病気における消化管運動機能を探る島崎ルシア1、岡本理愛2、森北有希菜2、吉村碧海２福井県立武生高校２年、2福井県立藤島高校２年 1 はじめに材料および方法材料および方法発現するKIT分子に対する抗体による免疫染色を行いました。私たちが健康に生きていくために必要不可欠な消化吸収活動は、消化管を腸炎マウス作製：本研究ではトリニトロベン構成する平滑筋細胞の調和のとれた運動により遂行されます。消化管運動はゼンスルホン酸（TNBS；右図）直腸投与により切片をPBSにて洗浄し、PBSで希釈したラット抗KIT抗体（800倍希釈）自律神経の働きにより調節されますが、近年の研究から、カハール介在細胞腸炎を作製しました。TNBSは、実験動物の大腸で4℃、一晩反応させました。PBSにて洗浄後、組織をAlexa Fluor-488 （Interstitial cells of Cajal; ICC）が消化管運動に重要な役割を担うこと内に投与することにより炎症性腸疾患の一つでが分かってきました。ICCは消化管平滑筋層に分布する細胞で、消化管運動を調あるクローン病様の大腸炎を引き起こすことが節する役割を果たしています。また、ICCはKIT分子を特異的に発現し、抗KIT抗知られています。７週齢雄BALB/cマウスを材料に、エーテル麻酔下にカテーテ剤で封入し、Leica TCS SP2共焦点顕微鏡にて観察、撮影を行いました。体を用いた免疫染色によって観察することができます（下図）。ルを肛門から4cm近位部に挿入し、100μlの50%エタノール＋50%生理食塩水に溶コントロールとしては、TNBSを除いたvehicle投与マウスを用いました。解したTNBS 2mgを注入しました（下図）。画像解析はKIT＋α-SMA二重染色画像ファイルを用い、免疫反応陽性部標識抗ラットIgG抗体（1000倍希釈）、Cy3標識抗α-平滑筋アクチン 2,4,6 トリニトロベンゼンスルホン酸（SMA）抗体（1000倍希釈）、DAPI混合液で室温、2時間反応させ、封入位の面積と、α-SMA陽性の筋層の面積を総面積としたときのKIT陽性面積 KIT + PGP 9.5 の面積率を画像解析ソフトウェア（MAC SCOPE）にて解析し、結果についてマイクロソフトエクセルを用いて統計処理しました。なお解析には肛門から4cmの部位を中心に1cmの長さの範囲で無作為に取得した免疫染色像をマウスへのTNBS注入用いました。標本数は２日目・７日目ともコントロール、TNBS各三匹ずつで、視野としては2日目がコントロール・TNBS腸炎マウスともに各20視野、左図：ヒト腹部における消化器の全体像。中図：結腸の層構造を示す模式図 TNBS投与後1日～7日の各日、マウスをエーテル深麻酔下に頚椎脱臼により安右図：筋層全載伸展標本によるカハール介在細胞（緑）と消化管神経（赤）の免疫染色像（モルモット小腸）楽死させ、開腹して大腸全長を摘出しました。4℃に冷やした0.01 Mリン酸緩衝腸炎は消化管粘膜に炎症が生じた状態ですが、病気が進行すると炎症は筋層におよび、運動機能障害が生じ、実際に多くの人が腸炎（特に大腸の炎症）を患っています。運動機能障害の原因はまだよく分かっていませんが、最近の研究からICCの減少が報告されています。炎症によりICCが減少することにより調節機構が破綻し、消化管運動が損なわれることを示唆していますが、そのメカニズムは現在不明です。私たちは、腸炎疾患におけるICCの障害－回復メカニズムの解明のため、マウスで腸炎モデルを作製し、炎症期および回復期におけるICCの分布を調べ、さらに回復過程における筋層での細胞増殖とICCの関係について検討しました。 7日目がコントロール25視野、TNBS投与群26視野です。生理食塩水（PBS）中で投与部位の結腸を切り出し、シリコン底シャーレに中等腸炎回復過程における筋層内の増殖細胞染色：TNBS投与後1日目～7日度に伸展してピンで留め、0.1M リン酸緩衝液にて緩衝した4%パラフォルムアル目の各日の切片を用い、筋層内で細胞増殖期にある細胞を増殖マーカーデヒド固定液で4℃、2時間固定を行いました。冷PBSで十分に洗浄後、組織をであるKi67に対する抗体で標識し、さらに抗KIT抗体と二重染色すること 30%ショ糖加PBSに4℃、一晩漬けた後、凍結包埋剤（OCTコンパウンド）に包埋により、増殖細胞がICCに一致するか検討しました。なおコントロールとして-80℃のディープフリーザー中で凍結させました。クライオスタットを用いしては、同週齢の未処置マウスを用いました。て厚さ10μmの凍結切片を作成し、スライドグラス上に貼り付けて30分風乾し、切片をPBSにて洗浄し、PBSで希釈したウサギ抗Ki67抗体（500倍希釈）以下の実験に用いました。とラット抗KIT抗体（800倍希釈）混合液で4℃、一晩反応させました。炎症時および回復期のICC分布比較：TNBS投与後2日目（炎症時）および7日目（回復期）の切片を用い、一般組織染色（HE染色）により炎症の有無を調べました。次いで、両時期におけるICCの分布を調べるため、同細胞に特異的に PBSで洗浄後、組織をAlexa Fluor-488標識抗ウサギIgG抗体、Alexa Fluor-555標識抗ラットIgG抗体、DAPI混合液（いずれも1000倍希釈）で室温、2時間反応させ、上述の通り封入、観察、撮影を行いました。結果と考察実験１：炎症時および回復期のICC分布比較 Vehicle TNBS 2Day 7Day 図３．TNBS投与後2日目および7日目の筋層におけるKIT 免疫反応陽性部位の面積率比較図１．薬剤注入後の結腸の変化実験２：腸炎回復過程における筋層内の増殖細胞染色 Muは粘膜、SMは粘膜下層、Mは筋層を示す。ヘマトキシリン・エオシン染色。まずHE染色で組織像を調べたところ、TNBS投与2日目では、 vehicle投与群に比べてTNBS腸炎群では粘膜が損傷し、粘膜下層は拡張しており、粘膜固有層および粘膜下層には多数の球形の細胞の浸潤が認められました。TNBS投与7日目ではこれらの症状は軽微で、vehicle投与群に似た組織像を示しました（図１）。このことから、TNBS投与2日目では腸炎が起こっており、7日目では回復す図４．コントロール組織における KIT（赤）と Ki67（緑）の二重免疫染色像図５．TNBS投与１～７日目における KIT（赤）と Ki67 （緑）の二重免疫染色像。ることが分かりました。左は核染色有り、右は核染色無しの像を示す。左の列は核染色有り、右列は核染色無しの像を示す。d～f中の矢印は、矢印は粘膜におけるKi67陽性の核を示す。 KIT陽性細胞の核におけるKi67発現を示す。 Vehicle TNBS 2Day コントロール：コントロール群では、細胞増殖を示すKi67陽性細胞ル群と近いレベルにまで回復していることが確認されましたはおもに粘膜基底部に限局していました（図４）。これらは、上皮（図５g）。また、今回の観察では、TNBS７日目では筋層内に細胞の増殖を示すものであると考えられました。 Ki67陽性反応はほとんど観察されませんでした。一方、筋層内にはKi67陽性細胞は全く認められませんでした。この 7Day まとめことから、筋層内に分布するKIT陽性細胞であるICCは、正常の状態では増殖休止期にあることが示されました。図２．カハール介在細胞の変化（KIT免疫染色） TNBS投与１日目：TNBS投与１日目の筋層においては、コントロール KIT：緑　α平滑筋アクチン：赤　DAPI：青群と比較してKIT発現の減少が観察されました（図５a）。一方、 Ki67陽性反応は筋層内にはほとんど観察されませんでした。次にKIT免疫染色により、両時期の筋層におけるICCの分布を形態学的に調べたところ、TNBS投与2日群では、vehicle投与群に比べてKIT発現細胞が顕著に減少し、TNBS投与7日目ではそれが回復する傾向が明らかとなりました（図２）。 TNBS投与２－３日目：この時期においては、筋層内のKIT発現細胞 50 μm は減少したままでした（図５b-c）。また、筋層内にはKi67陽性反群に対し、TNBS投与群で有意に減少していました。一方TNBS投与 7日目ではvehicle投与群とTNBS投与群の間に有意な差はありませんでした。またTNBS投与2日目と7日目の比較では有意差が認められました（図３）。以上の結果から、炎症の起こったTNBS投与2日目ではICCが減少し、炎症の回復期にあたるTNBS投与7日目ではICC も回復することが示されました。け減少し、その後ICCが回復することが明らかとなりました。 ICCの回復する過程では、ICCの増殖が起こっていることが示され、ICCの回復の少なくとも一部は細胞増殖によることが示唆されました。・ICCが回復することは消化管運動の正常化に必要と考えられ応が出現しましたが、これは主に漿膜下に認められ、KIT発現細胞ます。今後さらに多くの動物でICC回復を観察するとともにとは一致しませんでした。消化管運動がどのように回復するか観察したいと考えます。 TNBS投与４－６日：この時期において（図５d-f）、筋層におけるまたICC以外の細胞も増殖していることを観察していので、 KIT発現が徐々に回復する様子が観察されました。さらにこの時期それら細胞の種類も明らかにしたいと考えます。では、筋層内にKi67陽性反応が観察され、その一部にはKIT陽性細・腸運動の障害は腸内環境の悪化をきたし、粘膜での炎症はさ胞に相当する像が確認できました。詳細に観察すると、輪走筋最内らに悪化することから、腸運動機能の改善は腸炎疾患の治療層のKIT発現が早期に回復し、筋層間や各筋層内のKIT発現の回復はに重要であると考えられます。今回は動物実験を行いました遅れる傾向が見られました。が、今後機会があれば人の病気でも観察したいと思います。免疫染色像を画像解析ソフトを用いて調べたところ、筋層全体に対するKIT発現部位の面積率は、薬剤投与2日目ではvehicle投与・本研究により、粘膜から広がった炎症によりICCは障害を受 TNBS投与７日目：TNBS投与７日目では筋層内のKIT発現がコントロー