《制作者：山崎》 Title:ｱﾐｵﾀﾞ̲一般20̲岸田 Page:93 ．．（．）：〜一般講演１８アミオダロン（AMD）およびデスエチルアミオダロン（DEA）のeNOS由来一酸化窒素産生に及ぼす効果 ―アミオダロンの心血管保護作用― 岸田信也 Ma 中島敏明飯田 Ji 陽子岩沢邦明大沼仁永井良三１）藺牟田宏之２）り測定し，real time PCR法によりNOSの定量も行った．はじめにまた，アポトーシスの検出は専用キットを用いて行っ不整脈の発生は，カテコールアミンなどのホルモン，ている．アンジオテンシン変換酵素などの酵素に加え，サイト結カイン，一酸化窒素（NO）などによる構造的ならびに電気的リモデリングが関与しているものと考えられる．また，アミオダロンの心血管保護作用は，血管系，果１．アミオダロン，およびDEA投与によるNOS発現への影響および心筋への作用に分けて考えるべきであろう．血左心房および左心室心筋細胞において，iNOS，管系では，―デスエチルアミオダロン（DEA）やアミ eNOS，nNOSのすべての発現がみられた．これに対しオダロンによるでの血管拡張作用が知られててHUVECでは，iNOSやnNOSの発現は認められず，１―３）いる．また，心筋に対しては，抗不整脈効果のほか，２＋心筋リモデリング，Ca 過負荷抑制作用が知られてい eNOSのみの発現が認められた． Real time PCR法による定量では，ヒトの心臓細胞に４）おいて，eNOSが心房および心室で高濃度に発現してこうした背景を踏まえ，今回われわれは，アミオダいることが確認された．HUVECでも同様にeNOSの発る．ロンが心血管系において心保護的に作用するeNOSの活性化を来し，NO濃度を上昇させる結果，心血管保護作用を来すか否かについて実験を行った．現が多く認められた（図１左）．また，免疫染色法によりeNOSの発現をみたところ， negative controlと比較して，心内膜および心室筋細胞のいずれもが濃染され，eNOSの発現が確認された（図実験方法．１右）実験に用いた細胞は，ヒト臍静脈内皮細胞（HU- ２．アミオダロン，およびDEA投与によるNO産生への VEC）である．アミオダロンおよびDEAを１μMから影響３０μMまで，様々な処理時間を設定して検討を行った．図の上段が蛋白補正前，下段が蛋白補正後である． NOの測定方法は，灌流液中の代謝物である亜硝酸イ１０μM，３０μM 図２Aが，アミオダロン１μM，３μM，オンの濃度をGriess法を用いて測定した．さらに，NO で処理し，測定した結果である．アミオダロン３μM 選択的高感受性微小電極を用いて直接的に測定した．から３０μMにかけて濃度依存的にNO産生の有意な上 NO合成酵素（NOS）のmRNAの発現は，RT―PCRによ昇が認められている．また，図２Bの時間依存性をみた結果では，２時間以上で有意な産生の亢進が認められ１）S. Kishida, J. Ma, K. Iwasawa, R. Nagai：東京大学大学院医学系研究科循環器内科２）T. Nakajima, Y. Iida, H. Onuma, H. Imuta：同虚血循環生理学ている．０２８７―３６４８/０６/￥５００/論文/JCLS μMから３０μMまで調べた結果，１μM以上で有意な代謝物であるDEAについて，アミオダロンと同様１ ― （ 1477）― 《制作者：山崎》 Title:ｱﾐｵﾀﾞ̲一般20̲岸田 Page:94 . Expression of eNOS in human heart Human Heart Endocardium 0.00004 0.00003 eNOS Neçative 0.00002 0.00001 0 nNOS A nNOS V eNOS A eNOS V HUVEC 0.00007 0.00005 0.00003 0.00001 0 nNOS eNOS Ventricular cells 図１ヒト心筋細胞ならびにHUVECにおけるeNOS，nNOSの発現 NO産生量 Ami1 NO産生量（μM） 35 30 25 20 15 10 5 0 cont B （μM） 6 ＊＊ 5 ＊＊ 4 ＊＊ 3 2 1 0 Ami3 Ami10 Ami30（μM） 0h （μM） 14 ＊＊＊＊ 12 10 ＊＊ 8 6 4 2 0 Ami3 Ami10 Ami30（μM） 0h NO産生量 NO産生量 A （μM） 12 10 8 6 4 2 0 cont Ami1 図２＊＊＊＊＊＊＊＊ 2h 4h 8 h 12 h ＊＊＊＊＊＊＊＊ 2h 4h 8 h 12 h アミオダロン投与によるNO産生への影響図上段は蛋白補正前，下段は蛋白補正後．また，Aはアミオダロン用量別，Bはアミオダロン作用時間別の結果である．＊＊：p＜００ . １． B （μM） 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Effects of desethylamiodarone 図３＊＊＊＊＊＊（μM／mç） 4 3.5 3 2.5 2 1.5 DEA3 DEA10 DEA30（μM） 1 0.5 0 ＊＊ DMSO Ami10 DEA10 ＊＊ NO産生量 NO産生量（μM） 3.5 3 2.5 2 ＊＊ 1.5 1 0.5 0 DMSO DEA1 ＊＊ NO産生量 A ＊＊ DMSO Ami10 DEA10 アミオダロン，デスエチルアミオダロンのNO産生に与える影響 Aはデスエチルアミオダロンの用量別の効果，Bはアミオダロンとデスエチルアミオダロンの比較；上段は蛋白補正前，下段は蛋白補正後． ― （ 1478）― 《制作者：山崎》 Title:ｱﾐｵﾀﾞ̲一般20̲岸田 Page:95 第１０回アミオダロン研究会講演集 LDH産生量（IU／L） A B ＊＊ DMSO Ami1 control 図５（nM） 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Amiodarone 10μM 図４ Amiodarone 100 μM （×10−5） 18Sを内部コントロールとした相対量 DEA 0 Ami 30（μM）アミオダロン投与によるLDHを指標とした細胞障害への影響 10 0 Ami 6 20 40 60 s 3 2 1 0 高感受性微小電極を用いたNOの測定 DMSO Ami 10 Ami 30 図６アミオダロン６時間処理によるeNOS mRNA発現に及ぼす効果上昇が認めれ（図３A），濃度依存性を示した．図３Bはアミオダロンとの比較であるが，代謝物であるDEAの Real time PCR法によりeNOS mRNAの発現をみた方がNO産生力が強いことが示されている．アミオダロン１μM，３μMおよび１０μMで２４時間後のNO産生をみたところ，１μMから有意な上昇がところ，アミオダロン１０μM，および３０μMの６時間処理では統計的な有意差はみられなかった（図６）．認められ，濃度依存性を示すことが確認された．考高感受性微小電極を用いてDEA ３０μM投与による NOへの影響をみたところ，投与直後より速やかなNO の上昇が認められた（図４）．察アミオダロンおよび―デスエチルアミオダロンは，臨床血中濃度において細胞障害を来すことなくeNOS 細胞障害についてLDHを指標として検討した．臨床由来のNO産生を亢進し，心血管保護作用をもたらす血中濃度を超えるアミオダロン６μMにおいてもLDH と考えられる．この機序には，細胞内Ca２＋濃度の上昇の有意な上昇は認めなかったが，さらに高濃度の３０μ が関係している可能性が高いと推測される７，８）． MではLDHの上昇が認められた（図５A）．また，細胞数さらに近年，心房細動症例ではNOレベルが低下しおよび形態について２４時間処理の影響を観察したとこている９），あるいはeNOSの産生がdown―regulateされろ，１０μMまではほぼ変化がみられなかったのに対し，ているとする報告１０）がみられる．１００μMでは著明な細胞数の減少，および細胞の不整形が認められた（図５B）． NOは血小板凝集能を低下させ，血栓形成を抑制することが知られている．本研究の結果から，心房細動 HUVECsを用いてアポトーシスの誘導を確認した患者に対するアミオダロン投与はNO合成を亢進させところ，アミオダロン３μM ２４時間処理では確認できることにより血栓形成を抑制するものと推測できる．なかった．しかし，アミオダロン３０μM ２４時間処理ではアポプトーティックな細胞が多数認められた５，６）． ― （ 1479）― 《制作者：山崎》 Title:ｱﾐｵﾀﾞ̲一般20̲岸田 Page:96 . おわりに血管内皮細胞や心内膜において，アミオダロンは eNOSの活性化をもたらすことが，心血管保護作用を呈する一因であろう．また，アミオダロンはeNOSの活性化により血小板凝集，血栓形成の抑制をもたらすことにより，心房細動における左房内血栓形成の抑制を介して，発作予防に関わる可能性も考えられ，今後のさらなる研究が期待される．文献１）Grossman M, Dobrev D, Kirch W：Amiodarone causes endothelium―dependent vasodilation in human hand veins . Clin Pharmacol Ther １９９８；６４：３０２―３１１. ２）Grossmann M, Dobrev D, Himmel HM, et al：Local venous response to N―desethylamiodarone in humans. Clin Pharmacol Ther ２０００；６７：２２―３１. ３）Guiraudou P, Pucheu SC, Gayraud R, et al：Involvement of nitric oxide in amiodarone― and dronedarone― induced coronary vasodilation in guinea pig heart. Eur ７. J Pharmacol ２００４；４９６：１１９―１２４）Tachikawa H, Kodama M, Watanabe K, et al：Amiodarone improves cardiac sympathetic nerve function to hold norepinephrine in the heart, prevents left ventricular remodeling, and improves cardiac function in rat dilated cardiomyopathy. Circulation ２００５；１１１：９. ８９４―８９５）Bargout R, Jankov A, Dincer E, et al：Amiodarone induces apoptosis of human and rat alveolar epithelial cells . Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol ４４. ２０００；２７８：L１０３９―L１０６）Choi IS, Kim BS, Cho KS, et al：Amiodarone induces ２ human lung epithelial cell line. apoptosis in L―１３ Toxicol Lett ２００２；１３２：４７―５５. ７）Himmel HM, Dobrev D, Grossmann M, et al：N―desethylamiodarone modulates intracellular calcium concentration in endothelial cells. Naunyn Schmiedebergs ９６. Arch Pharmacol ２０００；３６２：４８９―４８）Powis G, Olsen R, Standing JE, et al：Amiodarone―mediated increase in intracellular free Ca２＋ associated with cellular injury to human pulmonary artery endothelial cells. Toxicol Appl Pharmacol １９９０；１０３：１５６― １６４. ９）Minamino T, Kitakaze M, Sato H, et al：Plasma levels of nitrite/nitrate and platelet cGMP levels are decreased in patients with atrial fibrillation. Arterioscler １９５. Thromb Vasc Biol １９９７；１７：３１９１―３１０）Cai H, Li Z, Goette A, et al：Downregulation of endocardial nitric oxide synthase expression and nitric oxide production in atrial fibrillation：potential mechanisms for atrial thrombosis and stroke. Circulation ５８. ２００２；１０６：２８５４―２８ ― （ 1480）― 《制作者：山崎》 Title:ｱﾐｵﾀﾞ̲一般20質疑̲岸田.ec5 Page:97 第１０回アミオダロン研究会講演集質疑応答座長／鎌倉史郎（国立循環器病センター心臓血管内科部長）堀江稔（滋賀医科大学内科学講座循環器内科教授）演者／岸田信也（東京大学大学院医学系研究科循環器内科）堀江（座長）どうもありがとうございました．アミ検討が必要だと考えています．オダロンがeNOSを介して心血管，特に血管保護作用また，イオンチャンネルに関してお示しした微小電を示すのではないかというご検討ですが，ご質問，コ極のデータでは，非常に速やかなNO濃度の上昇が認メントはありませんでしょうか．められており，Ca２＋濃度の関与が考えられます．中谷（千葉大）アミオダロンは歴史的には狭心症予中谷 Ca２＋を介するとすると，アミオダロンはイオ防薬として使われましたので，血管拡張効果は昔からンチャンネルに作用しますので，例えば Ca２＋ acti- 知られており，そういう意味で非常におもしろい結果 vated K channelをブロックしたり，Ca２＋濃度の減少をだと思います．抑制して二次的に作用するなどが考えられると思いま eNOSの活性化に関して，電極内からNOを測定されす．血管平滑筋のイオンチャネルについての研究で，ていますが，NOSなどの酵素に直接作用するのか，あそうした作用をみられているのか，あるいはこれからるいはCa濃度やカルモジュリンなどを介してNOSをみる予定があるのか，教えていただけますか．活性化しているのか，先生のお考えをお聞かせください．岸田現在計画していまして，どのような方法が最適かを検討しているところです．岸田（演者）今回，NOS mRNAに関しては有意差中谷どうもありがとうございました．はみられませんでしたが，様々な濃度や処理時間での堀江先生，どうもありがとうございました． ― （ 1481）―