清酒酵母の遺伝子組換え 技術の進展と展望 赤田倫治 山口大学工学部 ｢よい清酒はよい酵母から｣ ｢よい清酒はよい酵母から｣ 酵母ゲノム ｢よい清酒はよい酵母から｣ 酵母遺伝子 FAS2 ATF1 --- 遺伝子組換え酵母のお 酒を飲みたいですか？ GREEN COOP どうすれば組換えのお酒 を飲んでもらえるか 遺伝子組換え微生物食品の不安 食品用組換え微生物 プラスミド 大腸菌DNA 抗生物質耐性遺伝子 導入用 マーカー 病原性微生物 有用遺伝子 ？ 自然形質転換をおこなう病原性細菌類 Species from clinical isolates Campylobacter jejuni Campylobacter coli Haemophilus influenzae Haemophius parainfluenzae Helicobacter pylori Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Streptococcus sanguis Streptococcus mutans Lorenz and Wackernagel, 1994を改変 Transformation frequency (transformants/viable cell) 2.0 x 10-4 1.2 x 10-3 7.0 x 10-3 8.6 x 10-3 5.0 x 10-4 1.0 x 10-4 1.1 x 10-2 5.5 x 10-6 2.9 x 10-2 2.0 x 10-2 7.0 x 10-4 遺伝子除去技術の開発 遺伝子組換え微生物の不安を除くことから着手 不要大腸 菌プラスミ ドDNA 解決 有用遺伝子 有用遺伝子 マーカー遺伝子 不要DNA配列の除去 不要抗生物質耐性遺伝子 不安な遺伝子を抜く方法 ガラクトース誘導 増殖阻害遺伝子 GAL10 OFF グルコース培地：正常 GIN11 promoter ON 増殖できない ガラクトース培地 増殖 染色体末端近くの配列の過剰発現は 酵母の増殖を止める GIN11配列 テロメア cen X Y' Subtelomeric region C1-3A repeat GIN11はtelomeric X-element の配列 GIN11 cen X Y' Telomere (C1-3A)n cen Subtelomeric region 1 GATCAATAAC AGTGTTTGTG GAGCATTTTC TGAATACAAT AAACCCAAAA CAGAAACTTC CCTTTTGTAT CACTGTTCTG 81 GAAAAGGGGT GGGCGGTAAT AAAGCTAATA GGGTGTGTCC ATAAGTAATA CTGAACTTGG AAATGTGCGG CTTTGCAGCA 161 TTTTGTCTTT CTATAAAAAT GTGTCGTTCC TTTTTTTCAT TTTTTGGCGC GTCGCCTCGG GGTCGTATAG AATATGCGTC 241 ACTTTTAAAA ATAAGATTGC AGATCAGGGC AAAACAAGTA GCAAATCATA GCAAGAGACC CTGATTTTTG TGACATAAAT 321 ATTTTTACTT CTGTGTTAGG TTAACTTTTT ATGTAACTGT AAATGGAATA GAGTTGAGGG GATAGTGCCC ACAAGTCAAT 401 ATGTTTATTT TGTAAAGTTG AAAGATAATT ATTTTTATGT TTAGGTGATT TTGGTGTTGA ATTTTCTGTA ATATTAACAT 481 AAGAGTAATA CATTGAGTGG TTAGTATATG GTGTAAAAGT GGTATAACGC ATGTATTAAG AGCAGTTATA CAATATTTGG 561 GGCCGCTGAA TGAGATATAG ATATTAAAAT GTGGATAATC ATGGGCTTTA TGGGTAAATG GAACAGGGTA TAGACCACTG 641 AGGCAAGTGC CGTGCATAAT GATATGAGTG CATCTAGT ガラクトース液体培地でGIN11プラスミドは抜け落ちる Plasmid loss rate (%) 80 コントロール プラスミド p315GAL 60 40 GIN11を発現 させたプラスミ ド 20 pGL108 0 0 5 10 15 Time (hr) 20 25 協会７号 増殖阻害遺伝子導入 組換え協会７号 ガラクトース培地 生えている酵母では不要 遺伝子が抜けている！ FAS2変異遺伝子は香気成分を増加させる 脂肪酸合成酵素(Fatty acid synthase) F A S 2 1 GGT⇨AGT 1250Gly⇨Ser 1887 FAS2-1250S 香気成分カプロン酸エチルの増加 吟醸香 除去選択マーカー （増殖阻害遺伝子） GAL10 promoter Amp ori GIN11 pAURFAS2-6 導入用マーカー 12566 bp AUR1-C Af l I I Nde I FAS2-1250S ∆NC * Mutation site 遺伝子組換えで評判の清酒酵母株と全く同じ株を作成できる 除去選択用マーカー 導入用マーカー （オーレオバシジン培地） GIN11 AUR1 pAURFAS2-6 S 第１段階 遺伝子導入 染色体 DNA 遺伝子導入体の選択 正常FAS2遺伝子 GIN11 AUR1 染色体への挿入 S S AUR1 GIN11 GIN11 AUR1 遺伝子除去体の選択 （ガラクトース培地） 第２段階 相同組換え 不要配列の 除去 不要配列が脱落 S YPgal培地で選択 S S FAS2-1250S変異株 GIN11 AUR1 変異株の塩基配列 A T G C A/G G TTCTG G TATG ⇨正常遺伝子 G TTCTAG TATG ⇨変異遺伝子 FAS2-1250S 酵母兄弟 兄 弟 S 薬剤耐性遺伝子 薬剤耐性遺伝子 FAS2-1250S S セルレニン耐性変異株 スクリーニングで作成 醸造した芳醇な清酒は市販中 FAS2-1250S S ２段階遺伝子組換えで作成 厚生労働省確認済 セルフクローニングと呼ぶ （自分に自分の遺伝子を入れること） 表 3．セルフクローニング審査事情 審査年月日 申請者 審査対象 審査結果 備考 再検討 13.2. 2 山口県産業技術センター セルフクローニング清酒酵母 追加資料 13.4. 27 山口県産業技術センター セルフクローニング清酒酵母 該当する 13.6. 26 ジェネンコア α-アミラーゼ，グルコースイ 追加資料 ソメラーゼ生産菌 協和醗酵工業 イノシン酸二ナトリウム，グア 該当する ニル酸二ナトリウム生産菌 13.9. 18 ノボザイムジャパン グルコアミラーゼ生産菌 該当しない 味の素 酸性フォスファターゼ生産菌 該当する ジェネンコア グルコースイソメラーゼ生産菌 該当する 13.11.13 ジェネンコア 14.1. 30 α-アミラーゼ生産菌 三栄源エフ・エフ・アイ キサンタンガム生産菌 該当する 該当する 再検討 2003年春 世界最初に市販された遺伝子組換え酵母のお酒 表示の義務はないのだが， 見せられないのが悲しい。 今までと同じ酵母 なら意味がない？ 実用化のための酵母遺伝子組換え技術開発 方法をシェイプアップ プラスミド マーカー遺伝子 有用遺伝子 Start プラスミド Ｇｏａｌ プラスミド 薬剤耐性遺伝子 （1）導入用マーカー （2）マーカー除去法 ［GALp-GIN11］ 導入用マーカー Table 1. Drug resistance markers Marker kanr Mdhfr CAT aroA hph cyh2 Tn5ble PDR4 P45014DM ARO4 ? AUR1 SMR1 SFA1 LEU4-1 FZF1-4 PDR3-9 hphMX natMX patMX Selection drug Reference Hadfield et al., 1990; Wach et al., 1994 Zhu et al., 1986 chloramphenicol Hadfield et al., 1986 glyphosate Kunze et al., 1989 hygromycin B Gritz and Davies, 1983 Del Pozo et al., 1991 cycloheximide phleomycin Wenzel et al., 1992 cerulenin Nakazawa et al., 1993 triazole Doignon et al., 1993 fluorophenylalanine Shimura et al., 1993 lipid hydroperoxide Inoue et al., 1993 aureobasidin A Hashida-Okado et al., 1996 sulfometuron methyl Casey et al., 1988; Xie and Jiménez, 1996 formaldehyde Van den Berg et al., 1997 trifluoroleucine Bendoni et al., 1999 sulfite Park et al., 1999 cycloheximide Lacková and Subík, 1999 hygromycin B Goldstein and McCusker, 1999 nourseothricin Goldstein and McCusker, 1999 bialaphos Goldstein and McCusker, 1999 G418 methotrexate 薬剤耐性マーカーによる形質転換の問題点 1. 低い形質転換効率 2. バックグラウンド耐性変異株の出現 3. 蛋白合成阻害剤とマーカー遺伝子発現の拮抗作用 4. プレーティング前の非選択培地での培養 5. 酵母遺伝子との相同組換え（酵母変異遺伝子マーカー） 高発現YAP1カセット YCpプラスミド A RS/ CEN URA 3 Amp YAP1 YAP1 YCp- PGKp- YAP1 Or i PGK3 ' プロモーター PGK5 ' PGK プロモーター 恒常的高発現 YAP1 YIpプラスミド YAP1 PGK URA 3 Amp プロモーター Or i YIp- PGKp- YAP1 酸化ストレス耐性 薬剤耐性 H2O 2 diamide 金属耐性 cadmium cycloheximide sulfometuron methyl 1,10-phenanthroline PGK3 ' PGK5 ' PGK プロモーター YAP1 YAP1はcycloheximideとceruleninに耐性を示すが 他の薬剤には耐性能を示さない。 Cycloheximide 0.1 0.5 1 5 Cerulenin 0.5 10 1 2 4 8 (µg/ml) W303-1A (control) YCp-PGKp-YAP1 YIp-PGKp-YAP1 Aureobasidin 0.05 0.1 0.2 W303-1A (control) YCp-PGKp-YAP1 YIp-PGKp-YAP1 0.4 Geneticin 100 200 400 Nystatin 5 10 20 Amphotericin 1 5 10 高発現型YAP1の形質転換効率 120 形 質 転 換 効 率 (%) YCp YIp 100 80 60 40 20 0 -Ura 0.5 1 0.5 1 0.5 1 2 4 2 (μg/ml) SD YPD SD シクロヘキシミド セルレニン 選択培地 YPD 培地 薬剤 脂肪酸合成阻害剤セルレニンで高率の形質転換が可能 しかし、濃度が低いとバックがでる プラスミドあり セルレニン 1.0 μg/ml プラスミドなし 他の薬剤培地へのレプリカによる真の形質転換体の確認 形質転換用セ ルレニンプレ ート シクロヘキシミド レプリカ オーレオバシジン レプリカ プラスミド あり プラスミド なし プラスミドなしにも コロニーが出現する =薬剤耐性変異体 プラスミド導入体はシ クロヘキシミドに耐性 だが，ほとんどの耐性 変異体は感受性 プラスミド導入体はオー レオバシジンに感受性だ が，シクロヘキシミド耐 性変異体はこれにも耐性 遺伝子導入と除去選択が可能な pGG119ベクター 除去選択マーカー GALp-GIN11M86 PGKp-YAP1 導入選択マーカー 実用化のための酵母遺伝子組換え技術開発 方法をシェイプアップ プラスミド マーカー遺伝子 有用遺伝子 Start プラスミド Ｇｏａｌ プラスミド 薬剤耐性遺伝子 （1）導入用マーカー ［PGKp-YAP1］ （2）マーカー除去法 ［GALp-GIN11Ｍ86］ 今までと同じ酵母なら意味がない？ 遺伝子組換えを使わなければ できないおいしい清酒酵母 FAS2の1250番目をAla, Thr, またはCysにする FAS2アミノ酸配列 N末側⋯ 1250 ⋯ C末側 Gly-Ser-Gly-Met-Gly-Gly-Val H C H O H H O N C C H H H H C H O C N C H O H S C C C N H H H C N H H H C H H O N C C O H H C C N H H H H O N C C C C O H C 1250番目 の側鎖 1250G 1250S 1250A 1250T 1250C Gly Ser Thr Cys Ala H H C H O H カプロン酸エチル 野生型 高生産 C H H H H H C C O H H ？ C H H H S H H C H H H H H PCRを利用した部位特異的変異導入 野生型 1250G (Gly) 高生産型1250S (Ser) 1250A (Ala) 1250T (Thr) 1250C (Cys) Gly GGT --------- Ser TCT --------- Gly GGT AGT GCT ACT TGT Met ATG --------- Gly GGT --------- Gly GGT --------- Ampr GALpGIN11M86 Ori ApaI NotI XhoI PGKpYAP1 pGG119FAS2 NheI 14.3 kb FAS2-1250 SalI/XhoI AflII SphI Mutation NruI FAS2C counter-selected NruI FAS2A counter-selected Integration 8 kb Kyokai no. 7 pGG119-FAS2A integrant * FAS2C counter-selected ｐGG119FAS2 FAS2A counter-selected Kyokai no. 7 pGG119-FAS2A integrant Southern analysisによるプラスミドの導入と除去の確認 * 22 kb NruI NruI Homologous recombination * or Counter-selection * or NruI 8 kb Wild-type FAS2 NruI NruI 8 kb Mutant FAS2 kb 10 8 7 6 NruI FAS2 probe probe FAS2 pBluescriptprobe pBluescript probe 除去選択株は野生型または変異型FAS2のどちらかを持つ ＜小仕込分析結果＞ 菌株 K7 1250S 1250A 1250C FAS2-1250 Gly Ser Ala Cys もろみ日数 27 25 27 27 Alcohol (%) 15.5 15.3 15.2 15.5 日本酒度 +9.3 +8.9 +9.2 +11.4 1.0 4.9 3.4 6.1 カプロン酸エチル (ppm) おいしい酵母と実用的遺伝子操作技術 FAS2-1250 酵母兄弟 FAS2-1250S FAS2 S 薬剤耐性遺伝子 薬剤耐性遺伝子 FAS2 FAS2-1250S H C H O S H 4.9 ppm 1.0 ppm FAS2-1250C FAS2-1250A A C 薬剤耐性遺伝子 薬剤耐性遺伝子 薬剤耐性遺伝子 薬剤耐性遺伝子 FAS2-1250A A 従来の変異 選択法でも なんとかなる C H C H H 3.4 ppm FAS2-1250C C H H S H 6.1 ppm 組換え技術 を使わない と作れない アルコールアセチルトランスフェラーゼ（ATF1） の過剰発現をセルフクローニングで Ampr GALp-GIN11M86 SacI SacII NotI XbaI Ori PGKpYAP1 pGG119TDH3pATF1 5' upstream of ATF1 11.2 kb ATF1? C SphI TDH3 promoter 過剰発現プロモータのセルフクローニング Ladder 23 Counterselected 1857 1858 1859 1861 kb B 1809 Integrant 1857 1858 1861 CounterIntegrated selected 1807 1808 1809 Kyokai no.7 1857 1858 1861 CounterIntegrated selected 1807 1808 1809 Kyokai no.7 A 12 kb 3 2 ATF1 probe 醸造結果 Strain Kyokai no. 7 pGG119TDH3p-ATF1 TDH3p-ATF1 pBluescript KS+ probe Days Sake meter 27 +9.3 27 +9.0 28 +8.8 Alcohol Isoamyl (%) acetate(ppm) 15.5 4.9 15.5 15.4 15.5 24.2 協会７号 ・FAS2-1250C ・TDH3p-ATF1 まだ市販されていません。 結局，実用酵母の遺伝子操作は 研究室酵母に比べて 扱いにくい 1990年代の酵母研究 実用酵母は二倍体 多くは胞子形成能がなく一倍体が取れない 遺伝的解析が不自由 二倍体では劣性変異体取得が困難 二倍体では交配も困難 ２倍体で劣性変異が取れないと考えていたわけ １倍体酵母 変異 変異が取得できる 10-4 ２ 倍 体 酵 母 変異 形質として現れない 10-4 変異 変異 変異が同時に起こる確率は 10-4 x 10-4 =10-8 ｶ･ ｶ･ ｦ･ ･i ･ ･ j ･生存率％ 変異誘発による生存率 100 ２倍体 １倍体 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 照射時間 (s) UV照射 25 30 栄養要求性変異株の取得方法 UV照射 酵母菌 培養 レプリカ YPD培地 （栄養培地） MM培地 （最小培地） YPD培地に生育できてMM培地に生育できないものを探す 栄養要求性変異株 UV 照射による変異誘発率 親株 協会7号 協会7号Ｈ 協会9号 協会10号 協会701号 協会901号 生存率(%) 調査数 変異株数 変異取得率(%) 22.0 17.8 19.3 13.4 9.9 8.1 3422 1885 1696 3046 2147 2998 2 1 1 2 3 6 0.06 0.05 0.06 0.07 0.14 0.20 高頻度の「Loss of heterozygosity」で説明できる 変異 染色体欠失 10-1～10-2？ 10-4 遺伝子変換 体細胞交叉 栄養要求性関連遺伝 子を約100とすると 100 x 10-4 x 10-1=10-3 1000個に1個の割合 取得した栄養要求性変異株 取得株名 親株 RAK1536 協会7号 Histidine RAK1537 協会7号 Methionine RAK1546 協会7号 Histidine+lysine RAK1763 協会701号 Leucine RAK1764 協会701号 Arginine RAK1785 協会701号 Uracil RAK1786 協会10号 Methionine RAK1787 協会10号 Tryptophan RAK1788 協会9号 Tryptophan RAK1922～ RAK1927 協会901号 Tryptophan 栄養要求性の種類 栄養要求性相補遺伝子 取得株名 親株 RAK1536 協会7号 Histidine HIS3 RAK1537 協会7号 Methionine RAK1546 協会7号 Histidine+lysineLYS4 RAK1763 協会701号 Leucine RAK1764 協会701号 Arginine RAK1785 協会701号 Uracil RAK1786 協会10号 Methionine RAK1787 協会10号 TryptophanTRP3 RAK1788 協会9号 Tryptophan RAK1922～ RAK1927 協会901号 TryptophanTRP3 栄養要求性と相補遺伝子 LEU4 (RAK1926以外） 研究室酵母並みの遺伝子操作技術 １段階での実用化 Start 有用遺伝 子の開発 Goal 有用遺伝子 HIS3 除去の必要なし 有用遺伝子 HIS3 his3-変異株 90年代の方法 プラスミド プラスミド 薬剤耐性遺伝子 PGKp-YAP1 プラスミド PGKp-YAP1 導入用マーカー 効率よい確実な導入体選択法 外来DNA除去 ［PGKp-YAP1］ ［セルレニンとシクロヘキシミド耐性］［GALp-GIN11M86］ LEU2 Apa I Xho I ATF1 pSKHIS3-ATF1 10649 bp Sph I Sac I Sac II Not I Xba I TDH3p HIS3 Sal I Sma I BamH I ATF1 5' noncoding kb TDH3p-ATF1の 作成法も変わる 10 8 6 5 4 3 2 1 .5 香気成分の測定（ppm） K7 香気成分 酢酸イソアミル カプロン酸エチル 5.7 0.65 RAK1536 RAK1884 K7 his3- K7 TDHp-ATF1 5.9 15.4 0.64 0.89 研究室酵母並の遺伝子操作を清酒酵母で A. 不要なDNA配列を除去する セルフクローニング プラスミド (大腸菌) 薬剤耐性遺伝子 有用遺伝子 B. DNAを除去する必要がない セルフクローニング 栄養要求性 相補遺伝子 有用遺伝子 不要配列 除去 実用化可能 実用化可能 栄養要求性変異 （醸造酵母） 栄養要求性遺伝子を利用した醸造酵母遺伝子操作 +40merプライマー HIS3 過剰発現 +40merプライマー プロモータ PCR 40mer HIS3 過剰発現型 TDH3 プロモータ 40mer 酵母染色体 酵母染色体 HIS3 過剰発現型 TDH3p-XXX1 Systematic Selfcloning! PCR産物の挿入もできることはできるが ATF1-401 ATF1-402 HIS3 RAK 2196 TDH3p PCR 40 bp HIS3 TDH3p 40 bp kb 3 2 ATF1 HIS3 TDH3p そんなにうまく はいかない ATF1 2.0 kb TDH3-160 NotI-ATF1 ２倍体以外に研究室酵母とどこが違う？ 基本的な研究室酵母株 BY4741（１倍体） MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 BY4742 （１倍体） MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 lys2Δ0 BY4743 （２倍体） MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 LYS2+ MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 MET15+ lys2Δ0 協会７号でこんな株を作れば自由自在な遺伝子操作ができる 基本的な研究室酵母株 BY4741 MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 BY4742 MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 lys2Δ0 BY4743 MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 LYS2+ MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 MET15+ lys2Δ0 １倍体で劣性変異が取得できる。 １倍体同士の接合で２倍体ができる。 ２倍体の胞子形成で１倍体ができる。 栄養要求性マーカーが揃っている。 遺伝子操作ができる。 ATG STOP URA3 ura3Δ0 デルタ０ ＝全くない ゼロ メリット１：URA3で形質転換ができる。 メリット２：URA3マーカーはURA3に入ることがない。 つまりターゲッティングができる。 メリット３：5-FOA培地でURA3の除去ができる。 URA3 マーカー 相同組換え ATG STOP ura3*変異 酵母株 ura3変異株ではURA3マーカーが変異部位 へ挿入されてしまう。 URA3 マーカー ura3Δ0 デルタ０ 株には決して入らない ⇒挿入したい場所へターゲッティングできる！ ゼロ 協会７号のura3Δ株の作製 プライマー 設計 URA3-401 URA3-402 URA3 URA3-401: atcaaagaaggttaatgtggctgtggtttcagggtccataggcgcgcccg URA3-402: ttttttcgtcattatagaaatcattacgaccgagattcccggcagtattg テンプレート ｐScHIS3TDH3p ｐScLYS4TDH3p atcaaaga aggttaat gtggctgt ggtttcag ggtccata ggcgcgcc cg ttt tt tcg t cat ta tag aaa t cat ta cga ccg ag att ccc gg cag atcaaaga aggttaat gtggctgt ggtttcag ggtccata ggcgcgcc cg tat tg ttt tt tcg tca tt ata gaa atc att acg a ccg aga t tcc cg gca gta ttg 基本的な研究室酵母株 BY4741 MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 BY4742 MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 lys2Δ0 BY4743 MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 LYS2+ MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 MET15+ lys2Δ0 １倍体で劣性変異が取得できる。 １倍体同士の接合で２倍体ができる。 ２倍体の胞子形成で１倍体ができる。 栄養要求性マーカーが揃っている。 遺伝子操作ができる。 LOH (Loss of heterozygosity) MATa/MATa MATa/MATα ⇒ or MATα/MATα ヘテロはホモになりやすい 変異株からのａ型･α型株の取得方法 メチオニン要求性 1倍体テスター株 ａ型 栄養培地 栄養培地 レプリカ レプリカで 混合する ロイシン要求性 の醸造酵母 a/ U V 照射(20秒間) 栄養培地 栄養培地 栄養欠損培地 交配可能変異株とテスター株との交配 RAK1763 協会701号由来ロイシン要求性株 UV（秒） 生存率(%) スクリーニング数 20 0 15.4 - 864 639 a型 (%) α型 (%) 32 (3.8) 1 (0.2) 38 (4.5) 0 (0) 『桜酵母』と協会酵母の変異株 株名 由来 栄養要求性変異 交配型 RAK2150 桜酵母 ウラシル a/a RAK1595 協会7号 ヒスチジン・リジン α/α RAK1600 協会701号 ロイシン α/α RAK1606 協会9号 トリプトファン α/α RAK1613 協会901号 トリプトファン α/α RAK1618 協会10号 トリプトファン α/α 桜酵母 Uraaa型 αα型 協会7号 His-/Lys- 協会701号 Leu協会9号 Trp- 協会901号 Trp協会10号 Trp- 最少培地 K7 1562 K7 his/lys a型 1583 交配株 1562+1583 ４倍体がで きている α/α体の取得 a/a体の取得 URA3をHIS3で置換 URA3を LYS4で置換 FOA FOA ウラシル、リジン要求性 ウラシル、ヒスチジン要求性 研究室酵母並の遺伝子操作 を酵母ゲノムで利用すれば 出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae 真核生物で最初のゲノム シークエンス 1996年 12,068ｋｂ 600人以上の研究者によ る国際プロジェクト 清酒ゲノムも完成 パン酵母 清酒酵母 ワイン酵母 焼酎酵母 ビール酵母 栄養要求性遺伝子を利用した醸造酵母の遺伝子操作 合成DNA プライマー HIS3 過剰発現 プロモータ 合成DNA 注文3日で プライマー 1本約３000円 PCR HIS3 過剰発現型 TDH3 プロモータ PCR機器で3時間 形質転換実験3時間 酵母染色体 酵母染色体 HIS3 過剰発現型 TDH3p-XXX1 増殖3日 酵母遺伝子6000個を操作できる技術 URA3 TDH3p Chromosome 1 URA3 TDH3p Chromosome 2 URA3 TDH3p Chromosome 3 Confirmation of URA3-TDH3p fragment insertion RAK2336 (α/α) ATF1 ATF2 SLI1 kb marker W T W T W T RAK2359(a/a) ATF2 SLI1 ATF1 W 3 0.5 Colony-PCR T W T W T α/α ura3Δ::HIS3/ ura3Δ::HIS3 a/a ura3Δ::LYS4/ ura3Δ::LYS4 his3/his3 lys4/lys4 Mating α/α/a/a XXX1 YYY1 Tetraploid α/ α lys4/lys4 RAK 2336 TDH3p -ATF1 Minimal medium TDH3p -ATF2 TDH3pSLI1 TDH3p TDH3p TDH3p -SLI1 -ATF2 -ATF1 a/a his3/his3 RAK 2359 Flavor XXX1 XXX2 Taste YYY1 YYY2 Ethanol ZZZ1 XXX1 ZZZ2 ・・・・ ・・・・・・ Flavor XXX2 ・・・・・・ YYY1 ・・・・・・ YYY2 ・・・・・・ ZZZ1 ・・・・・・ ZZZ2 ・・・・・・ ・・・・ ・・・・ ・・・・ Taste Ethanol ・・・・ ・・・・ ・・・・ ・・・・ ・・・・ ・・・・ ・・・ PCR 変異醸造酵母 へ形質転換 醸造 遺伝子１ お酒1 遺伝子2 お酒2 遺伝子3 お酒3 遺伝子4 お酒4 遺伝子5 お酒5 遺伝子6 お酒6 遺伝子7 お酒7 遺伝子8 お酒8 遺伝子9 お酒9 遺伝子１0 お酒10 遺伝子１1 お酒11 遺伝子１2 お酒12 遺伝子6000 お酒6000 ゲノム酒へ おいしければ飲んでもらえるのか？ S-Adenosylmethionine 様々な肝臓疾患に治療効果 エタノールによる肝障害が緩和 肝硬変患者の死亡率減少 鬱病治療 骨関節症治療 癌治療 大量生産が必要 清酒酵母はもともと高生産 さらなる高生産へ Mizunuma M, Miyamura K, Hirata D, Yokoyama H, Miyakawa T. Involvement of S-adenosylmethionine in G1 cell-cycle regulation in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA. 101: 60866091, 2004 sah1T279I 分子生物学から清酒酵母育種へ Mizunuma et al., PNAS 101, 6086, 2004 sah1T279I MSAPAQNYKIADISLAAFGRKEIELAEHEMPGLMAIRKAYGDVQPLKGARIAGCLHMTIQ TAVLIETLVALGAEVTWSSCNIYSTQDHAAAAIAASGVPVFAWKGETEEEYLWCIEQQLF AFKDNKKLNLILDDGGDLTTLVHEKHPEMLEDCFGLSEETTTGVHHLYRMVKEGKLKVPA INVNDSVTKSKFDNLYGCRESLVDGIKRATDVMLAGKVAVVAGYGDVGKGCAAALRGMGA T279I RVLVTEIDPINALQAAMEGYQVVTMEDASHIGQVFVTTIGCRDIINGEHFINMPEDAIVC NIGHFDIEIDVAWLKANAKECINIKPQVDRYLLSSGRHVILLANGRLVNLGCATGHSSFV MSCSFSNQVLAQIALFKSNDKSFREKHIEFQKTGPFEVGVHVLPKILDEAVAKFHLGNLG VRLTKLSKVQSEYLGIPEEGPFKADHYRY* Table 1. Cellular contents of AdoMet and AdoHcy in wild-type and sah1-1 cells O medium YPD Wild type sah1-1 Wild type sah1-1 AdoMet, nmol/mg cells ND 1.95 0.36 13.40 AdoHcy, nmol/mg cells ND 0.31 0.16 1.35 The content of AdoMet and AdoHcy were measured using early log-phase growing cells (OD660 of 0.2 0.3) of wild-type (DHT22—1b) and sah1—1 (YMM222) strains in YPD or O medium. The values are means from two independent experiments. ND, not detected. Mizunuma et al., PNAS 101, 6086, 2004 Standard Name SAH1 Systematic Name YER043C Feature Type ORF, Verified Description S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, catabolizes S-adenosyl-Lhomocysteine which is formed after donation of the activated methyl group of S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) to an acceptor Name Description S-Adenosyl-l-Homocysteine hydrolase Molecular Function adenosylhomocysteinase activity (ISS) Biological Process methionine metabolic process (NAS) selenocysteine metabolic process (NAS) Pathways S-adenosylhomocysteine catabolism Systematic deletion inviable ATGTCTGCTCCAGCTCAAAACTACAAAATCGCTGATATCTCTTTGGCTGCCTTCGGTAGA AAGGAAATCGAATTGGCTGAACATGAAATGCCAGGTTTGATGGCCATCAGAAAGGCTTAC GGTGACGTCCAACCTTTGAAAGGCGCCCGTATTGCTGGTTGTTTGCACATGACCATTCAA ACTGCTGTTTTAATTGAAACTTTAGTTGCTTTGGGTGCCGAAGTTACCTGGTCCTCTTGT AACATCTATTCGACTCAAGATCATGCCGCCGCTGCTATTGCCGCTTCCGGTGTTCCAGTT TTTGCCTGGAAGGGTGAAACTGAAGAAGAGTATTTGTGGTGTATTGAACAACAATTGTTT GCCTTCAAGGACAACAAGAAATTGAACTTGATCTTAGATGATGGTGGTGATTTAACCACT TTAGTTCATGAAAAGCACCCTGAAATGCTGGAAGACTGCTTTGGTCTTTCCGAAGAAACT ACCACCGGTGTTCACCACTTATACAGAATGGTCAAAGAAGGCAAGTTAAAGGTTCCTGCC ATTAACGTTAACGACTCCGTCACTAAGTCCAAGTTTGACAACTTGTACGGCTGTAGAGAA TCCTTAGTCGACGGTATTAAGAGAGCCACTGATGTCATGTTGGCTGGTAAGGTTGCCGTT GTTGCTGGTTACGGTGATGTCGGTAAGGGTTGTGCTGCTGCCTTAAGAGGAATGGGTGCT CGTGTCTTGGTTACCGAAATTGACCCAATCAACGCTTTACAAGCTGCCATGGAAGGCTAC CAAGTTGTTACCATGGAAGATGCATCCCACATTGGTCAAGTTTTCGTTACCACCACTGGT TGTAGAGATATTATCAACGGTGAACATTTCATCAACATGCCAGAAGATGCCATTGTTTGT AACATTGGCCATTTCGATATCGAAATTGATGTCGCCTGGTTAAAGGCTAACGCTAAAGAA TGTATTAACATCAAACCACAAGTCGACCGTTACTTGTTGTCTTCTGGTAGACACGTCATC TTGTTGGCTAACGGTAGATTAGTTAACTTGGGTTGTGCTACTGGTCACTCATCTTTCGTT ATGTCTTGTTCCTTCTCTAACCAAGTCTTAGCTCAAATTGCTTTGTTCAAGTCTAACGAT AAGTCTTTCAGAGAAAAGCACATTGAATTCCAAAAGACAGGCCCATTCGAAGTTGGTGTC CACGTTTTGCCAAAGATCTTGGATGAAGCTGTCGCTAAGTTCCACTTGGGCAACTTGGGT GTTAGATTGACTAAATTGAGTAAAGTCCAATCTGAATACTTGGGTATTCCAGAAGAAGGT CCATTCAAGGCCGACCACTACAGATATTGA ATT=Ile AAGTATCCCTACCTCTCTCCTCTAACGCAGATATTTCTGTGCACGTGATCTCGTTGGCTTTT TTTTCGGCCGAAATTTTCACAGGCTAAGGCCGAAAAAGAAAGAAAATTTTCAGAGGAAAA AGAAAATTAAACGACCTCGAAGCCGTATTTTAGATTTTCCAATCTCTTATTTAGTAACGT GGTTTATTAACTCCATGATTCCATTCCTATTTGTTTTTCTTTCTTTCTGAAAATCCTCTT SAH1-401 CTCCTCGAAATAACCCAACTGACAAAAAGAACAATTCCCAATGTCTGCTCCAGCTCAAAA CTACAAAATCGCTGATATCTCTTTGGCTGCCTTCGGTAGAAAGGAAATCGAATTGGCTGA ACATGAAATGCCAGGTTTGATGGCCATCAGAAAGGCTTACGGTGACGTCCAACCTTTGAA AGGCGCCCGTATTGCTGGTTGTTTGCACATGACCATTCAAACTGCTGTTTTAATTGAAAC TTTAGTTGCTTTGGGTGCCGAAGTTACCTGGTCCTCTTGTAACATCTATTCGACTCAAGA TCATGCCGCCGCTGCTATTGCCGCTTCCGGTGTTCCAGTTTTTGCCTGGAAGGGTGAAAC TGAAGAAGAGTATTTGTGGTGTATTGAACAACAATTGTTTGCCTTCAAGGACAACAAGAA ATTGAACTTGATCTTAGATGATGGTGGTGATTTAACCACTTTAGTTCATGAAAAGCACCC TGAAATGCTGGAAGACTGCTTTGGTCTTTCCGAAGAAACTACCACCGGTGTTCACCACTT ATACAGAATGGTCAAAGAAGGCAAGTTAAAGGTTCCTGCCATTAACGTTAACGACTCCGT CACTAAGTCCAAGTTTGACAACTTGTACGGCTGTAGAGAATCCTTAGTCGACGGTATTAA GAGAGCCACTGATGTCATGTTGGCTGGTAAGGTTGCCGTTGTTGCTGGTTACGGTGATGT CGGTAAGGGTTGTGCTGCTGCCTTAAGAGGAATGGGTGCTCGTGTCTTGGTTACCGAAAT TGACCCAATCAACGCTTTACAAGCTGCCATGGAAGGCTACCAAGTTGTTACCATGGAAGA TGCATCCCACATTGGTCAAGTTTTCGTTACCACCATTGGTTGTAGAGATATTATCAACGG TGAACATTTCATCAACATGCCAGAAGATGCCATTGTTTGTAACATTGGCCATTTCGATAT CGAAATTGATGTCGCCTGGTTAAAGGCTAACGCTAAAGAATGTATTAACATCAAACCACA AGTCGACCGTTACTTGTTGTCTTCTGGTAGACACGTCATCTTGTTGGCTAACGGTAGATT AGTTAACTTGGGTTGTGCTACTGGTCACTCATCTTTCGTTATGTCTTGTTCCTTCTCTAA CCAAGTCTTAGCTCAAATTGCTTTGTTCAAGTCTAACGATAAGTCTTTCAGAGAAAAGCA CATTGAATTCCAAAAGACAGGCCCATTCGAAGTTGGTGTCCACGTTTTGCCAAAGATCTT GGATGAAGCTGTCGCTAAGTTCCACTTGGGCAACTTGGGTGTTAGATTGACTAAATTGAG TAAAGTCCAATCTGAATACTTGGGTATTCCAGAAGAAGGTCCATTCAAGGCCGACCACTA CAGATATTGATCAATTCAATTCCCATTTCAGTTCTTCTTTCTCACTATTTTTTAATGTTC AAAAACTCAACGGTTTGATCATCAAATAAAAGATCAAATAAATTGCAAATATAAAAACAA CAGCTAACAATCCTATCACAGTATTAATAC SAH1-1450c SAH1-282 SAH1d100-40cTDHu1 SAH1+1450+ASC 変異遺伝子断片の作製 Template; pUC119-SAH1T279I SAH1-282 Template; pScHIS3TDH3p SAH1+1450+ASC SAH1-1450c sah1T279I SAH1d100-40cTDHu1 HIS3 MIX SAH1-282 SAH1d100-40cTDHu1 sah1T279I HIS3 Fusion PCR sah1T279I HIS3 sah1T279I 協会７号 RAK2359 HIS3 SAH1 SAH1 a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I 協会７号 HIS3 SAH1 a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/SAH1+ SAH1-401 SAH1d100-40cTDHu1 URA3 PCR URA3 形質転換（-U-H培地） 協会７号 sah1T279I HIS3 SAH1 a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/SAH1+ a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/SAH1+ 協会７号 sah1T279I HIS3 SAH1 URA3 協会７号 sah1T279I HIS3 URA3 a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/sah1Δ::URA3 協会７号 a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/sah1Δ::URA3 ・セルフクローニング ・AdoMet高生産 ・肝臓によい ・体によいかも 酒は百薬の長 謝 辞 広島大学 水沼正樹先生 宮川都吉先生 山口県産業技術センター 有富和生氏 磐田化学工業 阿野明彦氏 山口大学大学院医学系研究科 生命機能工学研究室 末廣大輔
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