請求項1 - Questel

JP 4001625 B2 2007.10.31
(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース還元末端構造、を持ち
［この式では、ＩＩ型については、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が次の式で表わされるシアリ
ル化された７糖反復単位からなり、
（式中、ｎが約５から約５０であり）、
ＩＩＩ型については、Ｒ１が次の式で表わされるシアリル化された５糖反復単位であり、
10
(2)
JP 4001625 B2 2007.10.31
（式中、ｎが約５から約５０であり、Ｒ２がαＮｅｕＡｃ（２−３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ１
−で表わされる２糖である）］で表される断片を生産するために、グループＢ連鎖球菌（
10
ＧＢＳ）ＩＩ型およびＩＩＩ型多糖類を脱重合する方法であって、
該方法は、脱重合されるＧＢＳＩＩ型またはＧＢＳＩＩＩ型多糖を提供し、水層中の多
糖を塩基と反応させて部分的に脱Ｎ−アセチル化された多糖産物を生産し、脱Ｎ−アセチ
ル化された多糖産物をニトロソ化試薬で脱重合してＧＢＳＩＩ型またはＧＢＳＩＩＩ型
断片を形成し、次いで、この断片を回収する方法。
【請求項２】
塩基を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウム、重炭
酸ナトリウムおよびヒドラゾンのグループから選ぶ、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
ニトロソ化試薬が、亜硝酸ナトリウムあるいは硝酸である、請求の範囲第１項に記載の方
20
法。
【請求項４】
塩基が水酸化ナトリウムであり、ニトロソ化試薬が亜硝酸ナトリウムである、請求の範囲
第１項に記載の方法。
【請求項５】
多糖がＧＢＳＩＩ型細菌から得られる、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
得られたＧＢＳＩＩ型断片が約５ｋＤａから約５０ｋＤａの分子量を持つ、請求の範囲
第５項に記載の方法。
【請求項７】
30
多糖がＧＢＳＩＩＩ型細菌から得られる、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項８】
得られた断片が約５ｋＤａから約５０ｋＤａの分子量を持つ、請求の範囲第７項に記載の
方法。
【請求項９】
請求の範囲第１項にしたがって調製される、ＧＢＳＩＩ型またはＧＢＳＩＩＩ型多糖断
片。
【請求項１０】
脱Ｎ−アセチル化するための塩基が水酸化ナトリウムであり、ニトロソ化試薬が亜硝酸ナ
トリウムである、請求の範囲第９項にしたがって調製される、ＧＢＳＩＩ型またはＧＢ
ＳＩＩＩ型多糖断片。
【請求項１１】
次の２，５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース還元末端構造を持ち、
40
(3)
JP 4001625 B2 2007.10.31
［この式では、ＩＩ型については、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が次の式で表わされるシアリ
ル化された７糖反復単位からなり、
10
（式中、ｎが約５から約５０であり）、
ＩＩＩ型については、Ｒ１が次の式で表わされるシアリル化された５糖反復単位であり、
20
（式中、ｎが約５から約５０であり、Ｒ２がαＮｅｕＡｃ（２−３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ１
−で表わされる２糖である）］で表されるＧＢＳＩＩ型およびＧＢＳＩＩＩ型多糖類断
片。
【請求項１２】
分子量が約５ｋＤａから約５０ｋＤａの範囲を持つ、請求の範囲第１１項に記載のＧＢＳ
30
ＩＩ型多糖断片。
【請求項１３】
分子量が約５ｋＤａから約５０ｋＤａの範囲を持つ、請求の範囲第１１項に記載のＧＢＳ
ＩＩＩ型多糖断片。
【請求項１４】
ＧＢＳＩＩ型およびＧＢＳＩＩＩ型多糖断片から選ばれた、少なくとも一つの多糖断
片からなり、また該断片がタンパク質に共有結合し、複合分子が次の構造式
［この式では、ＩＩ型については、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が次の式で表わされるシアリ
ル化された７糖反復単位からなり、
40
(4)
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（式中、ｎが約５から約５０であり）、
ＩＩＩ型については、Ｒ１が次の式で表わされるシアリル化された５糖反復単位であり、
10
（式中、ｎが約５から約５０であり、Ｒ２がαＮｅｕＡｃ（２−３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ１
−で表わされる２糖である）］で表される複合分子。
【請求項１５】
タンパク質が細菌由来である、請求の範囲第１４項に記載の複合分子。
【請求項１６】
20
タンパク質が、破傷風類毒素、ジフテリア毒素、ＣＲＭ１９７、Ｉａ／Ｉｂ型グループＢ
連鎖球菌のβ−Ｃ抗原の組み換え型非ＩｇＡ結合タンパク質、および髄膜炎菌由来の組み
換え型クラス３外膜タンパク質から選ばれた細菌由来である、請求の範囲第１５項に記載
の複合分子。
【請求項１７】
多糖断片がＧＢＳＩＩ型多糖であり、タンパク質が破傷風類毒素であり、多糖断片の分
子量が約５ｋＤａから５０ｋＤａである、請求の範囲第１６項に記載の複合分子。
【請求項１８】
多糖断片がＧＢＳＩＩＩ型多糖であり、タンパク質が破傷風類毒素であり、多糖断片の
分子量が約５ｋＤａから５０ｋＤａである、請求の範囲第１６項に記載の複合分子。
30
【請求項１９】
タンパク質に対する多糖のモル比が約１から１０である、請求の範囲第１６項に記載の複
合分子。
【請求項２０】
タンパク質に対する多糖のモル比が約３から１０である、請求の範囲第１９項に記載の複
合分子。
【請求項２１】
ＧＢＳＩＩ型およびＧＢＳＩＩＩ型断片からなる、請求の範囲第１４項に記載の複合
分子。
【請求項２２】
タンパク質が、Ｉａ／Ｉｂ型グループＢ連鎖球菌のβ−Ｃ抗原の組み換え型非ＩｇＡ結合
タンパク質である、請求の範囲第２１項に記載の複合分子。
【請求項２３】
複合分子が次の構造式
40
(5)
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［この式では、ＩＩ型については、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が次の式で表わされるシアリ
ル化された７糖反復単位からなり、
10
（式中、ｎが約５から約５０であり）、
ＩＩＩ型については、Ｒ１が次の式で表わされるシアリル化された５糖反復単位であり、
20
（式中、ｎが約５から約５０であり、Ｒ２がαＮｅｕＡｃ（２−３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ１
−で表わされる２糖である）］で表される、タンパク質に共有結合したグループＢ連鎖球
菌（ＧＢＳ）ＩＩ型およびＩＩＩ型多糖断片からなる、複合分子を含むワクチン組成物。
【請求項２４】
断片がＧＢＳＩＩ型多糖であり、また多糖断片の分子量が約５ｋＤａから約５０ｋＤａ
である、請求の範囲第２３項に記載のワクチン組成物。
30
【請求項２５】
断片がＧＢＳＩＩＩ型多糖であり、また多糖断片の分子量が約５ｋＤａから約５０ｋＤ
ａである、請求の範囲第２３項に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
タンパク質が、破傷風類毒素、ジフテリア毒素、ＣＲＭ１９７、Ｉａ／Ｉｂ型グループＢ
連鎖球菌のβ−Ｃ抗原の組み換え型非ＩｇＡ結合タンパク質、および髄膜炎菌由来の組み
換え型クラス３外膜タンパク質から選ばれた細菌由来である、請求の範囲第２３項に記載
のワクチン組成物。
【請求項２７】
タンパク質が、Ｉａ／Ｉｂ型グループＢ連鎖球菌のβ−Ｃ抗原の組み換え型非ＩｇＡ結合
40
タンパク質、および髄膜炎菌由来の組み換え型クラス３外膜タンパク質である、請求の範
囲第２６項に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
ＧＢＳＩＩ型およびＧＢＳＩＩＩ型多糖断片との複合物からなる、請求の範囲第２３
項に記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
請求の範囲第１４項の複合物によって免疫された非ヒト哺乳動物によって産生される抗体
を含む免疫血清。
【請求項３０】
請求の範囲第１４項の複合物によって免疫された非ヒト哺乳動物によって産生される抗体
50
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。
【請求項３１】
複合物の多糖類がＧＢＳＩＩ型多糖の断片である、請求の範囲第３０項に記載の抗体。
【請求項３２】
複合物の多糖類がＧＢＳＩＩＩ型多糖の断片である、請求の範囲第３０項に記載の抗体
。
【請求項３３】
哺乳類に免疫に化する量の請求の範囲第２３項のワクチンを投与することからなる、ヒト
を除く哺乳類をＧＢＳＩＩ型またはＧＢＳＩＩＩ型感染に対して免疫する方法。
【請求項３４】
10
請求の範囲第１項にしたがって調製した多糖断片を固形支持体に固定化し、該固形支持体
を、ＧＢＳＩＩ型抗体またはＧＢＳＩＩＩ型抗体が多糖断片に結合できる様な条件下
で血清に結合した多糖と組み合わせ、また残った血清を固形支持体から分離することから
なる、ＧＢＳＩＩ型抗体またはＧＢＳＩＩＩ型抗体を血清から分離する方法。
【請求項３５】
多糖断片がＧＢＳＩＩ型である、請求の範囲第３４項に記載の方法。
【請求項３６】
多糖断片がＧＢＳＩＩＩ型である、請求の範囲第３４項に記載の方法。
【請求項３７】
多糖断片が固形支持体に固定化される、請求の範囲第１項の方法にしたがって調製された
20
、ＧＢＳＩＩ型多糖断片またはＧＢＳＩＩＩ型多糖断片からなる、免疫アッセイ試薬
。
【請求項３８】
多糖断片がＧＢＳＩＩ型である、請求の範囲第３７項に記載の免疫アッセイ試薬。
【請求項３９】
多糖断片がＧＢＳＩＩＩ型である、請求の範囲第３７項に記載の免疫アッセイ試薬。
【請求項４０】
請求の範囲２３項のワクチンと医薬的に許容される担体とから成る医薬組成物。
【請求項４１】
請求の範囲２３項のワクチンと医薬的に許容される担体とから成るＧＢＳＩＩ型またはＧ
30
ＢＳＩＩＩ型感染症の治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
［発明の分野］
本発明は、抵抗性抗体を誘導する免疫原を生ずる、タンパク質に複合させるために有用な
、抗原性莢膜多糖断片に関連するものである。さらに詳細には、本発明は分析可能な還元
末端基を持つ、グループ B連鎖球菌莢膜多糖類（ GBS CR）と、その調製法、ならびに複合
ワクチンへのその利用に関連している。
［発明の背景］
GBS細菌は、細菌および／または幼児における髄膜炎および成人における感染に対する、
認められた病因学的な作因である。ベーカー（ Baker）、「グループ B連鎖球菌感染（ Grou
40
p B Streptococcal Infections）」、 Advances in Internal Medicine, 25: 475-500（ 19
80）。これによると、 GBSの診断には、迅速かつ決定的なアッセイ法および GBSに対する抵
抗性を生ずる方法を開発することが、特に幼児と危険状態にある個体において重要である
。
GBS細菌由来の莢膜多糖類は、 GBSの毒性および抵抗性免疫の発生に重要であることが知ら
れている。カスパー（ Kasper）ら、米国特許第 5,302,386号明細書を参照のこと。さらに
、認められている GBS型（ I-V）の CPは、化学的には近縁だが抗原性は異なり、ガラクトー
ス、グルコース、 N-アセチルグルコサミンおよび N-アセチル -ノイラミン（サリチル）酸
からなる反復構造を持っている。
幼児および若年の子供は、多糖類抗原に対して弱い免疫応答しか持たない。これらの応答
50
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は、 T細胞非依存的であることが知られ、したがって、引き続く感染に対して、長期的な
免疫的抵抗性を与えるために必要な、記憶、インタイプ変換または親和性成熟などの重要
な特性には関与しない。こうした多糖類に対する、幼児および若年の子供における有効な
免疫応答の欠如をうまくやり過ごすために、多糖類の細胞性抗原を担体タンパク質に共有
結合させ、複合分子を作ることによって、 T細胞非依存的応答を、 T細胞依存的応答へ転換
する方法が開発されてきた。
タンパク質に莢膜多糖類を複合化するために、さまざまな方法が当業において述べられて
きた。概説としては、本明細書に参考文献として取り入れられている、 Contributions to
Microbiology and Immunology、第１０巻、 Conjugate Vaccine、 J.M.クルーズ（ Cruse）
と R.E.ルイスジュニア（ Lewis, Jr.）編、 1989を参照のこと。一つの方法では、共有結合
10
を形成するためタンパク質と反応可能な還元末端基を生むために、多糖類は弱い酸加水分
解を受ける。アンダーソン（ Anderson） P.A.、 Infect. Immun. 39: 233-238（ 1983）。し
かし、タンパク質との複合化に関わる末端糖グループは、ヘミアセタールとアルデヒドの
平衡状態で存在し、したがってタンパク質と低い効率でしか結合しない。末端還元糖類の
低い反応性を克服するため、当業はタンパク質との複合化に使う多糖類の末端位に、安定
なアルデヒト基を導入する弱い酸化処理を行う方向へ転じた。ジェニングスら、米国特許
第 4,356,170号明細書、前出。
カスパー（ Kasper）ら、米国特許第 5,302,386号明細書および国際特許第 WO 94/06467号明
細書は、それぞれ GBSIII型と GBSII型複合ワクチンに関連しており、そのいずれも本明細
書の参考文献に取り入れられている。第 5,302,386号明細書によると、タンパク質への複
20
合化に適した産物を生産するための、多糖骨格を開裂するために、エンド -b-ガラクトシ
ダーゼが使われる。架橋された複合物を作るための、少なくとも２つの末端サリチル酸残
基の酸化は、第 WO 94/06467号明細書に記載されている。
III型 GBS莢膜多糖類は、反復した分枝五糖単位の骨格からなっている。（ジェニングスら
、 Canadian J. Biochem., 58: 112-120（ 1980））。 III型 GBS莢膜多糖類に関する研究は
、天然の免疫決定因子部位が、側鎖 -骨格連結部にあることを報告している。（ジェニン
グスら、 Biochemistry, 20: 4511-4518（ 1980））。その報告によると、側鎖の末端に Nアセチル -ノイラミン酸残基が存在することが、免疫決定因子の発現に重要である。
これまでの GBS II型または III型多糖類を脱重合する方法は、高価な酵素法あるいは不安
定な末端サリチル酸基が除かれるために、 CPの抗原性を変えるかもしれない酸加水分解に
30
依存するものである。したがって、 CP-タンパク質複合ワクチンを生産するために有用な
、断片を生ずるような方法で、 GBS II型および III型 CPを脱重合するために有効な、比較
的安価で穏やかな化学的方法が必要とされている。
［発明の要約］
本発明は、グループ B連鎖球菌 II型（ GPS-II）および III型（ GBS-III）莢膜多糖類（ CP）
を、 2,5-アンヒドロ -D-マンソース構造を末端に持つ産物を生成するために、脱アミ開裂
によって脱重合する方法に関連するものである。本発明によると、 GPS-II CPおよび GBS-I
II CPを水酸化ナトリウム、および亜硝酸ナトリウムなどのニトロソ化試薬によって処理
して、多糖骨格の端に末端アルデヒド基を持つ断片を生産するために、 GBS多糖類を脱重
合化する。その結果生ずる CP断片は抗原性を持ち、またタンパク質に結合して、新生児を
40
含む哺乳類における、抵抗性免疫応答を誘導するのに有効な免疫原を生産するために有用
でもある。
したがって、本発明の他の態様は、ワクチンとして使うための複合分子を作る方法である
。この方法は、 GBS-IIまたは GBS-III CPを、 2,5-アンヒドロ -D-マンノース残基を末端に
持つ断片を作るための、塩基およびジアゾニウム塩を形成する試薬による治療に用いるこ
とからなる。次に、 2,5-アンヒドロ -D-マンノース末端を持つ断片を、タンパク質と組み
合わせ、本発明の複合分子を形成するために、還元的アミノ化を行う。したがって、本発
明のもう一つの態様は、末端 2,5-アンヒドロ -D-マンノースを介してタンパク質に連結し
た、 GBS-IIまたは GBS-III CP断片からなる、 GBS-IIおよび GBS-III CP複合分子である。 GB
S II型および GBS III型多糖類を脱重合化する過程が、骨格の末端位に単一の反応部位を
50
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もつ断片を生ずるため、本発明は第二アミンによって末端還元糖を介し、それぞれの GBS
II型および GBS III型多糖鎖が単一のタンパク質に結合する、複合分子を作り出す方法を
提供する。
本発明の複合物は、 GBS-IIおよび GBS-III細菌感染に対して個人を免疫するための、活性
をもつワクチンとして有用である。また本発明は、異なる血清型または細菌種由来の多糖
類からなる、多価ワクチンを提供する。
それに加え、本発明は、本発明の複合分子による免疫に応答して生じ、また GBS II型およ
び GBS III型細菌の存在を検出するための試薬として有用であるか、または能動的な免疫
を与えるためのワクチンとして有用な免疫血清または抗体を含む。本発明のもう一つの態
様は、 GBS II型または GBS III型抗体を、分離および／または検出するために有用な方法
10
および組成物である。本態様を実施する一つの方法によると、本発明にしたがって調製さ
れた多糖類断片は、固形支持体に固定される。血清などの抗体の材料と固形支持体に結合
した多糖類断片を組み合わせることにより、多糖類断片に結合した抗体は、標準的な免疫
アッセイ法によって検出するか、または出発材料あるいは血清から分離してもよい。
本発明の目的は、複合分子の作製に有用な断片を生産するために、 GBSII型および GBSIII
型多糖類を断片化する方法を提供するものである。本発明のもう一つの目的は、感染に対
して抵抗するためのワクチンおよび免疫剤として有用な、 GBSII型および GBSIII型多糖類
を生産することである。
【図面の簡単な説明】
第１図は天然の II型多糖（ 200キロダルトン）破傷風菌毒素複合物への結合を 100%結合対
20
照として比較した、ウサギ抗 II型特異的多糖抗体の、（平均分子量 15、 33および 51キロダ
ルトンの断片を持つ） II型断片多糖破傷風菌毒素複合物への直接的結合。
第２図は天然の III型多糖（ 90キロダルトン）破傷風菌毒素複合物への結合を 100%結合対
照として比較した、ウサギ抗 III型特異的多糖抗体の、（平均分子量 13、 18、 26、 34およ
び 48キロダルトンの断片を持つ） III型断片多糖破傷風菌毒素複合物への直接的結合。
第３図は約 200キロダルトンの分子量を持つ、天然の GBS II型多糖の H-NMRスペクトル。
第４図は約 12キロダルトンの分子量を持ち、本発明の方法によって調製した 2,5-アンヒド
ロ -D-マンノースに関連する水素ピークを示す、 GBS II型多糖断片の H-NMRスペクトル。
第５図は約 100キロダルトンの分子量を持つ、天然の GBS III型多糖の H-NMRスペクトル。
第６図は約 9キロダルトンの分子量を持ち、本発明の方法によって調製した 2,5-アンヒド
30
ロ -D-マンノースに関連する水素ピークを示す、 GBS III型多糖断片の H-NMRスペクトル。
［発明の詳細な説明］
本発明は、次の 2,5-アンヒドロ -D-マンノース還元末端構造：
を持ち、ここで R１は水素であり、 R２はシアリル化された次の化学式
をもつ七糖反復単位であり、この化学式で、 nは GBSII型については約 5から約 50であり、 R
1は、シアリル化された次の化学式
40
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をもつ五糖反復単位であり、この化学式で、 nは約 5から約 50であり、 R2は GBSIII型につい
ては二糖 α NeuAc（ 2-3） β -D-Galp1-であるところの、グループ B連鎖球菌 II型および III
型抗原性多糖 -断片に関連するものである。
10
本発明に従い、次に示す構造：
を持ち、この化学式では天然の多糖については、 nは約 200であるか；あるいは GBS III型
20
については反復単位であり、ここで天然の多糖については、 nは約 100である構造を持つ、
30
より大きな分子量の GBS II型および GBS III型多糖類を脱重合することによって、３つの
断片が生産される。
本明細書で用いられるように、グループ B連鎖球菌または（ GBS）細菌という用語は、特に
分類学的に連鎖球菌アガラクティエ（ Streptococcus agalactiae）と呼ばれる細菌を含む
ために、特にランスフィールド（ Lancefield）、 J. Exp. Med., 108: 329-341（ 1938）お
よび、それに続いてグループ B血清型についてさらに特徴づけを行った研究、たとえば、
ラッセル -ジョーンズ（ Russell-Jones）、 J. Exper. Med., 160: 1476（ 1984）に参照さ
れる、当業者によって理解されるものと同じ意味を持つ。
本発明の新規な断片を生産する、 GBS II型および GBS III型莢膜多糖を断片化するための
本発明の方法は、化学的脱重合反応に由来する、 GBS II型および GBSIII型多糖断片を得る
40
ための、穏やかな非変成条件を用いる。これらの断片は高収率で得られるかもしれないた
め、この方法はワクチンの大規模生産を経済的にするかもしれない。
GBS II型および GBS III型 CPは、本発明の方法に従い、次のようにして脱重合した。 II型
および III型 GBS CP（式 I）における、骨格の 2-デオキシ -2N-アセトアミド -β -D-グルコピ
ラノシル基は、穏やかな塩基によって水溶液中で、部分的に脱 N-アセチル化される。本発
明の方法において用いるのに適した塩基の例として、水層のアルカリ金属水酸化溶液、た
とえば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム、あるいはアンモニア水、ヒドラジン、炭
酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムを含むが、しかしこれに限定されるわけではない。
塩基処理に続いて、得られたグルコサミン残基（式 II）は、亜硝酸ナトリウムまたは亜硝
酸などの適当な試薬を用い、たとえば不安定な N-ニトロソ誘導体（式 III）を形成するた
50
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めにニトロソ化を受けられる。２番炭素原子上の酸素環による求核攻撃のための再配列は
、環の縮小と隣接するグリコシド結合の開裂を引き起こす（式 IV）。この反応は、ヘパリ
ンや種々のグリコサミノグリカンの構造解析に用いられてきた。本明細書に取り入れられ
ている、バーネット（ Barnett）、米国特許第 4,438,261号明細書を参照のこと。
10
20
30
40
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多糖断片の還元末端に形成された、得られた 2,5-アンヒドロ -D-マンノース（式 IV）残基
中のアルデヒド基は、それ以上の化学的操作（たとえばスペーサー・アームを使うこと）
を加えずに、還元的アミノ化を介してポリマー、好ましくはタンパク質を含むアミノ基に
結合させるために直接利用可能である。
より詳細には、本発明にしたがって GBS多糖類を脱重合するために、この反応は簡便な大
きさの容器内で、水溶液中において行われる。反応を開始するには、水溶液中の適量の多
糖類を、骨絡グルコピラノシル残基を部分的に脱 N-アセチル化するために、塩基で処理す
る。簡単に述べると、塩基性の水層中で、温度を高めた中で、たとえば約５０℃から１１
０ ℃ において、また pHに約１３から１４において反応を行う。塩基の量は経験から最適化
する。好ましくは、塩基と N-アセチル基の比率は約１０から５０ meqの間である。さらに
10
好ましくは、この比率は２０から２５ meqの間である。反応の速度と到達度は、塩基の濃
度、または反応温度、または反応時間を調節することによって適正化してもよい。脱 N-ア
セチル化の度合は 'H-NMRによって監視してもよい。
５ kDから 60kDの間の断片を得るために、脱 N-アセチル化の度合は、反応可能な部位の総量
の約２０％から約２％にするべきである。脱アセチル化反応を停止するために、反応を冷
却、すなわち氷中で冷却するか、あるいは約 pH4.0に酸性化してもよい。酸性化は、残存
するシアル酸残基の加水分解を避けるために、慎重に行わなければならない。
次に、アルデヒドを形成するためのニトロソ化反応は、亜硝酸ナトリウムまたは希硝酸な
どの他の適した試薬を、脱 N-アセチル化した多糖類に添加することによって行う。亜硝酸
ナトリウムなどのニトロソ化試薬は、脱 N-アセチル化された残基のモル数に比べてモル過
20
剰量加えることが好ましい。ニトロソ化試薬と多糖の反応は、低温、たとえば４℃で、撹
拌しながら、約２時間または反応が完結するまで行う。反応の到達度は、アルデヒド基の
存在についてアッセイすることによって監視してもよい。反応の全般を通して、アルデヒ
ド基の濃度は、飽和状態に達するまで上昇するはずである。反応の終了は、反応液を希釈
し、また水酸化ナトリウムなどの塩基性希釈剤によって、約７まで pHを上げることで行っ
てもよい。余剰の試薬の除去は、標準的な方法を用いた透析によって行ってもよい。
反応終了後、骨格の端末部に末端アルデヒド基を持つ多糖断片は、標準的なクロマトグラ
フィー法を用いてサイズ分画し、収集してもよい。タンパク質への結合に好ましいサイズ
は、 GBS II型多糖については 5kDから 50kDの間であり、 GBS III型多糖については約 5kDか
ら 50kDの間である。より好ましいサイズは、 GBS II型については 5kDから 20kDの間であり
、 GBS III型については 10kDから 50kDの間である。サイズ分画した断片は、先に述べた標
準的な還元的アミノ化法（たとえば、米国特許第 4,356,170号明細書および国際特許第 WO9
4/06467号明細書を参照）による結合反応に用いてもよく、あるいは後の使用のために保
存しておいてもよい。
GBS II型に適用された脱アミノ化による開裂および結合は、次の発明にしたがって行って
もよい：
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10
20
還元的アミノ化によって担体タンパク質に直接複合できる、抗原性 III型断片を生ずる、
脱アミノ開裂による III型多糖の脱重合過程は、次に描かれている：
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本発明の複合分子のタンパク質部分は、 T細胞依存的応答を引き起こすために十分な長さ
の、生理的に許容されるどのようなタンパク質またはポリペプチドでもよい。そうしたタ
ンパク質の例は、破傷風菌毒素または類毒素、および CRM197のような交差反応物質、およ
30
びグループ B連鎖球菌 Ia/Ib型の B-C抗原の、組換え体非 IgA結合タンパク質、および組換え
体３型外膜タンパク質および髄膜炎菌（ Neisseria Meningitides）由来の（ OMP）を含む
、細菌タンパク質またはポリペプチドからなるが、しかしそれに限定するものではない。
本発明の複合分子中のタンパク質に対する多糖のモル比は、タンパク質１モルあたり、約
１モルから約１０モルの多糖が好ましい。より好ましくは、この比はタンパク質１モルあ
たり３から１０の多糖断片であるとよい。タンパク質／多糖比に関する変化は、結合反応
中の出発組成の比を調整して行ってもよい。
GBS II型または GBS III型多糖からなる複合分子を提供することに加え、本発明はまた異
なる型の多糖類が単一のタンパク質に結合する多価複合物およびそのワクチンをも意図し
ている。たとえば、 GBS I型、 II型、 III型、 IV型、あるいは V型多糖類と同様に、たとえ
40
ばインフルエンザ菌（ Haemophilus influenzae） b型または髄膜炎菌 A型、 B型、または C型
などの、他の細菌由来の多糖類は、さまざまな組み合わせでタンパク質と結合してもよい
。好ましい組み合わせは、 GBS II型および GBS III型の多糖類であろう。
本発明にしたがって調製した複合分子は、少なくとも一つの GBS II型または GBS III型多
糖断片が、多糖断片の骨格の末端に、単一の結合部位を介して結合するタンパク質を通常
含んでいる。したがって、もし必要であれば、本発明は GBS II型または GBS III型複合分
子を生産する能力をもち、その場合、多糖構成成分は、一端を除いてはタンパク質によっ
て覆われていない。 GBS II型および GBS III型多糖類を、分枝の末端シアル酸を介してタ
ンパク質に結合させる他の方法は、タンパク質の大部分の部位において多糖類を架橋およ
び結合する結果を招くかもしれない。本発明はまた、方法を組み合わせて用いることによ
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って作られるかもしれない、複合分子を意図するものである。たとえば、本発明に従い、
単一の反応性 2,5-アンヒドロ -D-マンノース末端基を作ることによって合成された複合物
は、さらに複数の部位で活性化された多糖類と反応させてもよい。
本発明にしたがってワクチンを調製する方法は、哺乳類において、特に子供を持つ年齢の
女性、新生児、免疫不全の成人および GBS感染の危険性のある子供において、 GBS II型お
よび GBS III型感染に対する保護をあたえるために重要な、有用なワクチンを提供する。
これらのワクチンは、誕生前の胎児における免疫応答を引き起こす方法として、妊娠中の
女性に投与するために特に有用と予想される。
ワクチンは免疫応答を引き起こすのに充分量投与される。典型的な例として、そうした応
答を引き起こすためには、約 1から 50ugの間の投与量が用いられる。投与量は、ワクチン
10
を受ける個体のサイズ、体重、または年齢に基づいて調整してもよい。個体における抗体
応答は抗体価あるいは細菌の活性をアッセイすることでモニターでき、もし必要であれば
応答を増強するために追加投与を行うことができる。
ワクチンは、当業者に知られる、ワクチンに適した標準的な担体、緩衝剤あるいは保存料
を含んでもよい。それに加え、免疫応答を増強するために、ミョウバンまたはステアリン
チロシンなどのアジュバントを組成に含んでもよい。
本発明にしたがって調製した多糖断片はまた、 GBS II型または GBS III型抗体の免疫アッ
セイおよび分離に用いるための、種々の免疫試薬を調製するために有用である。たとえば
免疫アッセイには、多糖断片は本発明の複合物における場合と同様に、固形支持体に直接
、あるいはタンパク質リンカーを介して固定化してもよい。次にこの固形支持体は、 GBS
20
II型または GBS III型細菌に対する抗体の存在を検出するために、ラジオイムノアッセイ
および ELISAアッセイを含む、当業者に知られるさまざまな免疫アッセイ系に用いること
ができる。こうしたアッセイ法は、血清中の GBS II型または GBS III型抗体の存在をアッ
セイすることによって、個体における感染の存在を診断するために使ってもよい。
分離化学における利用では、多糖断片は親和性カラムを調製するために、固形支持体に固
定化してもよい。好ましい態様においては、多糖断片は初め本発明の方法にしたがってタ
ンパク質に結合し、そして次に得られた複合物を支持体マトリックスに結合させる。タン
パク質を親和性カラムに結合させる方法は、当業者に知られている。親和性カラムの一般
的な支持体はアガロースから調製され、またそれらは市販されており、たとえば活性化セ
ファロース（ファルマシア社）がある。次にこうした親和性カラムは、血清などの原料か
30
ら GBS II型抗体または GBS III型抗体を分離するために用いてもよい。 GBS II型抗体また
は GBS III型抗体をふくむと考えられる血清と、固定化した多糖断片を、抗体が固定化さ
れた断片に結合できるような条件の下で合わせることにより、血清から調製してもよい。
結合した抗体は次に、従来のアッセイ技術を用いて検出してもよく、あるいは固定化され
た支持体から残存した血清成分を除いた後、多糖断片から分離および除去してもよい。
本発明は、次に示す非制限的な実施例を例として説明されるだろう。
［実施例］
実施例１： GBS II型および GBS III型 2,5-アンヒドロ -D-マンノースを末端に持つ断片を生
産するための、塩基脱重合および亜硝酸ナトリウムによる環収縮
GBS II型
40
平均分子量約 200,000の、天然 GBS II型 CP（ 75mg）を 3mlの 0.5N水酸化ナトリウムに溶解し
、次にその溶液を３つに分けた（それぞれ 1ml）。試料（ S1-S3）を 70℃ でぞれぞれ 60分、
90分、および 180分間熱し、次に氷水槽中で冷却した。各試料に 125cmLの氷酢酸を加え、 p
Hを４とした。 200mcLの 5%（ w/v） NaNO 2 を添加した後、試料を４ ℃ で２時間撹拌し続けた
。次に S1-S3試料を、脱イオン水で 5mlに希釈し、その pHを 0.5N水酸化ナトリウムで７とし
た。過剰な試薬は、ダイアフロー（ Diaflo）限外ろ過膜（アミコン YM10）を用いて、脱イ
オン水に対して透析ろ過し、その溶液を凍結乾燥した。三種類の II型多糖類断片（ II-1-I
I-3）が得られた。
GBS III型
平均分子量約 100,000の、天然 GBS III型 CP（ 125mg）を 5mlの 0.5N水酸化ナトリウムに溶解
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し、次にその溶液を５つに分けた（それぞれ 1ml）。試料（ S1-S5）を 70℃ でぞれぞれ 60分
、 90分、 180分、および 240分間熱し、次に氷水槽中で冷却した。各試料に 125cmLの氷酢酸
を加え、 pHを４とした。 200mcLの 5%（ w/v） NaNO2を添加した後、試料を４ ℃ で３時間撹拌
し続けた。次に S1-S5試料を、脱イオン水で 5mlに希釈し、その pHを 0.5N水酸化ナトリウム
で７とした。過剰な試薬は、ダイアフロー（ Diaflo）限外ろ過膜（アミコン YM10）を用い
て、脱イオン水に対して透析ろ過し、その溶液を凍結乾燥した。五種類の III型多糖断片
（ III-1-III-5）が得られた。
CP断片のサイズ分画
それぞれの断片の平均分子量（ avMw）はスーパーロース -12（ Superose-12）サイズ排除カ
ラム（ファルマシア社）を用いた HPLCによって、 10,000から 2,000ダルトンの平均分子量
10
のデキストラン系列を用いて推定された。空隙率（ Vｏ）および総容量（ Vt）は、それぞ
れデキストラン 2,000およびアジ化ナトリウムを用いて決定した。本法で決めたそれぞれ
の断片の平均分子量（ avMw）は、次の通りである：
20
多糖断片の物理化学的分析
その元となる天然の多糖と比べた、それぞれの断片の構造的保存性は、ブルーカー（ Bruk
30
er） AM500分光計を用いた、 500MHzにおける高解像度一次元 H-NMR分光分析によって決定し
た。 II型および III型断片と、それらの天然多糖の H-NMRスペクトルの比較から、化学処理
の間に何らの構造上の変化は起こっておらず、最も重要なことに、末端シアル酸残基がニ
トロソ化処理の間も保存されていたことが示唆された。
実施例２： II型および III型多糖ハプテンの、破傷風類毒素への結合
破傷風類毒素（ SSI、デンマーク）は、最初にバイオゲル -Aカラム（バイオラッド・ラボ
ラトリーズ）によるゲルろ過によって、その単量体まで精製された。得られた破傷風類毒
素単量体（ TTm）（ 150,000ダルトン）は、 25mg/mlの濃度で 0.2Mのリン酸緩衝液、 pH7.5に
溶解し、以下に示す量の乾燥した GBS II型（ II-1から II-3）または GBS III型（ III-1から
III-5）多糖類、および再結晶化したナトリウムシアノボロヒドリド NaCNBH 3 を添加した：
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次に反応混合液を 37℃ で４日間インキュベーションした。結合反応の進行は、スーパーロ
ース -12（ファルマシア）で分析した反応混合液の少量を HPLCにかけることによって監視
した。複合物は、 0.01%のチメロザールを含む PBSを溶出液として用いた、スーパーデック
ス G-200（ファルマシア）カラムを用いた、分子排除クロマトグラフィーによって精製し
た。カラムから溶出した画分は、ウォーターズ R403示差屈折計、および 280nmの UV分光計
によって監視した。複合物を含む画分を取り分け、 0.22umのミリポア膜によってろ過滅菌
し、それぞれについてブラッドフォード法（ブラッドフォード（ Bradford）、 M.M., 1976
. Anal. Biochem., 72: 248-254）およびレゾルシノールアッセイによって、そのタンパ
20
ク質含量とシアル酸含量を分析した。各 II型複合分子および III型複合分子における、平
均的な炭化水素含量は、シアル酸含量をとり、反復単位の組成に基づいて、それぞれ 4お
よび 3.3の補正係数を掛けることによって算出された。それぞれ個々の複合物の分析は、
以下の第１表に示されている：
30
天然の莢膜多糖類エピトープについて観察された特異性と比較した場合の、 II型および II
40
I型多糖 -複合物に対するウサギポリクローナル抗体の免疫化学的特異性は、 ELISAによっ
て観察され、第１図（ GBS II型）および第２図（ GBS III型）で報告されている。
実施例３； GBS II型および GBS III型 -破傷風類毒素複合ワクチンによる免疫に対する、雌
のネズミの免疫原応答
ａ．免疫
１０個体の雌のスイス・ウェブスターマウスのグループ（ 4-6週齢）は、 2μ ｇの天然の II
型または III型多糖、あるいはそれに対応する破傷風菌 -類毒素複合物により皮下免疫を行
った。ワクチンは、 0.01%のチメロサールを含む 10mMPBS1mlあたり 1mgの含有アルミ濃度で
、水酸化アルミ（アルヒドロゲル（ Alhydrogel）；スーパーフォス（ Superfos）、デンマ
ーク）に吸着された。マウスは０日、２１日および４２日目にワクチンを投与され、最終
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的に５２日目に放血された。血清を回収し、 -70℃ で保存した。
ｂ．複合血清の ELISAとオプソニン活性
ELISAs：マイクロタイタープレート（ヌンク、ポロソープ ELISAプレート）を、ウエル当
たり 100μ lの 0.02%アジ化ナトリウム入り PBSに溶かした天然 II型または III型多糖 -HSA複
合物（ 1μ ｇ /ml）を加えることによって慣らした。このプレートを３７ ℃ で１時間インキ
ュベーションした。プレートを 0.05%のビトゥイーン 20を含む PBS（ PBS-T）で洗い、 PBS中
の 0.5%BSA溶液により、室温で１時間ブロッキングした。次に、ウエルを 100μ lのマウス
抗血清の PBS-Tによる２倍希釈系列で満たし、このプレートを室温で１時間インキュベー
ションした。 PBS-Tで洗ったあと、プレートを 100μ lのペルオキシダーゼ標識したヤギ抗
マウス IgG（ H+L）（カークガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ（ Kirkegaard & Per
10
ry Laboratories））で満たし、次に PBS-Tで５回洗った。最後に、 50μ lの TMBペルオキシ
ダーゼ基質（カークガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ）をそれぞれのウエルに加
え、プレートを室温で１０分間インキュベーションした後、 50μ lの 1Mリン酸を加えるこ
とによって反応を停止した。このプレートは、 650nmを対照波長とし、モレキュラー・デ
バイス・アメックス社（ Molecular Device Amex）のマイクロタイタープレートリーダー
を用いて、 450nmで測定した。
天然の III型多糖、または III型断片多糖 -破傷風菌類毒素複合物でワクチン処理されたマ
ウスの、 III型多糖特異的な抗体のタイターは、第 II表に示されている。
20
天然の II型多糖、または II型断片多糖 -破傷風菌類毒素複合物でワクチン処理されたマウ
スの、 II型多糖特異的な抗体のタイターは、第 III表に示されている。
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複合抗血清のオプソニン活性： II型 GBS、または III型断片多糖 -破傷風菌類毒素複合物に
対するマウス抗血清のオプソニン活性は、ヒトの前骨髄細胞由来の白血病 HL-60細胞（ ATC
C寄託番号 CCL 240）を用いた、 in vitroのオプソニン食菌アッセイ法で試験した。簡単に
20
述べると、 200cfuの GBS II型株 18RS21株あるいは III型株 M781を、等量の血清抗体と混合
し、５％二酸化炭素インキュベーター中、３５℃で１５分間振とうしながらインキュベー
ションした。子ウサギの補体と、 90mM DMF存在下で５日間培養した HL-60細胞（ 5x10５）
を混合液に加え、振とうしながら３７℃で１時間インキュベーションした。調製用培養の
ために一部を取り分けた。タイターは、細菌の生存率が５０％であることに対応させて、
抗体希釈系列を外挿することによって決めた。
ｃ． ELISA結合実験：さまざまな破傷風 -類毒素複合物に対する、（ III型または II型 GBS
全細胞で過免疫したウサギから得られた）ウサギ抗 -GBS II型または III型莢膜多糖特異的
抗体の直接的結合は、次のようにして行った：
マイクロタイタープレートを、ウエル当たり、 100μ lの 0.01%チメロサール入り PBSに溶か
30
した、種々のサイズの II型 GBSまたは III型多糖 -破傷風類毒素（ TT）複合物（ 1μ ｇ /ml）
を加えることによって慣らした。このプレートを室温で１時間インキュベーションし、上
述のようにして処理し、 100μ lのウサギ抗血清の PBS-Tによる２倍希釈系列で満たした。
残りの ELISA過程は、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗 -ウサギ IgG（ H&L）二次抗体（カー
クガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ）を加えることを除き、上述と同様である。
種々の破傷風 -類毒素複合物に対する、ウサギ抗 -GBS II型または III型多糖特異的抗体の
結合は、第１図および第２図にそれぞれ示されているように、天然の II型または III型多
糖 -破傷風 -類毒素複合物の結合と比較した、パーセントで表わされている。
実施例４：新生マウスにおける GBS感染に対する抵抗性を与えるための、マウスのメスの
免疫
カールスリバーラボラトリーズ（ Charles River Laboratories）、ウィリントン、 MAの、
６から８週齢のメスの CD-1マウス（ n=3）の腹腔内に、第０日および第２１日目に２回の
複合ワクチン（アルヒドロゲル 1.3%（スーパーフォスバイオセクター a/s、バッチ番号 #20
43）中、 2μ ｇ（マウス当たり 1μ ｇの多糖に相当）の多糖断片（平均分子量約 11,000ダル
トン）、総容量 0.5ml I.P.）の注射を行った。対照マウス（ n=3）は、 2μ ｇの天然 III型 G
BS CPを含むワクチンを与えられた。マウスは２１日目に出産し、（生後３６時間以内の
）子供に対して、致死量の III型 GBS M781細菌（ 6x10５ CFU）を腹腔内に接種した。
第 IV表に示すように、出産前に GBS III型 -TT複合物でメスのマウスをワクチン処理すると
、直後に出産した子供の 94%が抵抗性を持った。
40
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10
参考文献：ローレンス C.（ Lawrence C.）、メードフ（ Madoff）ら、 Infection and Immun
ity, 60: 4989-4994（ 1992）
ロードワルド， A.K.（ Rodwald, A.K.）ら、Ｊ ournal of Infectious Disease, 166: 635639（ 1992）
本発明は特定の態様と関連して説明されたが、前出の記述と照らして、多数の代替法や変
法が当業者に明らかなのは明白である。したがって、本発明は、添付の請求の範囲の精神
と展望の範囲に入る、全ての代替法や変法を含むことを意図している。更に、上述の米国
特許の内容は、本明細書に参考文献として取り入れられている。
【図１】
【図２】
20
(20)
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.
ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 14/33
Ｃ１２Ｐ 21/00
Ｇ０１Ｎ 33/53
(2006.01)
(2006.01)
Ｃ０７Ｋ 14/33
Ｃ１２Ｐ 21/00
Ａ
(2006.01)
Ｇ０１Ｎ 33/53
Ｓ
Ｃ１２Ｒ
(2006.01)
Ｃ１２Ｐ 21/00
Ａ
Ｃ１２Ｒ
1/01
1:01
(74)代理人
弁理士富田博行
(74)代理人
弁理士栗田忠彦
(72)発明者マイコン，フランシス
アメリカ合衆国メリーランド州２０７２３，ローレル，カントリー・メドーズ・レーン９７３５
(72)発明者キャサリン，ドング
アメリカ合衆国ヴァージニア州２２２０７，アーリトン，ノース・サーティフォース・ストリート
４１２６
(72)発明者ジョセフ，ワイ・タイ
アメリカ合衆国ペンシルバニア州１９０３４，フォート・ワシント，シナモン・ドライブ１３７
０
審査官原田隆興
(56)参考文献特表平０６−５０４０６５（ＪＰ，Ａ）
特表平０１−５００５６１（ＪＰ，Ａ）
特表平０６−５０６２３３（ＪＰ，Ａ）
(58)調査した分野(Int.Cl.，ＤＢ名)
C08B 37/00
A61K 39/09
A61K 39/385
A61K 39/395
A61P 31/10
C07K 14/33
C12P 21/00
G01N 33/53
C12R 1/01

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