Application Note : 定性的カイネティクス解析生体分子間相互作用のリアルタイムモニタリングは、エンドポイントの読出しにおいて、1つの数字が明らかになるのに時間を要するような状況下で、より迅速な情報を提供します。ForteBio社のOctetシリーズシステムは、従来のELISAタイプによるアッセイでは不可能であった問題を取扱う上でその威力を発揮します。 ■ エピトープ・ビニング -Epitope Binning 標的の最良の結合物質を発見する為のクローン・スクリーニングの際、同程度のアフィニティを持つ多数の候補化合物が発見されることがあります。標的エピトープについてのより多くの情報は、標的タンパク質上の新規エピトープの特定や、標的作用を阻害しない結合物質の排除に役立つことが期待されます。Octet QKまたはREDシステムを利用することにより、多数のクローンが同じエピトープを共有しているのかどうか、または標的タンパク質の異なる領域を認識しているのかどうかを、迅速かつ容易に判定することができます。 (1) 抗体Aは5個のバイオセンサー上に等しく固定されています。結合 (nm) 5.0 4.5 4.0 3.5 (2) 標的は5個全てのバイオセンサーに等しく結合されています。 (3) 標的と結合した、固定された抗体Aは、全てのエピトープが確実に結合されるように遊離している抗体Aに対し暴露されています。 3.0 2.5 (4) 抗体A/標的複合体は抗体Aを実験のコントロールとして用い、 4種類の異なる抗体(1-4)と抗体Aに対し暴露されます。 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 抗体1-4と標的の解離を可能にするために、 5個全てのバイオセンサーは緩衝液中に置かれます。 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 時間 (秒) ＊凡例：オレンジ=抗体1、ピンク色＝2、緑色＝3、水色＝4、紫色＝抗体A(コントロール) 上図に示したように、抗体1・2・3は、いずれも抗体Aではなく、異なるエピトープを認識しています。抗体4は、抗体A/標的複合体に暴露した際には結合しなかったことから、抗体Aと抗体4は標的上で同じエピトープを共有していることが示唆されます。 ■ アイソタイピング -Isotyping BLIをベースにした技術を用いることにより、バックグラウンドタンパク質の存在下で、様々な抗体のアイソタイプを、迅速かつ容易に検出することが可能です。Octetシリーズは重鎖および軽鎖のサブクラスの双方を迅速に特定するためのシンプルな方法を提供します。抗種抗体によって固定されたバイオセンサーは、ハイブリドーマ上清のような粗精製混合物由来の特定の抗体を捕捉します。一連のアイソタイプ特異的抗体への暴露は、粗精製混合物から抗体のアイソタイプを迅速に特定するためのサンドイッチ様式を提供します。Octet QKおよびREDシステムは、8個のバイオセンサーの同時モニタリングを行うことにより、分析方法の開発、または複雑な洗浄ステップを伴わずに、約3分間でサンプル中の8種類までの異なるアイソタイプのスクリーニングを可能にします。緩衝液中での短時間の洗浄後、バイオセンサーは、グラフ中の凡例に記した一連のアイソタイプ特異的抗体に暴露されました。同時に8点のまでのサンプルを並列処理できるOctetシステムの性能を利用し、一連のアイソタイプ特異的抗体を用い、mIgGのアイソタイプを15分以内に検出しています。 1.8 1.6 1.4 結合 (nm) ビオチン化抗マウスFc抗体をStreptavidineバイオセンサーに固定し、その後、高タンパク質のバックグラウンド(> 1mg/mL)を持つサンプルからアイソタイプ分類されたmIgG (10μg/mL)に結合させるために使用されました。 1.2 1.0 0.8 0.6 0.0 0 日本総代理店： anti-mlgG-1 anti-mlgG-2b anti-mlgG-2a anti-mlgG-kappa anti-mlgG-lambda anti-mlgG-3 0.4 0.2 200 400 600 800 1000 時間 (秒) 1200 1400 1600 1800 【東京本社】〒112-0002 東京都文京区小石川1-3-25 小石川大国ビル9F 電話：03-3816-0851 [URL] http://www.primetech.co.jp/ [eMail] [email protected] 2008.06 (rev01) Application Note : ■ 結合ペアの選択 Octetシステムを用いた潜在的結合ペアのスクリーニングは、従来の方法と比べ、非常に迅速です。最適な結合ペアの選択は、ELISAのような結合分析法を利用した際のように、新たな分析法の構築のために必要となる時間を大幅に短縮することを期待できます。 8個のバイオセンサーに単一リガンドを固定することにより、96穴のサンプルプレートに装填されたいかなる分析物の結合も、迅速に検出することができます。分析が終了すれば、結果の定量評価により、どの分析物が固定リガンドに最もよく結合したかを特定することが可能です。右グラフは、抗体ペアのスクリーニングについてのリアルタイム結合を図示したものです。 2つのペアが更なる分析方法の開発に適していることが迅速に特定できます。 2.0 Ab1/Ab5間の相互作用も一定の解離を表しており、アフィニティがより微弱であることを示唆しています。 Ab2捕捉抗体はAb4検出抗体と共に良好な結合とアフィニティを示しています。結合 (nm) 1.5 Ab1捕捉抗体は検出抗体Ab5と共に分析物への良好な結合状態を示しています。 1.0 0.5 0.0 0 200 400 600 800 1000 時間 (秒) 1200 1400 1600 1800 日本総代理店：【東京本社】〒112-0002 東京都文京区小石川1-3-25 小石川大国ビル9F 電話：03-3816-0851 [URL] http://www.primetech.co.jp/ [eMail] [email protected] 2008.06 (rev01)