鋳を経て射出成形用金型を作成した。チップ成形用樹 トテクノロジーズ社（装置，マイクロチップはキャリパー社） 脂材料として，透明性（透過率≧90%） ，蛍光特性（低蛍光ノ が展示したものが最初である。一方，当社は米国ベンチャー イ ズ ） お よ び 親 水 性 な ど に 優 れ る PMMA（ Poly Methyl ＊ 当社 医薬品事業部門 遺伝子診断事業推進部 ＊＊ 当社 五所宮事業所自動車部品事業部門 自動車部品開発グループ 日立化成テクニカルレポート No.40（2003-1） 29 マスク シリコン エッチング シリコンマスタ ニッケル電鋳 金型 射出成形 成形チップ基板 ラミネート チップ 図１ マイクロチップの製造プロセス ニッケル電鋳金型を用いて射出 成形し，フィルムラミネートしてチップを製造する。 Fig. 1 Microchip Manufacturing Process Chips are manufactured by injection molding using nickel electroformed mold, and film-laminated. 図２ 12レーンマイクロチップ 12サンプルを同時に測定することができ る（外形寸法：縦92mm，横66mm，厚さ1.5mm，溝形状：幅100µm，深さ Methacrylate）を選択した。成形基材と同一材質のフィルム 30µm。溝を可視化するため黒線で描画してある。 ） で泳動用溝をカバーしてマイクロチップを作成した。このフ Fig. 2 Microchip with 12 lanes Twelve specimens can be tested simultaneously. The outer size of microchip is: 92mm (in length) ×66mm (in width) ×1.5mm (in thickness). The lane form of microchip is: 100µm (in width) x 30µm (in depth). Black lines are drawn to visualize each lane. ィルムカバー法としては接着剤を用いて接着する方法，超音 波溶着法，平板プレスまたは熱ロールラミネートによる圧着 法などが知られているが，成形品上に形成された溝形状確保， チップ寸法形状確保および貼付強度などを検討した結果，熱 ロールラミネート法によるフィルムカバー法を採用した3）（図 ２に12レーンマイクロチップを示す） 。 2. 2 マイクロチップとその微細形状 シリコン基板上に微細溝形状を形成する方法としては異方 性エッチング法やドライエッチング法などがあるが，溝形状 の寸法精度や表面平滑性に優れるドライエッチング法を採用 した。ドライエッチング法で作成したシリコンマスタから電 鋳金型を作成し，射出成形法によりマイクロチップ基板を作 成した。 図３に成形チップ基板の微細溝交差部の走査型電子顕微鏡 写真を示す。ドライエッチングシリコンマスタ由来金型で射 出成形した成形品は溝形状および表面平滑性に優れているこ とがわかる。これを超深度測定用レーザ顕微鏡で微細溝寸法 および表面平滑性を測定した。同一チップ内の微細溝部分 7 個所とチップロット間における同一微細溝部分の測定結果を 表１に示す。同一チップ内の微細溝間におけるバラつきはほ とんどなく，12レーンを同時に電気泳動する上で実用上問題 となることはない。一方，チップロット間では多少のバラつ きが認められたが，後述するように電気泳動用内部標準物質 の易動度にチップ間でバラつきが生ずるようなことはなく， 実用上問題となるものではなかった。 2. 3 試薬キットの開発 このマイクロチップを用いてDNAやRNAなどの遺伝子核酸 の鎖長解析を行うための試薬を開発した。これらの分析は従 来，アガロースまたはアクリルアミドなどの分離用固形ゲル 中で電気泳動分離するゲル電気泳動法で行われていたが，分 図３ マイクロチップ基板の微細溝交差部 離能，測定感度および測定時間などに難点があり，測定操作 部分も平滑性に優れている。 が煩雑なものであった。マイクロチップが持つその内部微小 Fig. 3 Cross Section of Minute Lanes on Microchip Substrate The surface of a chip substrate and lanes are highly flat and smooth. 空間の物理的・化学的特性を利用すると極微量で桁違いに高 30 日立化成テクニカルレポート No.40（2003-1） チップ基板表面と同じく溝 表１ 成形チップの寸法精度および表面平滑性 CV6%以上となり鎖長解析に比べて精度が低かった。この原 チップ間（ 3 製造ロッ ト各 3 枚の同一溝位置で計測） ，チップ内（同一チップ内 7 箇所の溝で計測） 因としては試料導入方法に定量性が欠けているためと考えら Table 1 れる。 Dimensional Accuracy and Surface Smoothness of Molded Microchips 2. 4 解析装置 Measurements were performed between chips (on the same lane of 3 chips from each 3 manufactured lots) and within chip (on 7 lanes of the same 1 chip). 溝寸法（µｍ） チップ間 チップ内 12レーンマイクロチップ電気泳動解析システムは専用電気 泳動解析装置とゲル・試料充填機から構成されている（いず 表面平滑性（µｍ） 上部 底部 深さ 溝底部 チップ基材 平面 平均値 103.6 71.49 30.44 0.14 0.04 標準偏差 2.67 0.50 1.99 0.02 − 平均値 101.74 71.57 29.19 0.12 0.04 標準偏差 0.81 0.21 1.04 0.01 − れの装置も日立電子エンジニアリング株式会社が開発製造元 で，前年に当社と共同開発した 3 レーンマイクロチップ電気 泳動解析システムをもとに改良を加えた） 。 〔３〕 製品特性 今回開発したマイクロチップ電気泳動解析システム（i-チ ップ/日立コスモアイ）の基本製品特性を表３に示す。従来法 のアガロースゲル電気泳動法に比べてサンプル処理能力，測 定感度，分離能いずれも格段に優れており，分析データのデ ジタル処理化が可能であるため，データ管理が極めて容易に 速かつ効率のよい分析が可能となるが，そのためにはマイク ロチップ電気泳動のための最適な試薬構成の検討が必要であ なった。また，i-チップは12レーンを同時に電気泳動するこ る。液状分離剤（ゲル） ，検出のための蛍光標識色素および とができるのでＡ社の同種製品に比べてもサンプル処理能力 電気泳動用緩衝液からなる構成試薬の中でも最も試薬性能を に優れており，電気泳動の条件設定も可変であることから使 左右するのは分離剤である。この分離剤に求められる特性は 用者にとってより使い勝手の良いシステムといえる。 マイクロチップの泳動用細溝中への充填（てん）性，電気泳 〔４〕 解析応用例 動解像度そして分析の再現性である。これらを評価指標とし て検討した結果，水溶性セルロース誘導体を分離剤として選 i-チップを用いて解析した応用例について述べる。図４は 択した。 大腸菌に感染するバクテリオファージφX174のDNAを制限酵 表２にDNA鎖長解析用キットを用いて測定した結果を示 素HaeⅢにより切断したDNA断片を電気泳動解析した結果を す。内部標準物質（50，800bpDNA）の易動度のばらつきは エレクトロフェログラムおよび擬似泳動パターンで示してい CV2%以下で，この標準物質の易動度をもとに計算したDNA る。従来法のアガロースゲル電気泳動法では分離できなかっ 断片試料の鎖長計算値は真の値に対し，誤差5%以下でそのば た 2 本のDNA断片をi-チップでは分離することが可能である。 らつきもCV1%以下と良好であった。一方，標準物質の蛍光 この分析手法を用いればPCR-RFLP（制限酵素切断片長多型 ピークの面積強度をもとにDNA断片試料の濃度を求めると 解析法）による病原細菌や有用微生物の分類に，感染症の疫 表２ DNA鎖長解析用キットの基本性能 チップ12枚（電気泳動溝144本）を用いて測定した。試料DNAの真の鎖長 およびカタログ濃度は試料1（267bp，3.4µg/l） ，2（489bp，6.1µg/l） ，3（658bp，8.3µg/l）である。 Table 2 Basic Performance of Kit for DNA Chain Length Analysis Twelve chips (144 lanes) were used for evaluation. True chain length and catalogue concentration for DNA samples are: Sample 1 (267 bp, 3.4µg/l), Sample 2(489 bp, 6.1µg/l), Sample 3(658 bp, 8.3µg/l). 内部標準DNA易動度（s） 表３ 性能比較 試料DNA鎖長計算値（bp） 試料1 試料2 試料DNA濃度計算（ng/µl） 50bp 800bp 試料3 試料1 試料2 試料3 測定平均値 81.9 161.3 266 493 633 3.1 3.7 6.1 変動係数（CV%） 1.3 2.0 0.73 0.36 0.62 7.8 6.4 6.1 システムの基本仕様および基本性能について従来法および他社品と比較した。 Table 3 Comparison of Specifications and Performance Specifications and basic performance of 項 システム 基本仕様 基本性能 目 i-Chip system were compared with those of other company's products and the conventional method. マイクロチップ電気泳動解析システム 従来法 i-チップ（12レーン）/コスモアイSV1210 A社バイオアナライザ アガロースゲル電気泳動法 光学検出系 レーザ蛍光検出（励起波長：635nm） レーザ蛍光検出（励起波長：635nm） 電気泳動 泳動条件可変（泳動電圧・時間・温度） 条件一定 ガラス（使い捨て） 電気泳動槽，高圧電源，泳動用 平板ゲルからなり，ゲル染色，撮 影，データ解析には別装置が必要 チップ材質 プラスチック（使い捨て） 必要サンプル量 1µl 1µl 10µl 処理能力 120（サンプル/h） 24（サンプル/h） 10（サンプル/h） 測定感度 0.1ng/µl（DNA） 0.1ng/µl（DNA） 1ng/µl（DNA） 分離能 5bp（DNA） 5bp（DNA） 20bp（DNA） 分析項目 DNA・RNA（タンパク質開発中） DNA・RNA・タンパク質 DNA・RNA・タンパク質・その他 日立化成テクニカルレポート No.40（2003-1） 31 で鎖長の離れた数種類の組み換え遺伝子を組み合わせること Size 5 ［bp］ 30,000 bp でマルティプレックスPCR解析も可能となる。 〔５〕 結 1072 1,353 1,078 872 1,353bp 20,000 572 DNAやRNAなど遺伝子核酸の鎖長を測定して遺伝子解析， ひいては遺伝子診断を行うためのマイクロチップ電気泳動解 蛍光強度 603 析システムを開発した。極微量の検体試料を用いて短時間に 281bp 310 281 271 234 194 271bp 10,000 0 100 150 泳動時間（s） 再現性良く測定解析結果を出すことができ，また従来法には ないデータのデジタル処理化も可能であることから今後，省 力化やIT化が求められる臨床検査分野などでの需要が見込ま れる。現在，遺伝子核酸に加えてタンパク質などを解析する 118 72 72bp 言 ための試薬キットの開発も進めており，この臨床検査分野で 72 のプラットフォーム化を促進させたい。 2％アガロースゲル （EtBrで染色） 今回開発したマイクロチップ電気泳動解析システムはµTASの中でもマイクロ流体制御技術にキャピラリー電気泳動 図４ マイクロチップ電気泳動装置による解析 アガロースゲル電気泳 法を用いている。そのため検体試料の定量的導入が困難で定 動では分離できないダブレット（271/281bp）が分離できる。 量性にやや欠点がある。一方，ゲル電気泳動分離を必要とし Fig. 4 Electropherogram Obtained by i-Chip Assay “i-Chip” system can separate peaks (271/281bp DNAs) in the electropherogram that cannot be separated with a conventional agarose gel electrophoresis. ないが高い定量性を求められる免疫反応や生化学反応などで はマイクロポンプやマイクロバルブなどのマイクロ流体制御 技術をチップに直接または間接的に取り入れることが可能で ある。今後，医療の現場では簡単，迅速で微量採血など患者 負担の少ないPOC（ポイント・オブ・ケア）化がより進み， 学調査などに，またPCR-VNTR/STR（繰り返し配列多型解析 マイクロチップを用いた臨床診断システムが標準化される日 法）による親子判定などDNA鑑定や食品の品種検定などにも もそう遠くないと予想されるので，その開発を促進したい。 利用することができる。 次に遺伝子組み換え食品における組み換え遺伝子検出への 応用例を示す。遺伝子組み換え大豆およびトウモロコシが含 まれている加工食品から所定の方法でDNAを抽出し，組み換 参考文献 1）北森武彦：計測・技術におけるマイクロ化学プロセス技術，ワー クショップ革新的部材産業創出プログラム講演要旨集（主催；経 え遺伝子に特異的なPCR増幅用プライマを用いて増幅し，iチップの両端の泳動溝1および12に100bpのDNAラダーマーカ 済産業省，NEDO） ，171-177（2002） 2）D.J.Harrison他：Capillary Electrophoresis and Sample Injection を，泳動溝 2 から11に増幅産物を泳動した。図５に解析結果 Systems Integrated on a Planar Glass Chip, Analytical Chemistry, として得られる擬似泳動パターンを示す。食品加工時に原料 Vol.64, 1926-32（1992） 作物中のDNAが細断化されてしまうために遺伝子増幅は100 3）渡辺健二ほか：電気泳動用チップとその製造方法，該電気泳動用 〜150bp程度の短い鎖長領域で実施される。従来法のアガロ チップを用いた電気泳動装置および荷電性物質の分離方法，特開 ースゲル電気泳動法ではこの鎖長領域の正確な分析が困難で 2000-310613〜5 あるが，i-チップでは5bpの鎖長差を十分に分離解析できるの レーンNO. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 bp 800 700 600 1 100bp・Ladder 2 大豆・トウモロコシ組換遺伝子 − − P35S1 95 大豆組換遺伝子 PRS01 115 4 大豆内存性遺伝子 Le1n02 114 400 5 トウモロコシ組換遺伝子 Bt113 125 6 トウモロコシ内存性遺伝子 SSIIb 146 7 トウモロコシ組換遺伝子 NOSIIb 151 8 トウモロコシ組換遺伝子 P35S 97 9 トウモロコシ組換遺伝子 T251 146 10 トウモロコシ組換遺伝子 E1762 91 11 トウモロコシ組換遺伝子 M8102 106 12 100bp・Ladder − − 100 50 組み換え遺伝子のPCR増幅産物を〜5bpの解像度で分離できる。 Fig. 5 Application for Inspection of Genetically-modified Foods PCR amplified products from modified genes can be separated with resolution of 〜5 bp (represented as gel-like image). 32 遺伝子名 解析サイズ（bp） 3 200 遺伝子組み換え食品検査への応用 品種 500 300 図５ レーンNO. 日立化成テクニカルレポート No.40（2003-1）
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